來自天然存在的海洋微藻群和露天鹽磐中培養的海洋微藻的可用於發動機的脂肪酸甲酯...的製作方法

2023-12-12 03:01:57 2

來自天然存在的海洋微藻群和露天鹽磐中培養的海洋微藻的可用於發動機的脂肪酸甲酯 ...的製作方法
【專利摘要】本發明教導了獲得的說明書和使用天然存在的海洋微藻群以及以成本有效的方式培養在曬製鹽磐中的海洋微藻製備可用於發動機的海洋微藻脂肪酸甲酯(生物柴油)的方法。副產物流的效用增加了本發明的吸引力。
【專利說明】來自天然存在的海洋微藻群和露天鹽磐中培養的海洋微藻的可用於發動機的脂肪酸甲酯(生物柴油)以及副產物的價值附加
發明領域
[0001]本發明涉及使用收集自印度西海岸的天然存在的含有脂質的微藻群用於生產脂肪酸甲酯(FAME)並且證明了後者用於普通運輸工具(vehicle)行駛的適用性。本發明還涉及在曬製鹽磐中培養可容易收穫的含有脂質的微藻生物質(培養自小球藻(Chlorellavariabilis)登錄號PTA-12198)及其向同樣可用於發動機的FAME的進一步轉化。
[0002]發明背景
[0003]可以參考DaemonFairless 的文章，Biofuel:The little shrub that could-maybe (生物柴油:小灌木能夠-可以是).Nature (2007) 449，652-655，和 Laurent Lardon 等的文章，Life-Cycle Assessment of Biodiesel Production from Microalgae (從微藻生產生物柴油的生活周期評估)，Environmental Science & Technology (2009)43:17，6475-6481，其中突出了食物相對於燃料的複雜問題並且強調了對這樣的不影響食品生產的生物質源的需求。
[0004]同樣就以下內容可以參考D.H.Lee,Algal biodiesel economy and competitionamong bio-fuels (海藻生物柴油經濟和生物燃料之間的競爭)，BioresourceTechnology(2011) 102，43-49:耕地缺乏以及對生產可用於燃料生產的生物質的備選地點的需求，其中微藻培養不需要大面積的耕地。此外，培養地點可以在沙漠地區或在淺海沿海水域中。
[0005]可以參考Ghosh等美國專利7666234，其中，公開了利用邊際地來生產可用於發動機的生物柴油。所述生物質是陸地來源的。
[0006]可以參考題為「Biodiesel production by simultaneous extractionand conversion of total lipids from microalgae, cyanobacteria, and wildmixed-cultures (通過同時萃取和轉化來自微藻、藍細菌和野生混合培養物的總脂質來生產生物柴油)」的文章(B.D.Wahlen 等 Bioresource Technol.,2011,102，2724-2730)。
[0007]可以參考Doan等的文章，Screening of marine microalgae for biodieselfeedstock(篩選用於生物柴油給料的海洋微藻)，Biomass and Bioenergy (2011) 35:7 ;2534_2544，和 Matsunaga 等的文章，Characterization of marine microalga,Scenedesmus sp.strain JPCC GA0024 toward biofuel production(海洋微藻柵藻屬物種菌株JPCC GA0024向生物燃料生產的表徵).Biotechnology Letters (2009) 31:1367-1372，其中據報導，海洋微藻物種含有可以充當生物柴油來源的脂質。
[0008]可以參考美國專利7977076 ；Nasrin Moazami 等，Biomass and lipidproductivities of marine microalgae isolated from the Persian Gulf and theQeshm Island (分離自波斯灣和Qeshm島的海洋微藻的生物質和脂質生產率)。
[0009]也可以參考Brennan 等的文章，Biofuels from microalgae:A review oftechnologies for production， processing， and extractions of biofuels andC0-piOdUCtS(來自微藻的生物燃料:用於生產、加工和萃取生物燃料和副產物的技術的綜述).Renewable and Sustainable Energy Reviews (2010) 14:557_577，該文章陳述了，通常培養微藻以獲得小體積高價值的產品，這需要有限的土地面積或者可以在室內在光-生物反應器中培育生物質的場所。
[0010] 可以參考Hankamer 等的文章，Photosynthetic biomass and H2 productionby green algae:from bioengineering to bioreactor scale-up (通過綠藻生產光合生物質和H2:從生物工程改造到生物反應器放大)Physiologia Plantarum(2007) 131:10-21，和 Wang 等的文章，CO2 bio-mitigation using microalgae (使用微藻的 CO2 生物緩解).Applied Microbiology and Biotechnology (2008) 79:5 ;707_718 ;其中強調了微藻生物質的光合生產對生物柴油生產的重要性。
[0011]可以參考Douskova 等的文章，Simultaneous flue gas bioremediation andreduction of microalgal biomass production costs (同時獲得廢氣生物整治和微藻生物質生產成本的降低)，Applied Microbiology & Biotechnology (2009)，82:179-185，其中宣稱，可以通過使用廢氣作為CO2的豐富來源來提高微藻的生物質生產率。
[0012]可以參考任意數目的文章，如Griffiths 等，Lipid productivity as a keycharacteristic for choosing algal species for biodiesel production (月旨質生產率作為選擇用於生物柴油生產的海藻物種的重要特徵).Journal of Applied Phycology2009,21:493-507,以及 Tom Bruton 等為 Sustainable Energy Ireland 準備的報告，AReview of the Potential of Marine Algae as a Source of Biofuel in Ireland (海藻作為愛爾蘭的生物燃料來源的潛力的綜述)(2009)，該報告提及了海洋微藻作為生物柴油來源的重要性，但是沒有公開在與大規模生物柴油生產相關的規模上這樣的培養在哪裡進行或其將如何進行。
[0013]可以參考Pittman 等的綜述，The potential of sustainable algal biofuelproduction using wastewater resources (使用廢水資源的可持續藻類生物燃料生產的潛力)，Bioresource Technology (2011) 102，17-25。然而，其中沒有提及其在生物柴油生產中的效用，此外，來自農業廢物的混合培養物中的微孢藻屬物種(Microspora sp.)未被確定或未用於脂質。
[0014]可以參考Syed Zahir Shah & Habib-ur-Rehman Khattak 的工作(SomeGreen Algae from Paddy Fields of Mathra(District Peshawar)(來自 Mathra 的稻田(Peshawar 地區)的一些綠藻)，Syed Zahir Shah & Habib-ur-Rehman Khattak，Department of Botany, Islamia College，Peshawar)，作為關於生物多樣性的研究的一部分，其公開了在信德河(Sind River)附近存在微孢藻屬物種(Microspora sp.)。其中沒有提及生物質的任何效用。
[0015]可以參考題為Cell division and wall structure in Microspora(微抱藻中的細胞分裂和細胞壁結構)的文章(Picketts-Heaps.New Phytologist, (1973)72，347-355)，其中討論了微孢藻屬物種(Microspora sp.)的細胞學。其中記述了，這樣的藻類可以以藻群的形式存在。其還記述了所述藻類可能含有或可能不含有脂質。沒有提及利用這樣的藻群用於生物柴油製備的任何嘗試。
[0016]可以參考Mata 等的文章，Microalgae for biodiesel production and otherapplications:A review(微藻用於生物柴油生產和其他應用:綜述).Renewable andSustainable Energy Reviews (2010) 14:217-232 ;該文章列舉了含有脂質(並且，在這個意義上，具有作為生物柴油的來源的潛在重要性)的多個海洋微藻物種。
[0017]還可以參考Greenwell 等的文章，placing microalgae on the biofuelspriority list:a review of the technological challenges (將微藻放入生物燃料優先名單:技術挑戰的綜述).Journal of the royal society interface (2010), 7:703-726,該文章公開了，不同的微藻以不同速率生長並且雖然一些具有高的油含量，但是它們由於其他原因如緩慢的生長速率、難以收穫生物質等而不能實際利用。
[0018]可以參考US2009 / 0298159A1，其中提供了一種由藻類製備生物柴油的方法，所述方法利用用於生物柴油生產的小球藻(Chlorella variabilis)的兩階段(自養和異養)生長期，所述方法包括以下一系列步驟:培養光合自養藻類，濃縮細胞然後將它們轉移到發酵罐中用於異養培養。在異養培養階段期間加入有機碳。顯然，該方法在密閉系統中進行並且需要濃縮細胞，這極大的消耗能源。此外，沒有提及生物柴油的特性也沒有提及在車輛上進行的任何試驗。
[0019]可以參考網址為 WWW.treehugger.com / chevron-backs-solazyme-to-develop-algal-biodiesel-tech nology.html,題為 「Chevron Backs Solazyme to Develop AlgalBiodiesel Technology」，日期為2008年2月2日的文章，其中Solazyme由糖源通過在暗處發酵生產生物柴油。
[0020]從現有技術顯然的是，還沒有公開具有成本效益的用於由這樣的獲得自天然存在的微藻群的培養的或收穫的生物質生產脂肪酸甲酯的方法。本發明嘗試克服所有這些基本限制並嘗試發展新的、簡化的並且具有成本效益的用於由微藻群生產脂肪酸甲酯以及由廢物副產物流(waste co-stream)生產具有附加價值的副產物的方法。隨著每次後續收集，發現所述地點處的水的總碳減少。這可以歸因於從相同地點的頻繁收集。
[0021]可以參考Ghosh等的專利申請PCT / IN2010 / 000192，該申請公開了小球藻屬(Chlorella)海洋微藻物種的培養和兼氧生長的優勢。其中沒有提及由生物質製備生物柴油也沒有提及其大規模的實際培養以使所述生物質被視為大體積、可負擔得起的給料。
[0022]可以參考Greenwell等的文章，placing microalgae on the biofuels prioritylist:a review of the technological challenges (將微藻放入生物燃料優先名單:技術挑戰的綜述).Journal of the royal society interface (2010), 7:703-726,以及Chisti, Y等的文章！Biotechnology Advances (2003),所述文章顯示了微藻生物質下遊加工的困難以及作為結果的高的能量損失。其中最重要的是難以從高度稀釋的懸浮液收穫生物質。
[0023]可以參考文章 http: / / www.treehugger.com / renewab I e-energy /chevron-backs-solazyme-to-dev elop-algal-biodiesel-technology.html 和http: / / www.treehugger.com / cars / solazyme-blOO-algae-biodiesel-goes-on-the-ro ad.html，所述文章公開了車輛依靠BlOO微藻生物柴油行駛。然而，所述文章指出，在異養條件下使用糖類作為有機碳源培養生物質。
[0024]沒有關於獲得自天然存在的海洋微藻群或在實際自養生長條件下在曬製鹽磐中產生的耐熱海洋微藻生物質的任何生物柴油的性能的報導。[0025]在沿西海岸尋找潛在微藻的過程中，我們的團隊通過在Google earth軟體中觀察到的圖像發現少數地點，這些地點顯示獲得一些所需微藻的可能性。我們發現的地點之一位於經度70 □ 54.959' E和緯度20 □ 42.391N(地點I)，另一個地點位於經度68 □ 59.876』和緯度22 □ 23.975'(地點2)，印度，其顯示密集的微藻群。對所述藻群的顯微鏡檢查(形態學)揭示了所述藻群含有多種藻類物種，其中發現微孢藻屬物種(Microspora sp.)是佔優勢的。現有的由藻類生產生物柴油的方法是非常耗能的。因此，已經進行嘗試去開發具有成本效益的方法用以由海洋微藻製備生物柴油。
[0026]可以參考Bligh, E.G., Dyer, ff.J., A rapid method for total lipidextraction and purification (用於總脂質萃取和純化的快速方法)，Canadian Journalof Biochemistry and Physiology(1959).37,911-917。Lee 等 Comparison of severalmethods for effective lipid extraction from microalgae (從微藻有效萃取月旨質的若干方法的比較)，Bioresource TechnologylOl (2010) S75-S7,所述從海洋微藻生物質萃取脂質的方法典型地需要利用極性溶劑進行萃取並且除了甘油三酯以外還產生大量的磷脂，磷脂是生物柴油生產所不需要的。
[0027]發明目的
[0028]本發明的主要目的是利用天然存在的海洋微藻聚生體的藻群和曬製鹽磐中培養的自沉積的海洋微藻作為可用於發動機的脂肪酸甲酯(生物柴油)的來源。
[0029]另一個目的是鑑定剛毛藻屬物種(Cladophora sp.) (ATCC登錄號PTA-12199)和微孢藻屬物種(Microspora sp.) (ATCC存活測試在進行中)作為上述海洋微藻聚生體的藻群中的優勢物種。
[0030]另一個目的是在曬製鹽磐中人工培養這樣的漂浮藻群和/或通過施加脅迫條件提聞脂質含量。
[0031]另一個目的是使用分離自印度西海岸的小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登錄號PTA-12198)作為對於在夏季條件下在印度的古吉拉特在曬製鹽磐中培養是理想的自沉積的和耐熱的海洋微藻株。
[0032]另一個目的是使與從生物質分離脂質相關的能量損失最小化。
[0033]另一個目的是使用可容易收穫的生物質作為降低能量損失的手段。
[0034]另一個目的是創造可能以利用現有的用於曬製鹽生產的約10萬英畝過剩土地大規模培養海洋微藻生物質。
[0035]另一個目的是通過使用海水、廉價的無機營養物並且避免用於攪拌培養基的機械配件來最小化培養的投入成本，同時在夏季的幾個月期間仍然實現最大的日生長速率45g(幹基)/ m2 / 天。
[0036]另一個目的是利用曬製鹽生產中遵循的基本準則如重力進料和液體的磐間轉移。
[0037]另一個目的是曬乾收穫的生物質。
[0038]另一個目的是使用揮發性非極性溶劑如己烷從曬乾的生物質萃取脂質以使非所需的脂質在總的萃取的脂質質量中的比例最小化。
[0039]另一個目的是任選地利用化石柴油用於其中使用混合生物柴油的萃取過程。
[0040]另一個目的是利用太陽熱能用於萃取和脂質分離過程以使能量輸出:輸入比最大化。[0041 ] 另一個目的是從用過的生物質獲得最大價值。
[0042]另一個目的是通過簡單的和具有成本效益的方式精製原料油。
[0043]其後，另一個目的是利用已知的FAME生產方法，如在美國專利7666234中公開的。
[0044]另一個目的是證明具有基本參數如粘度、游離脂肪酸含量、氧化穩定性、游離和總甘油、磷含量、水分含量等的所需規範的海洋微藻FAME的生產。
[0045]另一個目的是證明利用製備自海洋微藻群的B20生物柴油和製備自小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登錄號PTA-12198)的BlOO生物柴油的標準運輸工具的行駛。
[0046]另一個目的是利用副產物粗甘油流用於培養的微藻的加速生長和更高的脂質含量，如在現有技術中公開的那樣。
[0047]發明概述
[0048]本發明提供用作生物柴油的脂肪酸甲酯(FAME)，所述酯製備自天然漂浮的海洋微藻群或在曬製鹽磐中培養期間形成的沉降的海洋微藻的厚層或其混合物。
[0049]在本發明的一個實施方案中公開了脂肪酸甲酯(FAME) 1，其中用於生產生物柴油的藻群包含作為優勢株的含有脂質的微孢藻屬物種(Microspora sp.)(等待ATCC登錄號)或剛毛藻屬物種(Cladophora sp.) (ATCC登錄號PTA12199)和曬製鹽磐中培養的海洋微藻的厚層，所述厚層包含耐熱的小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登錄號PTA12198)。
[0050]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中所述脂質通過利用己烷的萃取從包含微孢藻屬物種(Microspora sp.)(等待ATCC登錄號)的海洋微藻群萃取，如通過GC-MS分析，所述脂質具有的組成為:0.6%的14:0脂肪酸，9.4%的16:0脂肪酸，0.7%的16:1脂肪酸，3.7%的18:0脂肪酸，33.2%的18:1脂肪酸，50.4%的18:2脂肪酸，0.7%的20:0脂肪酸，1.3%的22:0脂肪酸。
[0051]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中脂質通過利用己烷的萃取從來自小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登錄號PTA12198)的海洋微藻萃取，如通過GC-MS分析，所述脂質具有的組成為:0.4%的14:0脂肪酸，12.1%的16:0脂肪酸，1.0%的16:1，1.0% 的 16:2 脂肪酸，4.2% 的 18:0 脂肪酸，29.4% 的 18:1，45.7% 的 18:2 脂肪酸，4.8%的18:3脂肪酸，1.4%的22:0。
[0052]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中所述脂質通過利用己烷的萃取從包含剛毛藻屬物種(Cladophora sp.) (ATCC登錄號PTA12199)的海洋微藻群萃取，如通過GC-MS分析，所述脂質具有的組成為:0.9%的14:0脂肪酸，0.4%的15:0脂肪酸，21.5%的16:0脂肪酸，1%的16:1脂肪酸，2.9%的18:0脂肪酸，21.2%的18:1脂肪酸，22.3%的18:2脂肪酸，0.5%的20:0脂肪酸，16.3%的20:1脂肪酸，0.4%的22:0脂肪酸，11.4%的22:1脂肪酸，0.7%的24:0脂肪酸，0.6%的24:1脂肪酸。
[0053]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME,其中對獲得自微孢藻屬物種(Microspora sp.)的脂質級分進行精製和酯基轉移從而獲得這樣的FAME,如通過GC-MS分析，所述FAME具有包含以下各項的組成:9.92%的16:0脂肪酸，2.44%的18:0脂肪酸，28.27%的18:1脂肪酸，59.37%的18:2脂肪酸，和5_30ppm的BHT抗氧化劑。
[0054]在本發明的另一個實施方案中公開了來自微孢藻屬物種(Microspora sp.)的FAME，其是清澈的黃色液體，具有0.872gm / ml密度，4.5cSt (在40°C )粘度，0.1014%總甘油和0.0086%游離甘油。
[0055]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其作為B20混合物用於滿載狀態下的普通未改造的柴油運輸工具(vehicle)並且符合排放要求。
[0056]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中對獲得自小球藻(Chlorellavariabilis) (ATCC登錄號PTA12198)的脂質級分進行精製和酯基轉移從而獲得這樣的FAME，如通過GC-MS分析，所述FAME具有包含以下各項的組成:6.9%的16:0脂肪酸，3.1%的18:0脂肪酸;32.6%的18:1脂肪酸，和57.3%的18:2脂肪酸，以及5_30ppm的BHT抗氧化劑。
[0057]在本發明的另一個實施方案中公開了來自小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登錄號PTA12198)的FAME，其是清澈的芥黃色液體，在25°C和40°C的密度分別為0.8704和
0.8591g / cm3 ;在40°C的粘度為4.8cST ;總甘油，0.15% ;游離甘油，0.02% ;CFPP，水分含量，0029% ；-5°C ;磷，5.1ppm ;氧化穩定性，0.43年(25°C )和0.12年(40°C )，並且通過標準量熱試驗測量的熱值為9842kcal / kg。
[0058]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其作為BlOO生物柴油用於滿載狀態下的權利要求8的相同的未改造的柴油運輸工具並且符合排放要求。
[0059]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中在七月-十二月期間從70° 54.959' Ε，20° 42.391N收穫在微孢藻屬物種(Microspora sp.)中佔優勢的海洋微藻群。
[0060]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME,其中在自養條件下,在一月-六月期間，在位於72° 07.316』E21° 47.488V N ;海拔，28英尺的鹽磐中培養小球藻(Chlorellavariabilis) (ATCC 登錄號 PTA12198)。
[0061]在本發明的另一個實施方案中公開了FAME，其中曬製鹽磐中的小球藻(Chlorellavariabilis) (ATCC 登錄號 PTA12198)的生長速率為 11.67-45.56g/m2/ 天。
[0062]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME,其中微孢藻屬物種(Microspora sp.)的藻群的利用己烷萃取的脂質產率為5.22-16.32%。
[0063]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中培養的小球藻(Chlorellavariabilis) (ATCC登錄號PTA12198)的利用己烷萃取的脂質產率為11.11-11.21%。
[0064]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中通過每1000L海水培養基加入3-6kg的碳酸氫鈉，l_2kg硝酸鈉和0.01-0.02kg硫酸亞鐵來影響小球藻(Chlorellavariabilis)的生長速率和脂質產率。
[0065]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中任選地加入所述FAME方法的粗甘油副產物流以使生物質生產率提高50-200%。
[0066]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中發現在開放培養中，在除夏季以外的時期期間，太陽反射器提高小球藻(Chlorella variabilis)的生長速率和脂質生產率。
[0067]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中將溶劑萃取脂質後的殘留生物質用於生產生物肥料、水產飼料、類胡蘿蔔素源和能量源。
[0068]在本發明的另一個實施方案中公開了 FAME，其中粗甘油的副產物流被用於通過兼氧生長的海藻生產率和/或用於生物可降解的生物聚合物。[0069]本發明的另一個方面提供由天然收穫的具有微孢藻和剛毛藻ATCC登錄號PTA-12199的聚生體的飄浮藻群和培養的微藻群以及大量培植的選擇的微藻的耐熱株(小球藻(Chlorella variabilis)ATCC登錄號PTA-12198)製備可用於發動機的脂肪酸甲酯(生物柴油)以及利用來自微藻物質的副產物以及來自脂肪酸甲酯的副產物的綜合方法，並且所述方法包括以下步驟:
[0070]a)從不同地點收集微藻群聚生體並且洗滌以除去粘附的砂子和泥土顆粒ii)鑑定所述藻群中存在的微藻物種並且在實驗室條件下使用海水和CSMCRI ExperimentalSalt Farm(實驗鹽場)(ESF)海鹽(5°Be0)培養所述藻群並在箱中模仿自然條件來以進一步增殖。
[0071]b)從所述藻群分離含油的微藻物種(微孢藻、根枝藻屬(Rhizoclonium)、螺旋藻屬(Spirulina)、小球藻、剛毛藻、娃藻綱(Diatoms)、顫藻屬(Oscillatoria spp.)等)。
[0072]c)在戶外在實驗鹽場中在18m2和90m2的箱中大量培養含油的微藻物種，生物質的自沉積有助於容易的收穫，並且回收作為營養物的上清液用於下一批次的接種。
[0073]d)乾燥所述微藻群，之後將乾燥的微藻群研磨成細粉。
[0074]e)從生物質有效萃取油，包括使用球磨機/蒸汽預處理生物質，之後進行非極性溶劑萃取/ Soxhlet等，並且回收所述溶劑。
[0075]f)精製原料油。
[0076]g)遵循已知的酯基轉移方法以製備可用於發動機的生物柴油，如在現有技術中那樣。
[0077]h)使用生物柴油副產物流提高通過兼氧生長的海藻生產率，如在現有技術中公開的(專利申請PCT / IN2011 / 000655)和/或用於生產其他有用的材料如生物可降解的生物聚合物(WIP0專利申請WO / 2011 / 027353)。
[0078]i)利用用過的生物質和在生物柴油的合成期間產生的廢水用於生物氣生產。
[0079]j)利用用過的生物質作為水產飼料(aqua-feed)和作為生物肥料。
[0080]k)利用殘留生物質和去油的餅用於製備煤餅。
[0081]I)從去油的殘留生物質提取類胡蘿蔔素。
[0082]m)配製適於使滿載的且沒有任何發動機改造的車輛(Chevrolet Tavera)行駛的混合物B20和B100。
[0083]在本發明的一個實施方案中公開了製備用作生物柴油的可用於發動機的脂肪酸甲酯的方法，所述方法包括以下步驟:
[0084](i)收集具有微孢藻屬物種(Microspora sp.)和剛毛藻屬物種(Cladophorasp.)的聚生體的天然存在的微藻群和培養的小球藻(Chlorella variabilis)以獲得海藻生物質；
[0085](ii)曬乾生物質至殘留水分水平為5-10% ；
[0086](iii)通過蒸汽鼓風或滲透性衝擊預處理步驟(ii)的生物質以破壞細胞壁；
[0087](iv)使用己烷作為溶劑或任選地利用其中燃料要以混合物形式使用的柴油機從步驟(iii)的海藻生物質萃取脂質從而獲得原料油；
[0088](V)除去己烷並且用硅藻土處理所得的原料油或任選地直接用硅藻土處理步驟
(ii)的萃取物以去除磷脂、色素和其他雜質；[0089](vi)過濾以除去懸浮的固體並且如果需要，進一步處理步驟(V)的油萃取物以降低游離脂肪酸(FFA)含量以獲得精製油；
[0090](vii)對步驟(vi)的精製油進行鹼催化的酯基轉移，分離FAME，並且對其進行進一步純化以獲得可用於發動機的FAME。
[0091]在本發明的另一個實施方案中公開了生產FAME的方法,其中獲得自微孢藻屬物種(Microspora sp.)的FAME具有如通過GC-MS分析的包含以下各項的組成:9.92%的16:0脂肪酸，2.44%的18:0脂肪酸，28.27%的18:1脂肪酸，59.37%的18:2脂肪酸，和5-30ppm的BHT抗氧化劑。
[0092]在本發明的另一個實施方案中公開了一種方法，其中獲得自小球藻(Chlorellavariabilis)的FAME具有如通過GC-MS分析的包含以下各項的組成:6.9%的16:0脂肪酸，3.1%的18:0脂肪酸;32.6%的18:1脂肪酸，和57.3% ^ 18:2脂肪酸，以及5_30ppm的BHT抗氧化劑。
[0093]在本發明的一個實施方案中，本發明提供從天然的和培養的微藻群以及大量培養的選擇的微藻株製備可用於發動機的脂肪酸甲酯(生物柴油)以及利用來自微藻物質的副產物和來自脂肪酸甲酯的副產物的綜合方法。
[0094]在本發明的另一個實施方案中，微藻群是不同微藻物種的聚生體，其中微孢藻和剛毛藻屬物種ATCC登錄號PTA-12199是優勢物種。
[0095]在本發明的另一個實施方案中，將具有必需微量營養物/ CSMCR1-ESF鹽的海水用於微藻的戶外大量 培養。
[0096]在本發明的其他實施方案中，使用選自由以下各項組成的組的溶劑進行油萃取:己烷，氯仿，甲醇，丙酮，四氫呋喃，二乙醚；優選地，己烷，氯仿和甲醇。
[0097]在本發明的另一個實施方案中，將生物柴油副產物流用於生產PHA-生物聚合物，生物氣，氣化，肥料，水產飼料，類胡蘿蔔素，並用於生產煤餅。
[0098]發明簡述
[0099]通過在Google Earth軟體中觀察到的圖像選擇顯示獲得一些所需微藻的可能性的一些地點。所述地點之一位於經度70° 54.959' E和緯度20° 42.391N(地點I)，另一個地點位於經度68° 59.876』和緯度22° 23.975'(地點2)，印度。其顯示密集的漂浮微藻群。對所述藻群進行的顯微鏡檢查(形態學)揭示，所述藻群含有多種微藻物種，其中發現微孢藻屬物種(Microspora sp.)和剛毛藻屬物種(Cladophora sp.)ATCC登錄號PTA-12199是佔優勢的。現有的由藻類生產生物柴油的方法消耗大量能量。因此，已經進行嘗試去開發具有成本效益的方法用以由海洋微藻群中的聚生體以及分離的和大量培養的小球藻(Chlorella variabilis)株ATCC登錄號PTA-12198製備生物柴油。
[0100]利用一種綜合方法將含有微孢藻屬和剛毛藻屬物種ATCC登錄號PTA-12199 (分別在地點I和2佔優勢)的微藻群用於生物柴油生產是獨特的。天然藻群廣泛分布並且發現其在被收穫後的數周內再生。除此之外，觀察到其也在其他實驗地點再生。發現具有佔優勢的微孢藻屬和剛毛藻屬物種ATCC登錄號PTA-12199的聚生體的藻群在環境參數的可變範圍內存活並生長。
[0101]本發明的新特徵:
[0102]主要的創造性在於以下:[0103].認識到，微藻的收穫需要大量能量並且在形成含有脂質的漂浮海洋微藻群如具有微孢藻屬物種(Microspora sp.)(等待ATCC登錄號)和剛毛藻屬物種(Cladophora sp.)(PTA12199)作為優勢物種的那些中利用自然的巧妙，所述藻類可以簡單地從水中除去並被
進一步加工。
[0104].認識到，雖然自然界中的某些條件有助於海洋微藻群的自然生長，但是該種自然生長限於某些特定時期如季風后的幾個月，並且在其他月份如夏季的月份期間，其很少出現。在大量工作後進一步認識到，並不總是容易的模擬那些自然條件，並且海洋微藻的其他變種可以更好地適於培養。
[0105].認識到，如果需要培養海洋微藻以補充天然儲存油料和用於全年的收穫，則有用的方法是在季風后的時期以可持續的方式從自然界中收穫，並且之後藉助於在曬製鹽磐中對海洋微藻進行培養，這可以為大規模培養提供理想的機會，假定在印度多至50 %的現有的用於產鹽的土地擱置不用並且這些可以用於生產用途。[0106].鑑定來自印度水域的小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登錄號PTA12198)為耐熱的變種，其在夏季月份期間在自養條件下生長良好，觀察到在最小營養輸入的情況下的最大幹生物質生產率為45g / m2 /天，並且還避免了高耗能的手段如跑道池中採用的連續攪拌。
[0107].還觀察到，在夏季月份期間，在主要為熱天的條件下，所選擇的小球藻屬株生長並且沉積，由此在底部形成厚層，在排去充當後續培養批次的接種物的上清液後，所述厚層可以被容易地收穫。
[0108].認識到，可行的是通過使用安置在鹽磐中的太陽反射器使小球藻甚至在非夏季月份裡也生長，所述太陽反射器增強在鹽磐上入射的輻射並且因此提高溫度和入射光子輻射，兩者對生物質生產率和脂質產率都具有積極作用。
[0109].認識到，脂質具有極性和非極性兩種類型，並且後者是可用於發動機的生物柴油所需要的，並且之後為了所需的脂質級分犧牲高的脂質產率，並且利用非極性溶劑如己烷和柴油代替通常使用的極性溶劑如甲醇/氯仿來萃取生物質。
[0110]?還認識到，雖然將非極性溶劑用於萃取產生更清潔的油級分，但是微藻細胞壁的去除效率較低；因此，提供蒸汽鼓風作為萃取之前的預處理；進一步認識到這樣的方法，如果它們是太陽能驅動的，則將是能效更高的。
[0111].使用簡單方法如在硅藻土上過濾來精製原料油，並且由此使用鹼催化的酯基轉移的常規方法如現有技術中公開的用於生產可用於發動機的脂肪酸甲酯的那些。
[0112].由天然收穫的和培養的海洋微藻生產甲酯，其品質適用於普通柴油運輸工具。
[0113]?使用來自海洋微藻生物柴油生產的副產物甘油流作為營養物來提高在兼養條件下的生物質生產率和脂質含量，如在現有技術中公開的。
[0114].將脂質萃取後的殘留生物質用於各種各樣的應用如肥料、類胡蘿蔔素源、水產飼料、能量源等。
[0115].將生活汙水和NaCl含量低而營養物如鈣、鎂和硫酸鹽含量高的粗海鹽用作用於微藻群和分離的海洋微藻培養物的生長的培養基補充劑。
[0116]實施例1
[0117]藉助於Google Maps?,對沿海水域中的綠斑進行查找，這可以幫助我們識別可能的漂浮微藻群。發現一些明顯的綠斑位於果阿的沿海區域(Madkai ;15° 41.0616』N，73。95.6227，E)，喀拉拉邦(Vellanathuruthu Road ;9。01.6659』N, 76° 52.5022，Ε)，孟加拉邦(Porr Canning, 22° 31.5577，N，88。67.3307，E ； , Dongajora, 22° 13.2696，N,88。60.2676，E ;Haldia refinery，22。04.9408，N，88。07.308，Ε)，第烏(Nagoa 路旁，70 □ 54.959 ; E，20 □ 42.391N)和古吉拉特(0kha，68 □ 59.876』，22 □ 23.975')。對在第烏和古吉拉特識別的地點進行地面實測，並且確實發現綠色的微藻的漂浮藻群。
[0118]實施例2
[0119]收集實施例1的藻群並且在顯微鏡(Carl Zeiss Axio Imager,40x)下觀察以進行分類學鑑定。兩種藻群都顯示其中綠藻(ChlOTophycae)家族佔優勢的微藻的聚生體。收集自70 □ 54.959' E、20 □ 42.391N的藻群具有微孢藻作為優勢形式，而收集自68 □ 59.876』、22 □ 23.975'的藻群以剛毛藻為優勢。聚生體的相關物種的分離通過使用連續稀釋法進行。用蒸餾水洗滌海藻藻群以去除粘附的汙垢和雜質，並且對其進行進一步離心。收集上清，並且接種在具有不同培養基(BG-ll，BBM，Zarrouk』 s，ASN-1II等)的24孔組織培養平板中。使用1:10稀釋度進行連續稀釋。在25°C，將組織培養平板保持在人造光(3001uX)中，12小時光照和黑暗周期。在可見的生長後，將富集的培養物劃線在固體1%瓊脂糖平板上。將培養皿在人造光(3001ux)下溫育，12小時光照和黑暗周期，25°C。將分離的培養物無菌接種到液體培養基中並且保持在人造光(3001ux)中，12小時光照和黑暗周期，25°C。將來自以上兩個地點的藻群凍幹並且送至美國模式菌種保藏中心(AmericanType Culture Collection Centre) (ATCC)以在分配登錄號前進行存活測試。具有剛毛藻作為優勢含脂質株的一個藻群已被給予ATCC登錄號PTA-12199，而另一個具有微孢藻作為優勢含脂質株的藻群的 存活測試在進行中。
[0120]實施例3
[0121]將天然存在的海洋微藻群從在地點經度70° 54.959' E和緯度20° 42.391N佔優勢的微藻中挑出。在3-4周後有規律地視察該地點以研究藻群的再生長。在夏季期間，生物質生產率為22.22g / m2 /天並且總脂質含量為10% ;在季風期間，生物質生產率為
6.03g / m2 /天並且總脂質含量為9.61%，而在冬季，獲得16g / m2 /天的生物質生產率和12.85%的總脂質含量。該實施例教導我們，可行的是以可持續的方式從自然界收穫微藻群。
[0122]實施例4
[0123]在冬季期間(氣溫25_30°C )，在開放式箱中研究提高的太陽輻射對ATCC-小球藻(Chlorella variabilis)的生物質生產率的作用。用小球藻培養物(OD54tlnm=L 65)的10%接種物接種具有1.51m2面積和0.3m深度、盛有200L海水培養基的兩個箱子，在具有反射器的情況下14天後的幹生物質產率為5.03g / 1，而在對照箱中產率為4.07g/l。該實施例教導我們，太陽反射器可以具有對培養過程的有益效果，尤其是在環境溫度低於最佳時。
[0124]實施例5
[0125]小球藻(Chlorella variabilis)ATCC登錄號PTA-12198的大量培養在研究所的實驗鹽磐(21° 47.488; N72° 07.3W E海拔:28英尺)進行。培養在三月-六月期間進行。培養期間的室外溫度為45±3°C。為此目的所需的培養物首先生長在各自具有18m2的面積並首先被用作接種箱的兩個箱子中。通過測量pH、540nm處的OD和生物質產率來對所述箱子進行定期監測。在達到5g / 1(溼基)的細胞濃度後，將培養物用於接種各自具有18m2的面積的7個箱子以及各自具有90m2面積的3個箱子。定期監測pH、540nm處的OD、生物質產率和環境參數。使用在其末端系有細繩的空心管手動對箱子進行攪動(每天三次)達18天。在培養20天後，觀察到，自動沉積的生物質在箱子底部形成厚層。關於生物質生產率的數據在下表中給出。
[0126]
【權利要求】
1.用作生物柴油的脂肪酸甲酯(FAME)，所述酯由天然漂浮的海洋微藻群或在曬製鹽磐中培養期間形成的沉降的海洋微藻的厚層或其混合物製備。
2.根據權利要求1所述的脂肪酸甲酯(FAME)，其中所述FAME由選自由作為優勢株的含有脂質的微孢藻屬物種(Microspora sp.)(等待ATCC登錄號)和剛毛藻屬物種(Cladophora sp.) (ATCC登錄號PTA12199)組成的組的藻群製備，和由培養在曬製鹽磐中的海洋微藻的厚層製備，所述海洋微藻的厚層包含耐熱的小球藻(Chlorella variabilis)(ATCC 登錄號 PTA12198)。
3.根據權利要求1-2所述的FAME，其中所述脂質通過利用己烷萃取從包含微孢藻屬物種(Microspora sp.)(等待ATCC登錄號)的海洋微藻群萃取,如通過GC-MS分析所述脂質的組成為:0.6%的14:0脂肪酸，9.4%的16:0脂肪酸，0.7%的16:1脂肪酸，3.7%的18:O脂肪酸，33.2%的18:1脂肪酸，50.4%的18:2脂肪酸，0.7%的20:0脂肪酸，1.3%的22:O脂肪酸。
4.根據權利要求1-2所述的FAME，其中脂質通過利用己烷萃取從海洋微藻小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC登錄號PTA12198)萃取，如通過GC-MS分析所述脂質的組成為:0.4%的14:0脂肪酸，12.1%的16:0脂肪酸，1.0%的16:1，1.0%的16:2脂肪酸，4.2% 的 18:0 脂肪酸，29.4% 的 18:1，45.7% 的 18:2 脂肪酸，4.8% 的 18:3 脂肪酸，1.4%的 22:0。
5.根據權利要求1或2所述的FAME，其中所述脂質通過利用己烷萃取從包含剛毛藻屬物種(Cladophora sp.) (ATCC登錄號PTA12199)的海洋微藻群萃取，如通過GC-MS分析所述脂質的組成為:0.9%的14:0脂肪酸，0.4%的15:0脂肪酸，21.5%的16:0脂肪酸，1%的16:1脂肪酸，2.9%的18:0脂肪酸，21.2%的18:1脂肪酸，22.3%的18:2脂肪酸，0.5%的20:0脂肪酸，16.3%的20:1脂肪酸，0.4%的22:0脂肪酸，11.4%的22:1脂肪酸，0.7%的24:0脂肪酸，0.6%的24:1脂肪酸。
6.根據權利要求3所述的FAME,其中對獲得自微孢藻屬物種(Microsporasp.)的脂質級分進行精製和酯基轉移從而獲得如通過GC-MS分析具有包含以下的組成的FAME:9.92%的16:0脂肪酸，2.44%的18:0脂肪酸，28.27%的18:1脂肪酸，59.37%的18:2脂肪酸，和5-30ppm的BHT抗氧化劑。
7.根據權利要求6所述的FAME，其中所述FAME為清澈的黃色液體，具有0.872gm / ml密度，4.5cSt (在40°C )粘度，0.1014%總甘油和0.0086%游離甘油，並且如通過標準量熱試驗測量的熱值為9879kcal / kg。
8.根據權利要求6-7所述的FAME，其作為B20混合物用於滿載狀態下的普通未改造的柴油運輸工具並且符合排放要求。
9.根據權利要求4所述的FAME,其中對獲得自小球藻(Chlorellavariabilis) (ATCC登錄號PTA12198)的脂質級分進行精製和酯基轉移從而獲得如通過GC-MS分析具有包含以下的組成的FAME:6.9%的16:0脂肪酸，3.1%的18:0脂肪酸；32.6%的18:1脂肪酸，和57.3%的18:2脂肪酸，以及5-30ppm的BHT抗氧化劑。
10.根據權利要求9所述的FAME，其是清澈的芥黃色液體，在25°C和40°C分別具有.0.8704和0.8591g / cm3的密度；在40°C具有4.8cST的粘度;總甘油，0.15% ;游離甘油，.0.02% ;CFpp，水分含量，0.029%;-5°C;磷，5.1ppm ;氧化穩定性，0.43 年(25°C )和 0.12 年(40°C )，並且如通過標準量熱試驗測量的熱值為9843kcal / kg。
11.根據權利要求9-10所述的FAME，其作為BlOO生物柴油用於滿載狀態下的普通未改造的柴油運輸工具並且符合排放要求。
12.根據權利要求1-3和6-8所述的FAME，其中在七月-十二月期間從70° 54.959' Ε，20° 42.391N收穫在微孢藻屬物種(Microspora sp.)中佔優勢的海洋微藻群。
13.根據權利要求1、2、4和9-11所述的FAME，其中在位於72° 07.316』E21° 47.4888' N的鹽磐中；海拔，28英尺，在自養條件下，在一月-六月期間培養所述小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC 登錄號 PTA12198)。
14.根據權利要求1、2、4、9-11和13所述的FAME，其中曬製鹽磐中的小球藻(Chlorella variabilis) (ATCC 登錄號 PTAl2198)的生長速率為 11.67-45.56g / m2 / 天。
15.根據權利要求1_3、6_8和12所述的FAME,其中對微孢藻屬物種(Microsporasp.)藻群利用己烷萃取的脂質產率為5.22-16.32%。
16.根據權利要求1、2、4、9-11和13-14所述的FAME，其中對培養的小球藻(Chlorellavariabilis) (ATCC登錄號PTA12198)利用己烷萃取的脂質產率為11.11-11.21%。
17.根據權利要求1、2、4、9-11、13-14和16所述的FAME，其中通過每1000L的海水培養基加入3-6kg的碳酸氫鈉，l_2kg硝酸鈉和0.01-0.02kg硫酸亞鐵影響小球藻(Chlorellavariabilis)的生長速率和脂質產率。
18.根據權利要求1、2、4、9-11、13-14和16-17所述的FAME，其中任選加入來自所述FAME過程的副產物流的粗甘油以使生物質生產率增加50-200%。
19.根據權利要求1、2、4、9-11、13-14和16-18所述的FAME，其中太陽反射器提高在除夏季以外的時期期間開放培養中小球藻(Chlorella variabilis)的生長速率和脂質生產率。
20.根據權利要求1-19所述的FAME，其中脂質的溶劑萃取後的殘留生物質被用於生產生物肥料、水產飼料、類胡蘿蔔素源、和能量源。
21.根據權利要求1-19所述的FAME，其中粗甘油的副產物流被用於通過兼氧生長的海藻生產率和/或用於生產生物可降解的生物聚合物。
22.用於生產根據權利要求1-19所述的用作生物柴油的可用於發動機的脂肪酸甲酯的方法，所述方法包括以下步驟: (i)收集選自由微孢藻屬物種(Microspora sp.)和剛毛藻屬物種(Cladophora sp.)或培養的小球藻(Chlorella variabilis)組成的組的天然存在的微藻群以獲得海藻生物質； (?)曬乾所述生物質至殘留水分水平為5-10% ； (iii)通過蒸汽鼓風或滲透性衝擊預處理步驟(ii)的生物質以破壞細胞壁； (iv)使用己烷作為溶劑或任選地利用其中燃料待以混合物形式使用的柴油機從步驟(iii)的海藻生物質萃取脂質以獲得原料油； (v)去除己烷並且用硅藻土處理所得的原料油或任選地直接用硅藻土處理步驟(ii)的萃取物從而除去磷脂、色素和其他雜質； (vi)過濾以除去懸浮的固體並且如果需要，進一步處理步驟(V)的油萃取物以降低游離脂肪酸(FFA)含量以獲得精製油； (vii)對步驟(vi)的精製油進行鹼催化的酯基轉移，分離FAME，並且對其進行進一步純化以獲得可用於發動機的FAME。
23.根據權利要求22所述的方法，其中，如通過GC-MS分析，獲得自微孢藻屬物種(Microspora sp.)的FAME具有包含以下的組成:9.92%的16:0脂肪酸，2.44%的18:0脂肪酸，28.27%的18:1脂肪酸，59.37%的18:2脂肪酸，和5_30ppm的BHT抗氧化劑。
24.根據權利要求22所述的方法，其中，如通過GC-MS分析，獲得自小球藻(Chlorellavariabilis)的FAME具有包含以下的組成:6.9%的16:0脂肪酸，3.1%的18:0脂肪酸；.32.6%^ 18:1脂肪酸，和57.3%^ 18:2脂肪酸，以及5_30ppm的BHT抗氧化劑。
【文檔編號】C10L1/02GK103842514SQ201280025675
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年5月28日 優先權日:2011年5月26日
【發明者】桑迪亞·錢德裡卡·普拉薩德·米什拉, 普什皮託·庫馬·高希, 馬赫什·拉姆尼可拉爾·甘地, 蘇裡希·巴塔查裡亞, 蘇巴爾納·邁蒂, 蘇梅希·錢德拉·烏帕德亞, 阿呂普·高希, 拉沙普迪·巴德裡·納拉亞納·普拉薩德, 桑吉特·卡尼維爾, 桑吉夫·庫馬·米什拉, 阿努帕瑪·維賈伊庫馬·什裡瓦斯塔, 伊姆蘭·班差, 凱坦·帕利瓦, 託莫伊·高希, 拉胡爾·庫馬·毛裡亞, 蒂普提·賈殷, 沙裡希·庫馬·帕蒂達, 阿比謝克·薩胡, 赫塔·波薩米亞, 克魯希納德辛·薩拉 申請人:科學與工業研究委員會