使用6,8－二氟－4－甲基－7－羥基香豆素磷酸酯高度敏感和連續地檢測蛋白酪氨酸磷...的製作方法
2023-12-10 12:41:57 5
專利名稱：使用6,8－二氟－4－甲基－7－羥基香豆素磷酸酯高度敏感和連續地檢測蛋白酪氨酸磷 ...的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯，特別是在中性條件下檢測蛋白酪氨酸磷酸酶的改進方法。
現有技術公開了使用底物對-硝基苯基磷酸酯(p-NPP)檢測蛋白酪氨酸磷酸酶活性的方法。在標準生物化學手冊中可找到這些檢測方法，如「Current Protocols in Protein ScienceJohn E.Coligan(主編)，Ben M.Dunn(主編)，Hidde L.Ploegh(主編)，David W.Speicher(主編)，Paul T.Wingfield(主編)；SBN0-471-11184-8；活頁，不斷更新；John Wiley Sons出版」。磷酸酶的作用是從p-NPP形成對-硝基苯酚。基於其在鹼性範圍中的強烈黃色可用光度法檢測對-硝基苯酚。
然而，這個檢測方法具有一些不利特徵。該檢測不適合於直接確定該酶的活性，因為它是根據時間-終止原理實施的。根據這個原理，在給定的一段時間過去後添加氫氧化鈉溶液中斷酶反應。pH增加導致所形成的對-硝基苯酚的顏色變為黃色，用光度法確定它的吸收並且是對-硝基苯酚存在量的度量。該檢測原理對酶動力學研究相當詳盡，例如用於確定抑制類型。由於需要大量實驗點，所以不得不建立相互並列的相應數量的獨立試驗。
此外，底物對光、溫度和pH敏感。在生理pH範圍內，它有緩慢分解的趨勢。當pNPP用作底物時，一些待研究的酪氨酸磷酸酶在酸性範圍內具有最大活性。例如，PTP1B在pH5.6顯示出更大的轉換值。另一方面，在生理pH7.0下，當使用pNPP作為底物時，PTP1B僅以30％的最大轉換值工作。這使得需要使用相對高數量的酶，導致費用相應增加。這個檢測方法的另一個不利因素是檢測中存在的其它成分，如緩衝液、鹽或其它物質(檢測物質)，在黃色範圍內有時有吸收。這需要適當的背景對照。
孔雀石綠磷酸肽檢測已被描述作為檢測蛋白酪氨酸磷酸酶活性的另一種方法(Martin等(1985)Journal of Biological Chemistry，260，14932頁和Harder等(1994)Biochemical Journal，298，395頁)。在該方法中，使用孔雀石綠試劑通過光度法檢測磷酸酶由其底物肽釋放出的無機磷酸鹽。除了由於例如雜質或pH敏感性而引起的光度測定法的不穩定性以及時間-終止方法的費時費力外，另一個缺點是不得不製備高濃度的每個磷酸酶的特定底物肽，這通常使該方法相當昂貴。
3，6-螢光素二磷酸酯已被描述作為檢測蛋白酪氨酸磷酸酶的另一種底物(Journal of Biomolecular Screening 4，327-334，1999)。儘管這個底物相對於上面提及的兩個底物，使得能夠直接測定酶活性，但是該底物的光譜性質對於在生理pH範圍下實施測量仍然不是特別好。
因此，本發明涉及檢測生物學材料中蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活性的方法，它包括a)提供生物學材料或從生物學材料獲得的製品，b)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，c)在含水溶液中，使來自a)的生物學材料或從生物學材料獲得的製品與來自b)的DiFMUP接觸，d)通過螢光測定檢測所形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素。
從生物學材料獲得的製品優選包括選自LAR、CD 45、PTPα、PTP1B、TCPTP、YOP、CDC 25、PTEN和SHP1，2的蛋白酪氨酸磷酸酶。從生物學材料獲得的製品可以以不同的純度級別存在。從生物學材料獲得的製品可以是完整細胞、分解的細胞、富含細胞成分和/或細胞器的樣品，或純化蛋白。
當接觸生物學材料或從生物學材料獲得的製品時，優選6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯(DiFMUP)的濃度從10至250μM。特別優選，DiFMUP的濃度是從50至100μM。
生物學材料或從生物學材料獲得的製品與DiFMUP的含水溶液接觸的pH優選在5.0和8.0之間，特別優選在6.0和7.5之間。在一個實施方案中，再次特別優選該pH是7.0。
本發明也涉及鑑定改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法，它包括a)提供一種化合物，b)提供生物學材料或從生物學材料獲得的製品，c)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，d)在含水溶液中，使來自a)的化合物和來自b)的生物學材料或從生物學材料獲得的製品和來自c)的DiFMUP彼此接觸，e)通過螢光測定確定形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素的量，f)比較e)中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素的量和對照試驗中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素的量。
對照試驗的特徵在於，當生物學材料或從生物學材料獲得的製品接觸DiFMUP時，無化合物參與以上提及的步驟a)或該化合物對於所選類型的蛋白酪氨酸磷酸酶的作用是已知的。對照試驗中使用的並且其對蛋白酪氨酸磷酸酶的作用是已知的所述化合物尤其可以是釩酸鹽、釩有機化合物、過釩酸鹽、岡田酸、NaF、dephostasin、修飾的肽或其它化合物。
在鑑定改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法的各種優選實施方案中，這種改變應該包括刺激、抑制或穩定蛋白酪氨酸磷酸酶的活性。
在鑑定改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法的另一個優選實施方案中，所述蛋白酪氨酸磷酸酶選自LAR、CD 45、PTPα、TC-PTP、CDC 25、PTEN、YOP、SHP1，2和PTP1B。
本發明還涉及可以改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性並且已經用上述鑑定改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法進行了鑑定的化合物。優選該化合物具有0.1至50kDa的分子量，更優選0.1至5kDa並更優選0.1至3kDa。該化合物可以是蛋白、胺基酸、多核苷酸、核苷酸、天然產物或芳香烴化合物。本發明還涉及一種藥物，它包含至少一種如上所述的化合物，該化合物已用鑑定改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法所鑑定。該藥物還包含配製藥物的輔助物質和/或聚合物添加劑。
本發明還涉及已通過鑑定改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法進行了鑑定的可改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物在製備治療糖尿病的藥物的應用。
6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酶可從商業上獲得。例如，歐洲BV分子探針公司(2333 Leiden，荷蘭)出售這種化學品。US 5,830,912公開了其製備。
生物學材料是含有遺傳信息的任何材料，它本身也可以是細菌或真菌如大腸桿菌或釀酒酵母。生物學材料也包括來自細胞培養的細胞。
在來自動物或人組織的細胞的情況下，生物學材料可通過活組織檢查、手術取出或使用注射器或導管取出或類似的技術獲得。這樣取出的細胞可以深度冷凍、純化或進行培養。使用常規的微生物技術使細菌和酵母細胞繁殖並純化。
本領域技術人員可在「Current Protocols in Molecular Biology；主編F.M.Ansabel等，活頁出版物，不斷更新，2001版，John Wiley Sons出版」中發現為此目的的適當指導。生物學材料也可以包括來自動物細胞培養的細胞。這種細胞的實例是小鼠細胞、大鼠細胞或倉鼠細胞。細胞培養的細胞可以是原代細胞類型或建立的細胞系。建立的細胞系的例子是小鼠3T3細胞、CHO細胞或Hela細胞。標準教科書，例如「Basic Cell Culture；主編J.M.Daris IRL Press，Oxford(1996)」中描述了細胞系的維持、生長和繁殖。
通過例如破裂生物學材料和隨後的純化步驟製備從生物學材料獲得的製品。破裂生物學材料的方法尤其可以是反覆凍融、超聲處理、使用French壓榨機或添加洗滌劑和酶等。隨後的純化步驟包括例如差速離心、用硫酸銨或有機溶劑沉澱、使用色譜技術等。色譜技術的實例是聚丙烯醯胺凝膠電泳、高壓液相色譜、離子交換色譜、親和色譜、氣相色譜、質譜等。為此目的，本領域技術人員可利用教科書如「Current Protocols inProtein Science，主編J.E.Coligan等，活頁出版物，不斷更新，2001版，John Wiley Sons出版」，特別是關於純化蛋白的詳細指導。
生物學材料或從生物學材料獲得的製品可以在常規的實驗室容器如Eppendorf管、離心管或玻璃燒瓶中與DiFMUP接觸。其下的含水培養基含有例如緩衝物質、營養培養基組分、單電荷或雙電荷離子如Na+、K+、Ca2+、Cl-、SO42-和PO32-，或其它離子，以及蛋白、甘油或另一種物質。對於接觸，特定的恆定條件，如尤其是溫度、pH、離子條件、蛋白濃度、體積或其它因素可能是有利的。這通過例如在保持恆定溫度的溫箱裝置中，在緩衝液存在下或使用預先準確稱重的離子或蛋白實施接觸來完成。含水溶劑尤其也可以含有特定比例的有機溶劑，如二甲基亞碸、甲醇或乙醇。然而，這種溶劑的含量優選至多佔混合物體積的10％。
PTP酶(磷酸酶)蛋白家族目前包括大約100個不同的成員。這些成員可以粗略細分為受體偶聯蛋白和細胞質蛋白。磷酸酶在催化結構域共同具有胺基酸基序(H/V)CX5R(S/T)。受體偶聯磷酸酶通常由細胞外結構域、單一跨膜區和一個或兩個細胞質PTP酶結構域組成。認為LAR(白細胞共有相關抗原)蛋白和PTPα蛋白屬於受體偶聯PTP酶。作為例如「SH結構域」的結果，細胞內PTP酶通常含有催化結構域和C末端或N末端區域的各種延伸。這些延伸歸因於尋靶或調節的功能。酶PTP1B被歸為細胞質PTP酶。除了純的酪氨酸磷酸酶，PTP酶家族還包括雙重磷酸酶組。除了磷酸酪氨酸，這些酶也使用磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸作為底物。該組包括例如磷酸酶VHR和cdc25。
磷酸酶LAR、PTPα、SHP-2和PTP1B在胰導素介導的信號途徑中具有重要功能。這些PTP酶與胰導素受體相關並催化脫磷酸化反應。這些PTP酶可能單獨或組合在胰導素抗性的發病機理中起作用(Biochemistry38，3793-3803，1999；3799頁)。
PTP1B是胰導素刺激的信號轉導途徑的負調節劑，即該蛋白再次切斷由胰導素誘導的信號。據推測，該信號途徑是由胰導素受體直接脫磷酸化打斷的。在高比例的罹患乳癌的患者中PTP1B也過度表達。而且，該酶與「表皮生長因子」相互作用。已經證明該酶具有兩個芳香基磷酸酯結合袋。一個正好位於活性中心，而另一個位於這之外與催化中心相鄰的部位。(Biochemistry 38，3793-3803，1999)。
很多細胞內信號的傳遞和終止受所包含因子的酪氨酸磷酸化控制。互補的蛋白酪氨酸激酶(PTK)和磷酸酶(PTP酶)、尤其是蛋白酪氨酸磷酸酶活性的精確平衡建立了磷酸化狀態。
作為酶，PTP酶負責使磷酸酪氨酸殘基選擇性去磷酸化。PTP酶在與蛋白酪氨酸激酶的相互作用、在各種不同的生物學過程、在調節信號中的功能是由於例如生長因子或激素。這些信號轉導機制在調節細胞代謝、生長、分化或遷移率中起著重要作用。
信號轉導途徑的過失調節被認為是很多病理過程的原因之一。這些過程包括例如癌症、一些免疫學和神經病學疾病、並且也包括II型糖尿病和肥胖。
化合物通過例如化學合成來提供。本領域技術人員熟悉標準的合成方法。該化合物可以是化合物集合的一部分，從已經總結的合成程序(稱作化學文庫)儲存和分類化合物而形成。在其它情況下，該化合物可由微生物形成，尤其是細菌，或由真菌或植物形成(天然產物)。
口服給藥的合適藥物化合物可以以單獨的單位存在，如膠囊、扁囊、吮吸片劑或片劑，如散劑或顆粒劑，如含水或非水液體中的溶液或懸液，或如水包油或油包水乳劑。這些組合物可以按照任何合適的製藥方法製備，包括將活性化合物和賦形劑(它可由一種或多種另外的組分組成)接觸的步驟。通常，通過將活性化合物均勻地與液體和/或細分散的固體賦形劑混合來製備該組合物，如果需要的話，其後形成產物。
因此，片劑可例如通過壓制或成型化合物的粉末或顆粒來製備，其中如果適當的話，連同一種或多種另外的組分一起。
壓制的片劑可以通過壓片自由流動形式的化合物如粉末或顆粒來製備，其中在合適的機器中適當地與粘合劑、助流劑、惰性稀釋劑和/或一種(幾種)表面活性/分散劑混合。通過形成粉狀化合物可以製備成型的片劑，它在合適的機器中用惰性液體稀釋劑弄溼。
適合經口(舌下)給藥的藥物組合物包括含有化合物和矯味劑，通常是蔗糖和阿拉伯膠或黃芪膠的含片，和在惰性基質如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠中包含化合物的錠劑。
胃腸外給藥的合適藥物組合物優選包括化合物的無菌含水製劑，該製劑優選與意欲接受者的血液是等滲的。優選靜脈內給予這些製劑，即使也可以作為注射劑經皮下、肌肉內或真皮內給藥。優選可通過將化合物與水混合併使形成的溶液無菌和與血液等滲來製備這些製劑。根據本發明的可注射組合物通常包含0.1至5％重量的活性化合物。
直腸給藥的合適藥物組合物優選以單劑量栓劑的形式存在。
這些可以通過將化合物與一種或多種常規固體賦形劑，例如可可脂混合併成型所得混合物來製備。
皮膚上局部使用的合適藥物組合物優選以軟膏、乳膏、洗劑、糊劑、噴霧劑、氣霧劑或油劑形式存在。可以使用的賦形劑是凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇和兩種或多種這些物質的組合。活性化合物通常以組合物重量的0.1至15％的濃度存在，例如0.5至2％。
也可以經皮給藥。經皮使用的合適藥物組合物可以以適合緊密、長期接觸患者表皮的獨立的硬膏的形式存在。這種硬膏適當地包含處於緩衝含水溶液中的活性化合物，其中適合的話，溶解和/或分散於粘合劑中或分散於聚合物中。合適的活性化合物濃度是大約1％至35％，優選大約3％至15％。
2型糖尿病(NIDDM-非胰導素依賴型糖尿病)的特徵是禁食狀態下葡萄糖值高(高血糖)(＞126mg/dl)，外周組織中如肌肉或脂肪的胰導素抗性，肝臟糖異生增加和胰腺β細胞分泌胰導素不足。這種疾病的真實原因仍未知。2型糖尿病經常和其它臨床症象一起發生，如肥胖、高甘油三酯血症(血脂值升高)和高血壓。
據推測，胰導素抗性是理解臨床症象的關鍵。胰導素抗性表現為外周器官對確定濃度的胰導素的反應能力降低。這反映在細胞水平，即誘導胰導素的作用所需的胰導素的量增加。在肌肉、脂肪和肝臟細胞中，胰導素對葡萄糖代謝和脂肪代謝具有各種作用，如增加葡萄糖從血液吸收，增加葡萄糖的代謝速度或抑制脂肪酸分解。認為各種因素在細胞水平與胰導素抗性的發展具有基本聯繫。胰導素受體、信號級聯的因子以及葡萄糖轉運系統的成分在其中起著重要作用。
胰導素通過在第一步中結合胰導素受體而產生其生物學作用。該受體結合胰導素之後，其β亞單位遭受胰導素受體激酶的自磷酸化作用。在肌肉細胞中，該信號依靠IRS(胰導素受體底物)和PI3K(磷酸肌醇-3-激酶)在細胞傳遞並導致被刺激的葡萄糖吸收。胰導素帶來大量其它作用，這些作用通過僅部分了解的機制進行。在細胞內信號傳遞中，特定的激酶和磷酸酶以協調方式一起作用。胰導素從受體解離不足以切斷胰導素誘導的信號。只要調節結構域保持磷酸化，胰導素受體的酪氨酸激酶活性就保持。細胞PTP酶負責切斷該信號。對胰導素信號途徑的負調節劑具有抑制作用的藥理學活性化合物具有延遲胰導素受體脫磷酸化的潛力。這提供了能夠使用降低對胰導素抗性的物質的可能性。
縮寫LAR白細胞抗原相關蛋白酪氨酸磷酸酶CD45 白細胞磷酸酶CD45YOPyersinia蛋白酪氨酸磷酸酶PTPα 蛋白酪氨酸磷酸酶αPTP 1B 蛋白酪氨酸磷酸酶1BTC-PTP T細胞蛋白酪氨酸磷酸酶CDC-25 細胞分裂控制磷酸酶25PTEN 染色體10內的磷酸酶(雙重特異性)SHP1，2src-同源磷酸酶1，2實施例1.依賴於PTP1B酶濃度的DiFMUP的裂解反應在37℃下在黑色微量滴定板中進行。每種待分析酶濃度提供135μl反應緩衝液，所述反應緩衝液含有下列成分所需終濃度(
圖130-600ng/ml)的蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B；50mM Hepes，pH6.9；150mMNaCl；1mM EDTA；2mM DTT。添加15μl 1mM DiFMUP溶液開始磷酸酶反應，並在螢光微量滴定板光度計中在激發波長358nm和發射波長455nm下測定螢光(單位RFU)的增加，連續測定15分鐘。酶活性的度量是依賴於PTP1B終濃度的螢光增加，可圖示描述(圖1)。
2.PTP1B裂解DiFMUP的濃度依賴性反應在37℃下在黑色微量滴定板中進行。每種情況提供135μl反應緩衝液，所述緩衝液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1b/ml；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT。添加15μlDiFMUP溶液開始磷酸酶反應，所述溶液含有10倍於檢測混合物中所需的終濃度的底物(圖20-200μM)，並在螢光微量滴定板光度計中在358/455nm下測定螢光，以30秒的時間間隔測定15分鐘。酶活性的度量是依賴於DiFMUP濃度的螢光(單位RFU)的增加，可圖示描述(圖2)。該圖隨後可用於通過Lineweaver-Burk分析來確定酶反應的動力學常數。因此，發現PTP1B具有19μM的Km值和388000 RFU sec-1mg-1的Vmax。該分析也可以以類似模式對其它酪氨酸磷酸酶實施。
3.依賴於磷酸酪氨酸磷酸酶PTPα、LAR、T細胞-PTP、SHP-2、CD45和YOP濃度的DiFMUP的裂解反應在37℃下在黑色微量滴定板中進行。每種待分析的酶和酶濃度提供135μl反應緩衝液，所述緩衝液含有下列成分所需終濃度的蛋白酪氨酸磷酸酶(圖3PTPα0.5-1.85μg/ml，LAR125-500ng/ml；T細胞-PTP66-330ng/ml；CD 4550-400ng/ml；YOP50-400ng/ml；SHP-20.3-2.4μg/ml)；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mMDTT。添加15μl 1mM DiFMUP溶液開始磷酸酶反應並在螢光微量滴定板光度計中在358/455nm下測定螢光，以30秒的時間間隔測定15分鐘。酶活性的度量是依賴於蛋白酪氨酸磷酸酶終濃度的螢光(單位RFU))的增加，可圖示描述(圖3)。
4.測定PTP1B的磷酸酶抑制劑的抑制作用使用DiFMUP檢測確定活性化合物2，2-二氧代-2，3-二氫-2，6-苯並[1，2，3]氧雜噻唑-5-基)-(9-乙基-9H-咔唑-3-基甲基)胺的抑制作用的檢測在37℃溫度下在黑色微量滴定板中進行。提供120μl反應緩衝液，緩衝液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1B/ml；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT。向其中添加15μl各種濃度的待檢測的抑制劑溶液。添加15μl 1mM DiFMUP溶液開始磷酸酶反應並在螢光微量滴定板光度計中在358/455nm下測定螢光(單位RFU)，以30秒的時間間隔測定15分鐘。酶活性的度量是螢光的增加，可圖示描述(圖1)。獲得的酶活性降低依賴於採用的抑制劑濃度。2，2-二氧代-2，3二氫-2，6-苯並[1，2，3]氧雜噻唑-5-基)-(9-乙基-9H-咔唑-3-基甲基)胺降低PTP1B活性的一半的抑制劑濃度(IC-50)可以確定為3.8μM。確定使用pNPP檢測法和孔雀石綠磷酸肽檢測法的IC-50值以進行比較。就此而言，pNPP檢測法給出5.1μM的IC 50值而孔雀石綠磷酸肽檢測方法給出3.9μM的IC 50值。圖4包括相應的抑制曲線。
5.磷酸酶抑制劑對PTP1b產生的抑制類型的特徵描述反應在37℃下在黑色微量滴定板中進行。提供120μl體積的反應緩衝液，緩衝液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1b/ml；50mMHepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT和依賴於以前確定的IC50的抑制劑濃度。添加15μl DiFMUP溶液開始磷酸酶反應，所述溶液含有10倍於終體積中所需的終濃度的底物(圖20-200μM)，並在螢光微量滴定板光度計中在358/455nm下測定螢光，以30秒的時間間隔測定15分鐘，直到反應達到飽和。隨後，添加10倍過量於以上採用的終濃度的底物並繼續監測反應，在螢光微量滴定板光度計中在358/455nm下測定螢光，以30秒的時間間隔測定15分鐘。當存在不可逆抑制劑時不能再次開始反應，但當抑制是可逆類型時則是可能的(圖5)。
6.通過時間依賴性孵育描述磷酸酶抑制劑對PTP1b產生的抑制類型的特徵反應在37℃下在黑色微量滴定板中進行。提供120μl反應緩衝液，緩衝液含有下列成分100ng蛋白酪氨酸磷酸酶PTP1b/ml；50mM Hepes，pH6.9；150mM NaCl；1mM EDTA；2mM DTT和依賴於以前確定的IC50的抑制劑濃度。
孵育混合物並在確定的時間點添加15μl DiFMUP溶液開始磷酸酶反應，所述溶液含有10倍於終體積中所需的終濃度的底物(圖20-200μM)，並在螢光微量滴定板光度計中在358/455nm下測定螢光，以30秒的時間間隔測定15分鐘。
在不可逆抑制劑的存在下，酶活性的降低依賴於預孵育的時間，而在可逆抑制類型的抑制劑的情況下不能觀察到該現象。
附圖概述圖1依賴於PTP1B酶濃度的DiFMUP的裂解圖2PTP1B對DiFMUP裂解的濃度依賴性圖3依賴於磷酸酪氨酸磷酸酶PTPα、LAR、TCPTP、SHP2、CD45和YOP濃度的DiFMUP的裂解圖4測定PTP1B的磷酸酶抑制劑產生的抑制作用圖5磷酸酶抑制劑的抑制類型的鑑定圖6通過時間依賴性孵育鑑定磷酸酶抑制劑的抑制類型
權利要求
1.一種檢測生物學材料中蛋白酪氨酸磷酸酶的酶活性的方法，它包括a)提供生物學材料或從生物學材料獲得的製品，b)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，c)在含水溶液中，使來自a)的生物學材料或從生物學材料獲得的製品與來自b)的DiFMUP接觸，d)通過螢光測定檢測形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素。
2.如權利要求1的方法，其中，提供至少一種選自LAR、CD 45、YOP、PTPα、PTP1B、TC-PTP、CDC 25、PTEN和SHP 1，2的蛋白酪氨酸磷酸酶作為從生物學材料獲得的製品。
3.如權利要求1或2的方法，其中，接觸後DiFMUP的濃度是10-250μM。
4.如權利要求3的方法，其中，DiFMUP的濃度是從50至100μM。
5.如權利要求1至4的一項或多項所述的方法，其中，c)中含水溶液的pH在5.0和8.0之間。
6.如權利要求5的方法，其中，pH在6.0和7.5之間。
7.如權利要求5和8的方法，其中pH是7.0。
8.一種鑑定改變蛋白酪氨酸磷酸酶活性的化合物的方法，它包括a)提供一種化合物，b)提供生物學材料或從生物學材料獲得的製品，c)提供6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素磷酸酯(DiFMUP)，d)在含水溶液中，使來自a)的化合物和來自b)的生物學材料或從生物學材料獲得的製品和來自c)的DiFMUP彼此接觸，e)通過螢光測定確定形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素的量，f)比較e)中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素的量和對照試驗中形成的6，8-二氟-4-甲基-7-羥基香豆素的量。
9.如權利要求8的方法，其中所述的蛋白酪氨酸磷酸酶的活性被刺激、抑制或維持。
10.如權利要求8或9的方法，其中的蛋白酪氨酸磷酸酶選自LAR、CD 45、YOP、PTPα、PTP1B、TC-PTP、CDC 25、PTEN和SHP 1，2。
11.通過如權利要求8至10所述的方法進行了鑑定的化合物。
12.如權利要求11的化合物，其中化合物的分子量在0.1和50KDa之間。
13.如權利要求11或12的化合物，其中化合物的分子量在0.1和5KDa之間。
14.如權利要求11-13的化合物，其中化合物的分子量在0.1和3KDa之間。
15.如權利要求11至14的一項或多項所述的化合物，其中化合物是蛋白、胺基酸、多糖、糖、多核苷酸、核苷酸、天然產物或芳香烴化合物。
16.一種藥物，包含權利要求11至15所述的至少一種化合物、配製藥物的輔助物質和/或聚合物添加劑。
17.權利要求11至14的一項或多項所述的化合物在製備用於治療糖尿病的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及使用6，8－二氟－4－甲基－7－羥基香豆素磷酸酯(DiFMUP)檢測生物學材料中的蛋白－酪氨酸－磷酸酶的方法。
文檔編號G01N21/78GK1612939SQ02826666
公開日2005年5月4日 申請日期2002年12月24日 優先權日2002年1月4日
發明者S·韋爾特, N·特納格爾斯, S·佩特裡 申請人:安萬特醫藥德國有限公司