一種在解脂耶羅維亞酵母中製備多肽的方法

2023-09-15 12:47:35 2

專利名稱：一種在解脂耶羅維亞酵母中製備多肽的方法
—種在解脂耶羅維亞酵母中製備多肽的方法
背景技術：
本發明涉及一種在解脂耶羅維亞酵母(Yarrowia Iipolytica)中製備多肽的方法。特別地，本發明涉及一種通過操控酵母的生長條件並由此操控所述酵母的生長過程，對使用hp4d啟動子在解脂耶羅維亞酵母(Y. Iipolytica)中表達感興趣的多肽進行優化的方法。解脂耶羅維亞酵母是一種用於生產檸檬酸的非常規酵母，其已被美國食品和藥物管理局(American Food and Drug Administration, FDA)確定為公認安全(GRAS)狀態(Fickers et al.，2005)。許多分子工具均可用於外源蛋白質在解脂耶羅維亞酵母中的表達，因為該酵母具有高的分泌能力。多拷貝帶載體(Multi-copy vector)含有ura3d4標記，其在多拷貝互補中是需要的，以允許對帶多個插入的轉化株進行篩選(Madzak et al. , 2004)。所述ura3d4篩選標記確保對帶10 - 13個完整表達盒(integrated cassette)拷貝的轉化株的篩選(Juretzek et al.，2001)。所述hp4d啟動子是用於在解脂耶羅維亞酵母中表達外源多肽的最常用的啟動子(Madzak et al.，2004)。該啟動子由XPR2啟動子的上遊激活序列I的四個串聯重複拷貝組成，並且其表達不受環境條件的顯著影響。但是，其調節作用是未知的，並且據報導其對蛋白質的生產是半組成型(quasi constitutive)的,且調節作用僅發生在早期生長穩定期中。因此需要對hp4d啟動子獲得更多的理解，以確定該啟動子是否可用於操控並最終增加蛋白質在宿主細胞中的表達。

發明內容
根據本發明，提供了一種在解脂耶羅維亞酵母中表達多肽的方法，該方法包括步驟使解脂耶羅維亞酵母發酵，該酵母已經多核苷酸轉化，所述多核苷酸在hp4d啟動子的控制下編碼多肽；和在發酵期間將解脂耶羅維亞酵母的生長速率限制為低於0. 0451!'所述生長速率可以限制為約Ο. ^βΙΓ1至約O.CMOh—1，更優選約Ο. ^δΙΓ1至約0. 0391^。甚至更優選，所述生長速率可以限制為約0. 0351!'所述生長速率可以通過控制加入至含解脂耶羅維亞酵母的發酵溶液中的食物源(例如碳源和/或氮源)的量進行限制。所述碳源可為葡萄糖，所述氮源可為酵母提取物。所述多肽可為蛋白質，例如酶，如脂肪酶或甘露聚糖酶。所述發酵可為分批發酵法、分批進料發酵法、反覆分批進料發酵法或連續發酵法。優選地，所述方法增加了多肽產量，相比於生長速率不受限制的對照組解脂耶羅維亞酵母。在本發明的另一個實施方案中，提供了一種在上述方法中使用的轉化了多核苷酸的解脂耶羅維亞酵母，所述多核苷酸在hp4d啟動子的控制下編碼多肽。
在本發明的又一個實施方案中，提供了一種含有用於實施上述方法的解脂耶羅維亞酵母的試劑盒(kit)。


圖I :顯示了葡萄糖峰值對穩定解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5發酵的p02、殘餘葡萄糖和生物質濃度的影響。圖2 :顯示了稀釋速率對在穩定連續發酵中的解脂耶羅維亞酵母Polf413_5的生物質、殘餘葡萄糖和酶體積活性(volumetric enzyme activity)的影響。圖3 :顯示了稀釋速率對在穩定連續發酵中通過解脂耶羅維亞酵母Polf413_5生產脂肪酶的響應程度的影響。生長速率如數據記錄單中所給出的。
圖4 :顯示了稀釋速率對在穩定連續發酵中通過解脂耶羅維亞酵母Polf413_5生產脂肪酶的體積速率和比速率的影響。圖5 :顯示了在二次分批發酵中的解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5的生長情況。圖6 :顯示了在二次分批發酵中通過解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5生產脂肪酶。圖7 :顯不了指數全培養基進料(exponential full medium feed)對解脂耶羅維亞酵母Polf413-5的生長的影響。全培養基以O. 0291Γ1 (開符)和O. 0411Γ1 (閉符)的指數進料速率進料。圖8 :顯示了指數全培養基進料對通過解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5生產脂肪酶的影響。全培養基以O. 0291Γ1 (開符)和O. 0411Γ1 (閉符)的指數進料速率進料。圖9 :顯示了指數全培養基進料對通過解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5對生產脂肪酶的速率影響。全培養基以O. 0291Γ1 (開符)和O. 0411Γ1 (閉符)的指數進料速率進料。圖10 :顯示了在二次分批發酵中Y. Iipolytica ManA:HmA(Roth等，2009)的生長情況。圖11 :顯不了指數全培養基進料對Y. Iipolytica ManA:HmA的生長的影響。全培養基以O. 0351Γ1 (開符)和O. 045h^ (閉符)的指數進料速率進料。圖12 :顯示了指數全培養基進料對通過Y lipolytica ManA:HmA生產甘露聚糖酶的影響。全培養基以O. 0351Γ1 (開符)和O. 045h^ (閉符)的指數進料速率進料。圖13 :顯示了指數全培養基進料對通過Y lipolytica ManA:HmA生產甘露聚糖酶的速率的影響。全培養基以O. 0351Γ1 (開符)和O. 045h^ (閉符)的指數進料速率進料。
具體實施例方式現將在下文參照附圖對本發明進行更充分描述，其中僅說明了本發明的幾個但不是所有的實施方案。本發明公開了一種在解脂耶羅維亞酵母中表達多肽的方法，其中使解脂耶羅維亞酵母發酵，所述酵母經多核苷酸轉化，所述多核苷酸在hp4d啟動子的控制下編碼多肽，並在發酵期間限制解脂耶羅維亞酵母的生長速率低於O. 045h-1o所述生長速率可限制為約O. 023h^至約O. (MOtT1，更優選約O. 035^'至約O. 0391Γ1。例如，所述生長速率可限制為約 O. 023,0. 024,0. 027,0. 029,0. 035 或 O. 0391Γ1。所述生長速率可通過控制加入至發酵溶液中的碳源、氮源和/或其他源例如葡萄糖或酵母提取物的量進行限制。所述發酵可為分批發酵法、分批進料發酵法或連續發酵法。所述多肽可為外源或同源的多肽、蛋白質或酶。在下述實施例中，使用脂肪酶和甘露聚糖酶作為通過解脂耶羅維亞酵母表達的示例酶。在半組成型的hp4d啟動子的調節下通過解脂耶羅維亞酵母進行的酶的生產始於生長穩定期開始時。使用在葡萄糖受限制條件下的連續發酵來確定生長速率對在hp4d啟動子調節下生產的脂肪酶的影響。Lip2基因，其在解脂耶羅維亞酵母中編碼細胞外的脂肪酶和來自棘孢麴黴(Aspergillus aculeatu)的內切-I, 4_β-D-甘露聚糖酶(β-甘露聚糖酶)在半組成型的hp4d啟動子調節下用多拷貝LIP2表達框在Y lipolytica Polf中進行過表達(MatA，Leu2·-207, ura3-302, xpr2-322, axp-2)。生產的最大脂肪酶體積活性13014nkat. ml—1是在生長速率為O. 024h^時，該速率為估算的最低生長速率。但是，脂肪酶生產的最大速率在生長速率大於O. 0351^時得到。脂肪酶生產的臨界生長速率在O. 0351Γ1和O. 0391Γ1之間。連續發酵中脂肪酶生產的比速率28nkat. mg' IT1是分批發酵中脂肪酶生產的比速率7nkat. mg' IT1的4倍,這表明對於通過解脂耶羅維亞酵母生產酶而言連續發酵可能是一個可行的選擇。利用由連續發酵得到的數據，開發了在hp4d啟動子調節下通過解脂耶羅維亞酵母來生產蛋白質的分批進料法並對脂肪酶和甘露聚糖酶的生產進行了評價。與在分批發酵中的得到的脂肪酶的最大滴定度為SSTMieTDnkat.mr1，以及在較高生長速率O. (MOtT1得到的脂肪酶的最大滴定度為SgiiKiSZ^nkat.mr1相比，在發酵的分批進料階段中生長速率為O. 0271Γ1時得到脂肪酶的最大滴定度為22508 (±4219)nkat. πιΓ1。通過限制解脂耶羅維亞酵母的生長速率，我們能夠同時生產生物質和酶，從而增加發酵的生產率。與O. (MOtT1的指數生長速率期間脂肪酶體積活性生產率為133nKat. πιΓ1.h—1相比，在較慢的生長速率期間脂肪酶體積活性生產率為357nkat. πιΓ1. IT1。與在分批發酵中甘露聚糖酶的最大滴定度為14253(±2807)nkat.ml_1，以及當培養基以O. 045h^指數進料速率進料，甘露聚糖酶的最大滴定度31 479 (± 1819) nkat. πιΓ1相t匕，當培養基以O. 035^'呈指數進料時得到的甘露聚糖酶的最大滴定度為40835 (±2536)nkat. πιΓ1.指數進料法能將生物質和酶的生產相結合，從而增加發酵的生產率。與O. 045^:的指數進料速率期間和分批生產期間酶體積活性生產率分別為850nkat. πιΓ1. IT1和346nkat. ml—1, h—1相比，在較慢的進料速率期間酶體積活性生產率為913nkat. ml—1, h—1。該進料方法使用碳料作為例進行評價。所述的本發明不應限制為所公開的具體實施方式
，改進及其他實施方案也意欲包括在本發明範圍內。雖然本說明書中使用了特定術語，但是它們僅以寬泛意義和描述意義使用，不作為對本發明的限制。例如術語「蛋白質」應解讀為包括「肽」和「多肽」，反之亦然。此外，蛋白質的定義包括「酶」。實施例材料和方法微牛物體的保存和接種的菌株
Y. lipolytica Polf 413-5(MatA, Leu-2-207, ura3-302, xpr2~322, axp-2)和Y. lipolytica ManA:HmA(Roth et al.，2009)在-80° C進行冷凍保藏和儲存。用於發酵的培養液通過對IOOml由15g. Γ1酵母提取物、8. 9g. Γ1麥芽提取物和6. 67g. Γ1葡萄糖組成的培養基在IL Erlenmeyer燒瓶中於121° C滅菌15min而製得。在滅菌之前用25%m.W1NH4OH or 25%m. V-1H2SCUfpH調節至5. 5。使用單個冷凍小瓶中的內容物接種到燒瓶中。將該燒瓶在30° C於軌道式振蕩器上以180rpm培育18h。解脂耶羅維亞酵母的連續發酵在一個2L 的連續發酵罐(BioFlo 3000, New Brunswick, USA,)-其含有 I. 5L 改
良的由20g. Γ1酵母提取物和20g. Γ1葡萄糖組成的CSIRman培養基，其接種了 IOOml的菌液。用 NH4OH(25%m. ν—1)或 H2SO4 (25%m. ν—1)控制 pH 為 pH 6· 8。溫度控制在 28。C，在 3simp通風，並在800rpm攪拌。在每段保持時間之後取5ml試樣測量韓生物質(Cal biomass)和光學密度(OD)來確定穩定期。一旦達到穩定期，其表現為在三段保留時間恆定的OD和生物質，取出一個試樣，測定生物質、0D、酶活性和殘餘葡萄糖濃度。 分批脂肪酶發酵和分批進料脂肪酶發酵在工作體積為2L，含有I. 5L由20g. Γ1酵母提取物和40g. Γ1葡萄糖組成的培養基的Labfors (Infors AG-Bottmingen/Switzerland)生物反應器中進行兩次分批發酵。在同一發酵罐中以I. 3L由IOg. Γ1酵母提取物和24g. Γ1葡萄糖組成的初始裝料體積進行分批進料發酵。在進料桶中接種IOOml菌液。用25%m. V-INH4OH或20%m. W1H2SO4控制pH為pH 6.8。溫度控制在28° C,通風設定為lv. v_p HL115初始攪拌為500rpm並手動加強,來控制PO2的飽和度大於30%。進料由83.6g. Γ1葡萄糖和40g. Γ1酵母提取物組成。當通過Accutrend(Boehringer Mannheim)測得初始裝料的葡萄糖耗盡時,開始進料。初始進料速率為I. lg. h-1並分別以O. 0291Γ1和O. (Mlh-1的指數速率每10秒鐘增加一次。分析每個3小時取IOg試樣測定生長速率、生物質、酶產量和葡萄糖利用率。通過在660nm測定OD來測量生長,使用Accutrend(Boehringer Mannheim)測量殘餘葡萄糖。將3份2ml的等分試樣離心並將上清液在-20° C貯存用於分析細胞外的脂肪酶活性。沉澱在110° C乾燥至恆定重量來測定細胞乾重量。通過向9ml、pH 8. O的IOOmM磷酸鹽或Tris-HCl的緩衝液中逐滴添加在異丙醇中製備的Iml 8mM對-硝基苯基棕櫚酸酯(pNPP),來製備用於脂肪酶試驗的底物。通過添加25-50 μ I酶試樣開始反應，在410nm、37° C監測pNP的釋放。酶的活性計算如下U. ml-1= (V/v χ ε χ d) X A/min其中V=最終體積，V=試樣體積，ε =41Onm下ρ_ΝΡ的消光係數，pH 8. O (15Μο1_1χοπι_1=πι1χ μ moF^cm-1),d=比色皿中的光程，A. mirT1=每分鐘吸光率的變化生產的甘露聚糖酶的活性通過使用0. 25%半乳甘露聚糖(Sigma)的0. 05M檸檬酸磷酸鹽緩衝液，根據Bailey et al.，(1992)的描述來確定。甘露聚糖降解過程釋放的還原性糖的量通過二硝基水楊酸法使用甘露糖作為標準物來確定(Miller et al.，1960)。一個單位的酶定義為在最佳試驗條件下在甘露糖等同物中每分鐘生產Immol還原性糖的活性。酶體積活性報導為每ml發酵培養液中酶的單位，而酶的比活性報導為發酵培養液中每mg幹細胞重量的酶單位。結果和論述連續發酵在連續發酵中評價O. 0241Γ1和O. 0581^之間的生長速率對生物質和脂肪酶酶的生產的影響。通過將濃縮的葡萄糖溶液(50%m/m)加入(spike)發酵罐使發酵罐中得到5g. Γ1的最終葡萄糖濃度，測得葡萄糖為限制生長的營養物質。P02響應葡萄糖的增加立即降低，且生物質經過I. 5小時由9. 9g. Γ1增加至10. 8g. 圖I)。
在估算的稀釋速率下維持11. 4(±0. 4)g. Γ1的恆定生物質，並且殘餘葡萄糖保持在檢測水平以下(圖2)。在最低O. 0241Γ1的稀釋速率下，得到最高13014nkat. ml—1的酶體積活性。用493nkat. ml—1的酶體積活性估算的最高稀釋速率為O. 0581^。脂肪酶生產對生長速率增加的響應值，通過酶活性的成倍減少值除以稀釋速率的成倍增加值計算得到。當生長速率由O. 0391Γ1增加到O. 0441Γ1時，增加的生長速率對脂肪酶生產的影響最高，得到的響應值為4，該值標誌著在hp4d啟動子調節下通過解脂耶羅維亞酵母Polf 413-5生產脂肪酶的臨界生長速率(圖3)。脂肪酶生產的體積速率和比速率分別在稀釋速率為O. 024h^和O. 035^'時達到它們的最高值314nkat. ι Γ1. tf1和28nkat. mg' tf1 (圖4)。稀釋速率增加至大於O. 0351Γ1時導致脂肪酶生產速率減少，當稀釋速率增加到大於O. 0391^時，生產速率急劇降低。稀釋速率為O. OUh-1時，脂肪酶生產的體積速率為1463nkat. ml—1, h—1，並且脂肪酶生產的比速率為6nkat. mg-1, h'在生長速率大於O. 0391^時脂肪酶生產率的降低支持了所述結果，表明hp4d啟動子是通過生長速率進行調節的，且其在生長速率低於O. 0351Γ1時被完全表達，
O.039h^為用於調節hp4d啟動子的臨界生長速率。與分批發酵中脂肪酶生產的最大比速率為7nkat. mg' IT1相比，在連續發酵中脂肪酶生產的最大比速率為ZSnkat.mg'tT1，使得連續發酵成為酶生產的一個可行選擇。為利用生長速率對脂肪酶生產的影響，對通過解脂耶羅維亞酵母Polf413_5生產脂肪酶的分批進料的策略進行測定。測得生物質對葡萄糖的產率為0.59^Ρ。由所述數據，使用下式計算分批進料發酵中用於酶生產的葡萄糖進料速率((dcwt0+ (dcwtox ((2/td))) -dcwt0) x Yx/s) /dcwt0其中dcwt(l=起始 dewtd=倍增時間Yx/s=產率在生長速率為O. 039h^時，計算得葡萄糖進料速率為O. 07g. g—1. h—1。測試分批進料發酵中的進料速率。分批發酵脂肪酶發酵實施分批發酵來測定在hp4d啟動子調節下通過解脂耶羅維亞酵母Polf413_5在最大生長速率下進行的脂肪酶酶的生產。解脂耶羅維亞酵母Polf413-5在O. Hr1的最大生長速率下生長，並在26h後達到16 (±0.36) g.r1的生物質濃度(圖5)。生物質對消耗的葡萄糖的產率為O. 67g. g—1。到指數生長階段結束時生產的脂肪酶體積活性為並且在38小時後增加了 4. 6倍達到5 910 (±524) nkat. ml-1的最大脂肪酶活性(圖6)。脂肪酶比活性生產遵循類似的趨勢，且在指數生長階段結束時，脂肪酶比活性為75(±44)nkat.mg_1，但在接下來的24小時，增加了 5倍，達到390 (±35) nkat. mg'使用由全培養基進料組成的分批進料法來限制生長速率。葡萄糖耗盡之後，開始所述進料。在分批階段中最大生長速率為O. 13 (±0. ODtr1 (圖7)。分別以O. 0291Γ1和O. 0411Γ1指數進料速率進行培養基進料，在進料開始後的指數生長速率分別為O.在發酵的分批階段中，生產出TZMiUhKat.mr1的脂肪酶。大部分脂肪酶是在指數進料期間生產出，在以O. 401Γ1進料速率生產出的脂肪酶為7545(±246)nKat.mr1，相比於在O. 0271Γ1進料速率生產出的脂肪酶為17152 (±410) nKat. πιΓ1 (圖 8)。在較低生長速率下生長期間達到的最大脂肪酶體積活性為22508 (±4219) nKat.πιΓ1是在較高生長速率時得到的最大脂肪酶體積活性8374 (±671) nKat. πιΓ1的2. 7倍。脂肪酶比活性對生長速率的響應與脂肪酶體積活性對生長速率的響應類似，在較低生長速率時得到2. 8倍高的活性。與生長速率為O. (MOtT1時最大脂肪酶比活性為452 (±352) nkat.mg—1相比，生長速率為O. 0271Γ1時最大脂肪酶比活性為USKiSlDnkat.mg-1。生產率不受較慢生長速率的影響，在O. 0271^的生長速率下得到的最大的體積生產率和比生產率為357nkat. ι Γ1. IT1和20. 3nkat. mg' h'在生長速率為O. (MOtT1時，體積生產率為 133nKat. ι Γ1. IT1，比生產率為 7. 2nkat. mg' IT1 (圖 9)。甘露聚糖酶發酵實施分批發酵來確定在hp4d啟動子調節下通過解脂耶羅維亞酵母在最大生長速率下進行的甘露聚糖酶的生產。解脂耶羅維亞酵母在0.231^的最大生長速率下生長，在
O.68g. g-1葡萄糖產率下在25h後達到27 (±0. 74) g. Γ1的生物質濃度(圖10)。甘露聚糖酶活性僅可在葡萄糖耗盡之後確定，因為殘餘葡萄糖會干擾酶試驗。因此在葡萄糖耗盡並且再過16小時時確定甘露聚糖酶。但是，葡萄糖耗盡時的活性是最重要的，因為它指示了在無限制的生長速率期間生產的酶的量。在葡萄糖耗盡時，甘露聚糖酶的體積活性和比活性分別為10427 (±967)nkat. πιΓ1和386 (± 13)nkat. mg'但在接下來的十六個小時期間，它們增加至 14253 (± 2807) nkat. πιΓ1 和 527. 9 (± 88) nkat. mg-1。使用分批進料策略來限制最大生長速率，全培養基進料——以葡萄糖作為如在連續發酵中確定的限制性營養物一在葡萄糖耗盡時(16h後)以O. Ig (葡萄糖).Γ1. h—1的速率開始，並分別以O. 035和O. 045h^的指數速率增加(圖11)。在分批階段中生長速率為O. 24b-1,以O. 63g. g—1的產率實現15 (±O. 3) g. Γ1的生物質。應用的指數進料速率將在發酵的分批進料階段中的生長速率分別限制為O. 0331^和O. 0441^，在分批進料階段結束時，得到的最終生物質為28 (± O. 6)g. Γ1。進行兩組發酵試驗，每組重複三次，在分批階段結束時，甘露聚糖酶的平均體積活性和比活性分別為5211 (±602)nkat. πιΓ1和436 (±47)nkat. mg—1 (圖12)。相比於當解脂耶羅維亞酵母被以O. 0451Γ1的指數速率進料培養基時生產的最大酶體積活性為31479 (ilSl^nkat.mr1，以0. 0351Γ1指數速率進料培養基時生產的最大酶體積活性為40480 (± 1268) nkat. πιΓ1。酶比活性由當所述培養基以O. (ΜδΙΓ1的指數進料速率進料時的I 109(±60)nkat. mg-1到當對發酵罐以O. 0351Γ1的指數速率進料時的I 533 (±83) nkat. mg4,增加了
I.4倍。較低的進料速率不會導致較低的甘露聚糖酶生產率，且酶在O. 035^'和O. 045h^的指數進料速率下以913nkat. ι Γ1. IT1生產。這是在分批發酵中達到的346nKat. ι Γ1. IT1的生產率的2. 6倍。結論這是第一個報導的有關通過解脂耶羅維亞酵母在連續發酵中的生產外源酶的數·據。酶生產的臨界生長速率位於O. 0351Γ1和O. 0391Γ1之間，由該數據可計算分批進料發酵中的葡萄糖的進料速率。在分批進料發酵中對該進料策略進行評價，該分批進料發酵用於在hp4d啟動子調節下在解脂耶羅維亞酵母中生產酶。為評價生長速率對脂肪酶生產的影響，用全培養基指數進料基於進料中的葡萄糖濃度以O. 0291Γ1和O. 0411Γ1的速率進行兩次分批進料發酵，分別得到O. 0271Γ1和O. (MOtT1的生長速率。當生長速率限制為O. 0271Γ1時，酶的體積活性和比活性是分批發酵時的3. 8和3. 3倍。在生長速率為O. 027^'時脂肪酶的體積活性是生長速率為O. (MOtT1時得到的脂肪酶的體積活性的I. 7倍。與在連續發酵中，當生長速率由O. 0391Γ1降至O. 0241Γ1時，得到的脂肪酶體積活性增加I. 9倍相比，上述結果是有利的。當生長速率通過O. 0351Γ1的指數進料進行限制時，甘露聚糖酶的體積活性和比活性是分批發酵時的2. 7倍和2. 9倍。利用低於O. 045^:的指數進料速率將酶的比活性最大化的能力可通過一旦達到高的生物質濃度時將進料速率由O. 0561^降低至O. 0351^時而開發出。這將使得在hp4d啟動子調節下在解脂耶羅維亞酵母中得到高的酶的比生產率和體積生產率。在該報導中呈現的數據表明，在hp4d啟動子調節下進行的酶的生產可以在生產生物質期間而啟動，通過使用指數進料策略限制生長速率。參考文獻Bailey MJ, Biely P, Poutanen K(1992)Interlaboratory testing of methodsfor assay of xylanase activity. J Biotechnol 23:257—270。Fickers P，Benetti P-Hj WacheY, Marty A, Mauersberger S，Smit MS, NicaudJ-M(2005)Hydrophobic substrate utilization by the yeast Yarrowia lipolytica, andits potential applications. FEMS Yeast Res 5:527—543。Juretzek T，Le Dall Mj Mauersberger Sj Gaillardin Cj Barth G，NicaudJ-M(2001)Vectors for the expression and amplification in the yeast Yarrowialipolytica. Yeast 18，97-113。Madzak Cj Gaillardin Cj Beckerich J-M (2004)Heterologous proteinexpression and secretion in the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica. JBiotechnol 109:63-81。Miller GLj Blum Rj Glennon WE, Burton AL (1960) Measurement ofcarboxymethylcellulase activity. Anal Biochem 2:127-132。
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權利要求
1.一種在解脂耶羅維亞酵母中表達多肽的方法，該方法包括步驟 使解脂耶羅維亞酵母發酵，該酵母已經多核苷酸轉化，所述多核苷酸在hp4d啟動子的控制下編碼多肽；和 在發酵期間將解脂耶羅維亞酵母的生長速率限制為低於O. 045h-1o
2.權利要求I所述的方法，其中所述生長速率限制在約O.0231Γ1至約O. (MOtT1的範圍內。
3.權利要求2所述的方法，其中所述生長速率限制在約O.0351Γ1至約O. 0391Γ1的範圍內。
4.權利要求3所述的方法，其中所述生長速率限制在約O.0351!'
5.權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述生長速率通過控制加入至含解脂耶羅維亞酵母的發酵溶液中的食物源的量進行限制。
6.權利要求5所述的方法，其中所述食源為碳酸源和/或氮源。
7.權利要求1-6中任一項所述的方法，其中發酵通過分批發酵、分批進料發酵、反覆分批進料發酵或連續發酵中的任意一種而進行。
8.權利要求7所述的方法，其中所述發酵為分批進料發酵。
9.權利要求7所述的方法，其中所述發酵為反覆分批進料發酵。
10..權利要求7所述的方法，其中所述發酵為連續發酵。
11.權利要求ι- ο中任一項所述的方法，其中多肽的生產水平與生長速率不受限制的對照組解脂耶羅維亞酵母相比而言增加。
12.用於在如權利要求1-11中任一項所述的方法中使用的解脂耶羅維亞酵母，該酵母已經多核苷酸轉化，所述多核苷酸在hp4d啟動子的控制下編碼多肽。
13.—種試劑盒，含有如權利要求12所述的解脂耶羅維亞酵母，所述試劑盒用於實施如權利要求1-11中任一項所述的方法。
全文摘要
本發明涉及一種在hp4d啟動子調節下在解脂耶羅維亞酵母中製備蛋白質、優選外源蛋白質的方法。具體而言，本發明描述了一種通過調節碳的供應和/或氮的供應而調節解脂耶羅維亞酵母的生長速率的方法。發現生長速率小於0.045h″l對於增加解脂耶羅維亞酵母生物質和增加所生產的感興趣的外源蛋白質的量而言是最優的。
文檔編號C12N15/81GK102985547SQ201180026291
公開日2013年3月20日 申請日期2011年5月26日 優先權日2010年5月28日
發明者彼得勒斯·雅各布斯·范澤爾 申請人:Csir公司