新的10-羥基脫鎂葉綠素a的製作方法

2023-09-14 20:31:40 3

專利名稱：新的10-羥基脫鎂葉綠素a的製作方法
技術領域：
本發明是關於新的10-羥基脫鎂葉綠素a(以下有時稱之為「CpD-Ⅰ」)和其藥學上可接受的鹽，以及該化合物的製備方法。本發明還涉及含有作為活性成份的上述化合物的光敏劑組合物，以及利用上述光動力治療癌症的方法。
近年來，「光動力療法(PDT)」已引起醫學界的興趣和關注，所謂「光動力療法(PDT)」是指利用光化射線殺死腫瘤細胞的療法。T.J.Dougherty已報導了具有代表性的這種光動力療法。此光動力療法包括使用光敏劑，該光敏劑被優先吸收在實心腫瘤生長迅速的組織部分。光敏劑一旦被注入，便富集在腫瘤部位周圍。然後對腫瘤施用光敏劑本身固有的最大吸收波長的光，以便選擇性地殺死腫瘤細胞而不損傷腫瘤細胞周圍的健康細胞[參見T.J.Dougherty等人，Cancer Res.38，PP.2628-2635(1978)]。
利用光動力療法治療癌症時，關鍵在於選擇所用的光敏劑。光敏劑應具有優先與腫瘤細胞結合併發射螢光的特異性。通過利用這些性質可以定位癌症細胞。當光敏劑注入被檢查的身體體內，然後在身體內放置內窺鏡後，很容易觀察到螢光部位，即腫瘤細胞生長部位。
照射時，處於基態的光敏劑吸收光。光敏劑的光激發態向體內的分子氧轉移能量，產生單線態氧。單線態氧氧化各種生物化合物，包括細胞結構組分如甾族化合物和具有不飽和醯基鏈的磷脂，胺基酸如色氨酸，組氨酸，光胱氨酸和蛋氨酸;以及核酸組分如鳥苷和胞苷等等。因此，一旦單線態氧與腫瘤細胞作用，它將通過氧化腫瘤組織的細胞組分殺死腫瘤細胞。
如上所述，光動力療法可用於癌症的診斷和治療領域。光動力療法優於其它類型的治療方法。這種治療方法具有良好的治療效果和很寬的應用範圍，因為即使是處於任何偏遠部位的腫瘤(不管是什麼腫瘤)也可以通過光穿過內竊鏡而得到成功地治療。這種治療方法還具有另一優點，即它對於正常細胞只產生較小的副作用，因而可重複施用。
迄今為止，已經開發了大量光敏劑，其中既有天然的也有合成的。這些光敏劑包括補骨脂靈、黃素、卟啉、吖啶、吩噻嗪、呫噸、醌、多烯、滷代芳族化合物，以及無機離子[參見J.D.Spikes和R.Livingston，Advances in Radiation Biology，Vol，Ⅱ，PP.29-121(1969)]。許多這種光敏劑現已被作為光動力抗腫瘤劑用於臨床試驗。少量光敏劑已可從市場上買到用於PDT。其代表性實例包括血卟啉衍生物(HpD)(由The Quadra Logic Technology Inc(Vancouver，Canada)出售，商品名稱為「Photofrin-Ⅰ」，一中聚血卟啉的醚和酯的混合物，和「Photofrin-Ⅱ」，一種更純的產品。
本發明的發明者集中進行了一系列試驗，以便尋求一種具有良好治療效果的有效的光敏劑，結果發現從蠶提取物中分離出的新的脫鎂葉綠素衍生物能極大地改進光敏性，從而完成了本發明。
因此，本發明的目的是提供新的脫鎂葉綠素衍生物，該衍生物可作為光敏劑用於光動力療法治療癌症。
本發明的另一目的是提供製備本發明新的脫鎂葉綠素衍生物的方法。
本發明又一目的是提供光敏劑組合物，它包括作為活性成分的本發明新的脫鎂葉綠素衍生物，和與其混合和結合的常用組分，如載體，賦形劑，膨脹劑等等。
本發明再一目的是提供用本發明新的脫鎂葉綠素衍生物光動力治療癌症的方法。
本發明的其它目的通過閱讀說明書的其餘部分將十分清楚。
附

圖1A和1B表示各種蠶提取物，波菜和桑子的薄層色譜(TLC);
附圖2A，2B和2C表示附圖1A和1B中所描繪的帶2的反相高效液體色譜(HPLC);其中附圖2A表示在螢光房間燈下曝光幾小時後的帶2的反相高效液體色譜，它表示由CpD-1光轉換得到CpD-2;附圖2B表示在燈下曝光5分鐘後帶2的反相高效液體色譜;附圖2C表示未經曝光的帶2的反相高效液體色譜;
附圖3A表示CpD-1和葉綠素a的各自1H-NMR光譜，其中箭頭指示C10-OH和C10-H的位置;
附圖3B表示CpD-1(CpD-1與重水(D2O)混合)和葉綠素a的1H-NMR光譜，與CpD-1混合的重水是用於測定C10-OH的1H共振;
附圖3C表示CpD-1的13C-NMR光譜;
附圖3D表示CpD-1的1H二維COZY NMR光譜;
附圖4表示CpD-1的傅利葉變換紅外光譜;
附圖5表示在295°K下1，3-苯基異苯並呋喃(DPBF)最大初始光氧化速率時產生的單重態氧數量的圖表;
附圖6表示腫瘤和正常細胞中CpD-1和HpD的可吸收性;以及附圖7A和7B表示用CpD-1和HpD分別處理人體T-4淋巴瘤細胞系(MOLT-4)和人體末稍血液淋巴細胞(PBL)，然後曝光於紅光(附圖7A)和黃光(附圖7B)後上述細胞的存活百分率。
本發明提供了具有下式的新的10-羥基脫鎂葉綠素或其藥學上可接受的鹽
本發明的脫鎂葉綠素衍生物能夠高產率產生光激化單重態氧，與其它常用光敏劑比較，在腫瘤組織中顯示出更好的選擇吸收。此外，在對試驗動物的選擇破壞癌細胞和治療腫瘤效率方面，本發明光敏劑比其它常用光敏劑更優越。
本發明化合物結構類似於葉綠素a，但仍具有結構特徵，即葉綠素a中Mg++和C10位上氫原子分別被兩個氫原子和羥基取代。
據發明人所知，本發明的10-羥基脫鎂葉綠素是結構還未被確定過的新化合物，在體內和體外試驗中還未被用作光敏劑。
式(Ⅰ)化合物可轉換成其無毒鹽，即按照任何常規方法得到的其藥學上可接受的鹽。所述無毒鹽包括式(Ⅰ)化合物的無機鹽，如其金屬鹽，無機酸鹽及有機鹽。金屬鹽包括鹼金屬鹽如鈉鹽，鉀鹽等，以及鹼土金屬鹽，如鈣鹽，鎂鹽等。無機酸鹽可包括氫氯酸鹽，氫溴酸鹽，硫酸鹽，磷酸鹽等等。有機鹽可包括有機胺鹽，如三甲胺鹽，三乙胺鹽，吡啶鹽，普魯卡因鹽，甲基吡啶鹽，二環己基胺鹽，N，N-二苄基-1，2-乙二胺鹽，N-甲基葡糖胺鹽，二乙醇胺鹽，三乙醇胺鹽，三-(羥甲基氨基)甲烷鹽，苯基乙基苄胺鹽，二苄基乙二胺鹽等等。無毒鹽還包括有機羧酸或磺酸鹽，如甲酸鹽，乙酸鹽，馬來酸鹽，酒石酸鹽，甲磺酸鹽，苯磺酸鹽，甲苯磺酸鹽等，以及與鹼性或酸性胺基酸如精氨酸，天冬氨酸，穀氨酸，賴氨酸等形成的鹽。
本發明還提供了製備本發明的新的脫鎂葉綠素衍生物的方法，包括步驟(a)用適宜溶劑從蠶提取物中提取葉綠素代謝物;
(b)將提取得到的物質溶解在適宜溶液中，至過飽和;
(c)經色譜法，從所得溶液中分離光敏劑組分;以及(d)收集表現出強光敏作用部分，隨後用常規方法純化。
蠶提取物的提取(步驟(a))可按照常規溶劑提取法進行，對於溶劑，可使用本專業已知的任何溶劑如酮，醇，及其混合物。提取出的物質然後溶解在適宜溶劑中，得到一超飽和溶液(步驟(b))。任何溶劑均可用於溶解固體提取物。然而，為有效溶解，優選叔丁醇，丙酮和戊烷的混合物。所得溶液然後經色譜法，分離溶解在提取液中的固體組分(步驟(c))。本專業已知的任何製備色譜，如液相色譜(LC)，薄層色譜(TLC)，及其它類形色譜均可使用。分離完之後，收集具有強光敏性的部分，然後用常規純化方法純化(步驟(d))。本發明優選使用高壓液相色譜(HPLC)。
分析所得產物，確定其化學結構。可使用本領域已知的任何分析方法，如紅外光譜(IR)，傅利葉轉換紅外光譜(FT-IR)，紫外光譜(UV)，旋光色散和圓二色性光譜，螢光測定法，閃光光譜，質譜，核磁共振光譜等。
另外，式(Ⅰ)化合物也可通過利用葉綠素a作原料，用化學方法合成。製備式(Ⅰ)化合物的合成方法包括下述步驟(a)將葉綠素a於室溫下，在乙醇或氯仿中與HCl反應，脫去其中的Mg離子;
(b)在室溫和暗淡的安全燈或黑暗情況下，向所得溶液中緩慢鼓入空氣一天或更長時間，用羥基基團取代C10位上氫原子;和(c)將所得產物按常規方法純化。
原料葉綠素a可用已知方法從任何適當原料得到，但優選使用富含葉綠素的海藻，Spirulina platensis作為葉綠素a的原料。這種合成方法優點在於適合大規模成批生產CpD。
本發明上述部分儘管只描述了單個式(Ⅰ)化合物，但應當知道，對於同類化合物，用其它取代基取代其中取代基的改進足能夠進行的，參見G.N.La Mar，"Model Compounds As Aids In Interpreting NMR Spectra of Hemoproteins"in Biological Applications of Magnetic Resonance，R.G.Shulman Ed.，pp.305-343(1979)，Academic Press，New York;and J.D.Satterlee，"NMR Spectroscopy of Paramagnetic Haem Proteins"in Annual Reports On NMR Spectroscopy，G.A.Webb Ed.，pp.84-85(1986)，Academic Press，New York。根據這些先有技術，利用本領域已知的常規方法很容易設計和合成大量具有與式(Ⅰ)化合物不同的取代基的類似物，因此，本發明還包括具有下式結構的10-羥基-脫鎂葉綠素a類似物
其中，R1、R3、R4、R5、R6和R8代表C1-C3烷基醛或C3-C5環烷基;
R2代表C1-C3鏈烯基，以及R7代表
其中1，m和n各自代表1至3整數。
另一方面，提供了用於治療癌細胞的光敏劑組合物，包括活性成份式(Ⅰ)化合物或其藥學上可接受的鹽，和與其混合或結合的常用組分，如載體，賦形劑，膨脹劑，以及其它添加劑。
另一方面，本發明提供了光動力治療癌症的方法，包括給身體施用新的式(Ⅰ)脫鎂葉綠素衍生物或其藥學上可接受的鹽。
式(Ⅰ)脫鎂葉綠素衍生物可通過各種注射方法如靜脈內，肌內，皮下和腹膜內注射給入到人體內，日劑量為每千克體重5毫克至10毫克。
本發明由下述實施例更詳細說明。所述實施例僅用於說明本發明目的，而不應被認為限制在權利要求書中嚴格描述的本發明。
實施例1由蠶提取物製備CpD-1並確定其結構按照常規溶劑提取法，用丙酮從蠶提取物中提取葉綠素代謝物。作為比較，用波菜和桑子獨立重複相同的提取方法。
乾燥後，0.1g粗提取物溶於1ml叔丁醇，丙酮的戊烷的混合溶劑中(5∶60∶235V/V/V)，得到一過飽和溶液。將所得溶液按常規方法點到薄層色譜(TLC)塑料矽膠板上(20×20cm)(TLC塑料板，Art，5735，EM Science)。點完後，樣品帶在氮氣流中乾燥。將濾紙(25cm高)置於TLC展開槽內(30×28×10cm)，在展開之前20分鐘將與上述溶解用的相同溶劑倒入展開槽內，用真空脂密封蓋有蓋玻片的展開槽。展開時間為約40分鐘。所有操作均在黑暗或暗淡的綠光下進行。
結果見附圖1A和1B所示。參見附圖1A和1B，對于波菜和桑子，在展開色譜中沒有出現第二條帶(「帶2」)。體內試驗表明帶2具有極好的光敏性。
將帶2從TLC板上小心刮下，並且丙酮提取。洗脫液然後在氮氣流中蒸發，保存殘渣，以便進一步純化。
隨後，按照常規方法用反相HPLC，所用儀器為ISCO型2350 HPLC，2360型梯度程序器，UV-5吸光/螢光監測器(ISCO，Inc)，以及C-18 Dynamax-300 (1×25cm)柱(Rainin Instrument Company，Inc.)。HPLC操作條件如下流速1.7ml/min，流動相35%甲醇和65%乙腈，梯度從80%流動相和20%水到100%流動相歷時25分鐘。
使用具有吸光度約為7.0(600nm)的200μl注射體積樣品(約25μg)。每次操作時間設置為約80分鐘，監測660nm處吸光度並儲藏於微機中。自動收集各峰。得到如附圖2A-2C中描述的P1、P2、P3和R4四組峰。
參照附圖2A-2C，附圖2A表示帶2在螢光房間燈曝光幾小時後的反相HPLC曲線;附圖2B表示帶2在燈下曝光5分鐘後的反相HPLC曲線;附圖2C表示未曝光的帶2的反相HPLC曲線，對應於第三個峰(P3)的主要組分為CpD-1，當在燈下曝光後，CpD-1被氧化成CpD-1的異構體CpD-2，對應於第二個峰(P2)。
由此得到的高純度CpD-1通過利用FAB/MS，1H-維和兩維COZY NMRS，13C NMR，和FT-IR來確定其結構。
附圖3A表示CpD-1和葉綠素a的1H-NMR光譜，其中箭頭分別表示CpD-1和葉綠素a中C10-OH和C10-H的位置。CpD-1和葉綠素a的化學位移列於下面表1中。附圖3B表示CpD-1，與重水(D2O)混合的CpD-1和葉綠素a的1H-NMR光譜。附圖3C和附圖3D分別表示CpD-1的13C-NMR光譜和CpD-1的1H兩維COZY NMR光譜。附圖4表示CpD-1的FT-IR光譜。
根據上述圖表，可以確定CpD-1的結構，其中葉綠素a中的Mg++被兩個氫原子取代，C10位上氫原子被OH取代。
表1(δ，ppm)＊1H** 葉綠素a CpD-1α 9.61 9.75β 9.47 9.59δ 8.63 8.752a 8.00 8.032bt6.29 6.312b*6.20 6.2210-H/OH 6.27 5.57P2 5.14 5.22P1 4.49 4.568 4.44 4.537 4.24 4.204a 3.87 3.7710b 3.87 3.763a 3.70 3.601a 3.41 3.445a 3.26 3.297a12.64 2.957b12.48 2.567a22.34 2.267b22.34 2.26P4 1.88 1.914b 1.81 1.70P3a 1.70 1.618a 1.57 1.10P15 1.49 1.49P(CH2)*→1.24 1.24P15a P16 0.84 0.84P7 P11 0.78 0.79附註＊ 所用溶劑CDCl3＊＊ 位置按Fischer編碼體系表示。
實施例2合成CpD-1將約40g乾燥海藻(Spirulina platensis，購自墨西哥城)浸入到含有500ml甲醇的1L燒瓶內，向其中加入5ml0.01MKOH。在黑暗情況下，向所得溶液緩慢鼓入空氣6天，然後在約50℃回流15分鐘。所得溶液通過漏鬥中濾紙過濾，接著倒入100ml甲醇漂洗殘餘物質。濾液然後用1ml濃HCl處理3分鐘。用旋光蒸發器(Buchi，Switzerland)蒸發所得溶液至體積少於30ml。然後向產生的物質內加入200ml ddH2O和200mlCCl4。分離後，有機相用200ml ddH2O洗滌兩次，放棄水相。有機溶劑通過蒸發進一步除去，所得殘餘物溶於約20mlCCl4中，得到粗提取液。
將約60g230至400目矽膠(Sigma Chemical Co.)浸入到CCl4中，然後聲波處理5分鐘。柱子用2.5內徑(cm)玻璃管填充，並用CCl4預平衡。按同樣條件填充第二根和第三根矽膠柱。填充入粗提取液之後，注入約50ml CCl4淋洗粉紅和黃色物質。然後注入含20%丙酮的CCl4溶液，洗脫10-OH脫鎂葉綠素a/含CpD的脫鎂葉綠素a組分。放棄柱中的殘餘物質，蒸發溶劑，殘渣再溶於15ml CCl4中用於第二次矽膠色譜。在樣品填裝到新矽膠柱內之後，用約50ml CCl4洗脫粉紅/黃色物質。然後用10%丙酮的CCl4洗脫目標CpD部分。同樣不能被10%丙酮的CCl4洗脫的剩餘物質丟棄。重複將溶劑從收集到的部分蒸掉，然後殘餘物溶於15ml CCl4。將從第二根矽膠得到的樣品填充到第三根矽膠柱內之後;先注入約150ml(足夠為止)含2%丙酮的CCl4溶液，洗脫非目標CpD(利用吸收光譜檢測)。接著將高達含5%丙酮的CCl4溶液滴加到流動相，洗脫含有10-OH脫鎂葉綠素a部分。乾燥所收集部分並在氮氣氛下黑暗保存，以便利用反相柱色譜進一步純化。上述操作在通風櫃中進行。
將製備型C-18反相柱(Chromosorb LC-1，Sigma Chemical Co.)填充在2.2內徑×12長(cm)可調玻璃管(Amicon)內。洗脫程序如下流動相50%乙醇，40%乙腈，和10%CCl4注入樣品1ml約250μg CpD流速2ml/min檢測660nm吸收洗脫程序(1)從99%M.P.和1%水梯度洗脫15分鐘至100%M.P.
(2)100%M.P.洗脫13分鐘(3)20%CCl4的異丙醇溶液洗脫7分鐘(4)99%M.P.和1%水洗脫20分鐘。
注入後28分鐘洗脫出10-OH脫鎂葉綠素a部分。經TLC分析測定，所得產物純度大於95%。對於TLC，該產物展開的Rf值與蠶代謝物的粗提取物第二條帶相同。TLC分析條件與實施例1所述相同。
發明人通過確定NMR質子/碳譜測定了TLC色譜的帶1，經與10-OH脫鎂葉綠素a和葉綠素a比較，確定為脫鎂葉綠素a。在C-18柱上脫鎂葉綠素a的保留時間比10-OH脫鎂葉綠素a長，在上述洗脫條件下它們不能被分離。乾燥所得的10-OH脫鎂葉綠素a產物並在氮氣氛下黑暗中貯存。產率大於等於0.4%，以乾重海藻粉計算，假定葉綠素a100%被提取，(實際上每批葉綠素a的百分提取率都在變化)，該產率比從蠶提取物的粗提取物得到的CpD產率(0.04)高10倍。
實施例3單線態氧產率測定PDT光敏劑最大效率的最重要指數之一就是其通過從三線態光敏劑到分子氧能量轉移產生單線態氧的能力。有兩種獨立方法可以測量單線態氧的量子產率，見本實施例所述的方法Ⅰ和方法Ⅱ。光敏氧化方法(方法Ⅰ)使用1，3-二苯基異苯並呋喃(DPBF)作為單線態氧捕獲劑。根據DPBF螢光或吸光度的減少，測定光敏氧化速率，從而估算DPBF在各種光敏劑存在下的起始光敏氧化速率。起始光敏氧化速率與產生單線態氧的起始速率成反比。
方法Ⅰ相對DPBF的光敏氧化使用632.8nm氦-氖雷射器(最大輸出20mw，Metrologic Instruments，Inc.)作為輻射源，激發樣品溶液。使用新製備的DPBF(在黑暗中於氮氣氛下重結晶)的乙醇溶液，濃度利用420nm，ε＝22，500cm-1M-1檢測。在含有總量為2ml溶液的密封比色皿中，各種光敏劑在632nm幾乎具有相同的吸光度。將經溶劑預飽和的氧氣緩慢鼓入溶液中，歷時20分鐘，然後將少量等分不同濃度的DPBF與溶液混合。測量DPBF在455nm(乙醇)和465nm(CCl4)處螢光強度的減弱與照射時間的關係，確定DPBF的起始光敏氧化速率。
方法Ⅱ直接發光方法為了直接檢測單線態氧，測量近紅外磷光。使用Q-開關NdYAG雷射器(Quantel，YG-571-C)，在355nm處激發。蠶CpD和葉綠素a樣品溶解在空氣飽和的乙醇-OD中，通過調節在355nm處吸光度至約0.55，使樣品濃度基本相同。
根據倒數交叉，由1/速率對1/[DPBF]的雙倒數坐標圖求出最大起始速率(附圖5)。葉綠素a在乙醇中的單線態氧的量子產率(Φ△，X，乙醇)由最大初始速率，相對於已知的葉綠素a在四氯化碳中的單線態氧的量子產率(Φ△，ch1＝0.57，CCl4)，按下述公式(Ⅰ)計算φΔ,x=φΔ,chl (Achl·[RATEmax]x)/(Ax·[RATEmax]chl) (1)公式(1)也可用於計算各種光敏劑在乙醇中的量子產率。結果列於下述表2和附圖5中。根據這些結果，可以確定CpD-1的單線態產率高於葉綠素a。CpD-1顯示出比HpD高20%產率。
表2單線態氧產率(Φ△)按相對DPBF光敏氧化(方法Ⅰ)和直線發光方法(方法Ⅱ)測量方法 參數 葉綠素a CpD-1 CpD-2I φΔof 0.44 0.50 0.52(DPBF)oxII 相對IΔ 1.00 1.01±0.05 1.09±0.04τΔ(μsec) 30.5±0.8 31.6±0.4 28.9±1.1相對φΔ 1.00 1.05±0.06 1.16±0.05φΔ 0.44 0.46±0.03 0.51±0.02
實施例4CpD-1在腫瘤和正常細胞中的吸光能力利用人體T-4淋巴細胞系(MOLT-4)作為比較標準腫瘤細胞，新製備的人體末梢血液淋巴細胞(PBL)作為比較標準健康細胞，評估CpD-1和HpD的細胞吸收作用。
向1×106細胞中分別加入含有10μg/ml CpD-1和HpD的1ml光敏劑溶液，並在圓桶內培育30至210分鐘。培養物在0℃，2，000rpm下離心5分鐘。沉澱出的細胞片用涼生理鹽水洗滌，然後再次離心。向沉澱物中加入400μl DMF。室溫振動所形成的混合物並在4℃離心，取300μl上層清液並用作細胞提取液。
向300μl細胞提取液中加入200μl蒸餾水和500μl 1N鹽酸，使其達到1ml。分別測定在660和550nm處的CpD-1和HpD的吸光度。並將測量結果與標準溶液在預定的波長下的吸光度比較，求出試驗光敏劑在細胞中的吸收量。
結果見附圖6所示。從附圖6中，可以看出在細胞中的吸收量隨培養時間增長而增加，與卟啉和試驗細胞種類無關，在MOLT-4中吸收量大於作為比較標準健康細胞的人體末梢血液淋巴細胞(PBL)中的吸收量。在使用相同的試驗細胞下，CpD比HpD顯出較大的吸光度。綜上所述，可以確定在腫瘤細胞部位CpD-1優先被吸收，其定位效果比HpD高兩倍多。
實施例5選擇破壞腫瘤細胞(體外試驗)利用與上述實施例2中相同的腫瘤和健康細胞，評估CpD-1的選擇破壞能力。
將CpD-1注入到各含有1×106細胞的腫瘤細胞和健康細胞內。然後將由此處理過的細胞在紅光下照射10分鐘。作為對比的光敏劑，用HpD代替CpD-1注入重複相同步驟。光照之後立即計算8小時內每間隔1小時時的細胞存活百分率。結果見附圖7A所示。
已發現經CpD-1處理並被紅光照射過的MOLT-4在光照之後2小時內能夠完全被殺死，而經CpD-1處理並被CpD-1處理和照射過的PBL的存活率時間增長而減小，光照後8小時存活率達到69.4%。被HpD處理和紅光照射過的MOLT-4在光照後8小時時存活率為83.4%，而被HpD處理和紅光照射過的PBL在光照後8小時時存活率為91.4%。
重複上述相同步驟，但用黃色代替紅光照射MOLT-4和PBL。結果見附圖7B所示。
被CpD-1處理後的MOLT-4的存活率隨時間增加而減小，黃光照射後8小時時存活率為2.7%，而被CpD-1處理後的PBL在黃光照射後8小時時存活率為81.5%。被HpD處理後的MOLT-4在黃光照射後8小時時存活率為58.2%，而被HpD處理後的PBL在黃光照射後8小時時的存活率為83.3%。
這些結果說明CpD-1在長波(紅光)比短波(黃光)顯示出較高的細胞毒性。與皮相反，HpD在黃光下比在紅光下顯示較高細胞毒性。即便如此，HpD的細胞毒性還是遠小於CpD-1。總之，相對於CpD-1來說，HpD並不十分有效。
綜上所述，可以確定就選擇性腫瘤破壞而言，CpD-1優於HpD。
實施例6對鼠皮膚瘤的治療效果(體外試驗)雌性C3H/HeJ鼠(體重約20g)和BA乳房癌用於本實驗。通過注射1μl BA乳房癌片到受體鼠的後脅腹內，導入皮下瘤。當腫瘤生長至直徑6-7mm(移植後約10天)，施用PDT治療。
在該PDT治療過程中，包含有12隻鼠的第1組被注入兩種不同劑量CpD，注射後24小時，用兩種不同光劑量的光照射。
從第1組的12隻鼠中取出6隻，用0.2ml儲液2處理(5mg/Kg)，然後用670nm光照射24小時。6隻鼠中，其中3隻接受總光劑量為100J/cm2，另外3隻接受300J/cm2。其它6隻鼠被注入較大劑量儲液2(0.4ml)(10mg/Kg)，並在CpD注入後24小時光照射。同樣，其中3隻鼠接受100J/cm2光劑量，另外3隻鼠接受300J/cm2。這樣，在相同條件下，每3隻鼠構成了接受PDT治療次小組。
在由12隻鼠組成的第2組的PDT治療的分離裝置中，施用同樣的PDT條件，但只是在CpD注入4小時開始光處理。上述結果分別列於表3和表4中。
表3注入CpD-1後24小時時的PDT治療結果CpD劑量 光劑量 鼠數量 毒性 再生長 治癒(mg/Kg) (J/cm2)5 100 3 - 3 -5 300 3 1 死 - 210 100 3 - - 310 300 3 2 死 - 1表4注入CpD-1後4小時時的PDT治療結果CpD劑量 光劑量 鼠數量 毒性 再生長 治癒(mg/Kg) (J/cm2)5 100 3 - 3 35 300 3 1死,2 - 21失去腳10 100 3 3 死 - -10 300 3 3 死 - -實施例7對惡性腫瘤的治療效果(體外試驗)通過腹部皮下注入，對ICR鼠給用S-180細胞，從而誘導產生5-10mm大小的惡性腫瘤。S-180細胞通過在ICR鼠體內長時間培養肉瘤誘導細胞系-Sarcoma 180得到。
將試驗鼠分為兩組，各組分別用CpD-1和HpD處理。這樣處理後的兩組再一分為二，得到總數4組。其中四組中的兩組用卟啉具有最大吸光度的波長的光照射兩次，每次10分鐘。光照是先在用光敏劑治療後1小時時然後在24小時時進行。四組中的另一兩組用相同波長的光照射兩次，每次10分鐘，光照是先在用光敏劑治療後24小時時然後在48小時後進行。
先在注入CpD-1後1小時時，然後在24小時時光照兩次的組顯示100%治癒率(治癒數量/總治療數量＝20/20)，而用HpD處理的組顯示80%治癒率(16/20)。這些結果說明與HpD相比，CpD-1具有較高光敏化能力(P＜0.025)。
同樣，先在注入CpD-1後24小時時，然後在48小時時光照兩次的組顯示60%治癒率(12/20)。而用HpD處理的組顯示80%治癒率(16/20)。根據這些結果(P＞0.1)，可以推斷CpD-1在腫瘤細胞中保留時間很短，因此即使在相對較短的時間內，對經CpD-1處理的有病人再次光照射，第二次光照作用也很小。至於HpD，由於HpD第二次細胞毒性作用如潮紅，浮腫和皮膚疼痛，經受光動力治療的病人不得不與光隔離至少24小時。[參見Photobiology of Porphyrins，In Doiron DR，Gomer CJ eds.，Porphyrin Localization and treatment of tumors，New York，Alan R Liss Inc.，1984，pp.19-39]。
上述的實驗結果揭示出CpD-1在各方面均優於HpD，可以有效地作為治療腫瘤細胞的光敏劑。
實施例8對腹腫的治療效果(體外試驗)通過腹部皮下注入，對ICR鼠給用S-180細胞，誘導腹腫，並將鼠分為五組。每組包括10隻鼠。根據鼠體重隨處理時間的增長而增加情況，評估CpD-1對腹腫的治療效果。
各組分別在注入S-180後第6天(第一組)，第13天(第二組)，和第20天(第三組)用CpD-1處理，然後分別在注入CpD-1後24小時，48小時和72小時時光照射三次，每次10分鐘。第四組用CpD-1處理但不光照。第五組不用CpD-1處理。
在上述處理後多於50天的期限內，如果被處理鼠與第五組的體重增加基本相同並仍然活著，則鼠被認為是完全治癒。對於第一組，8隻鼠被完全治癒。對於第二組，僅有3隻鼠被完全治癒，而剩餘7隻在35天內由於體重的繼續增長死亡。對於第三組，所有鼠在35天內由於體重的繼續增長而死亡。同樣，對於第四組，所有鼠在35天內由於體重的迅速增長而死亡，鼠死亡時的重量比其初始重量約重兩倍。
上述研究出說明對於較小的腫瘤部位，腫瘤的清除率較高。可以斷定利用PDT方法，CpD-1可用於治療腹腫。
實施例9對逆病毒的逆轉錄酶的抑制效果首先製備傳染性Gross白血病病毒(GLV)的五倍稀釋溶液。其中GLV是通過在培養基中培養從患者有白血病的C3HeB/Fe老鼠中得到的TGV細胞系而得到(參見Machala O，Bodyd R，Youn JK，and Barski GLong-term in Vitro culture of pathogenic Gross Leukemia Virus in mouse thymusCells，Eur.J.Cancer 10，467-472，1974)。所得溶液用CpD-1處理，然後光照射。逆轉錄酶產物通過評估病毒的毒性來檢定。
GLV被接種到1×105正常鼠胎細胞上，並在含有10%青黴素(100單位/毫升)，鏈黴素(100μg/ml)和胎牛血清的Eagle最低限度必需的培養基中培養24小時。加入CpD-1後接著光照射，培養物用胰蛋白酶處理並用錐蟲藍染色以便計算存活細胞。將通過超高速離心所得到的病毒顆粒用去汙劑研磨，並與活性混合溶液反應，該溶液具有測量3H dTTP與逆轉錄酶結合水平的能力。所產生的混合物被點樣到玻璃濾紙上，洗滌，乾燥，利用閃爍計數器測量放射性比度。
經CpD-1處理和光照射後的病毒顯出5000cpm或更小的放射性，對酶產物具有顯著作用(即減少)或對酶(逆轉錄酶)具有顯著的光動力作用，而沒有CpD-1處理但經光照射過的對比組顯示出大於40，000cpm放射性，同樣，經CpD-1處理和光照過的相同病毒對鼠胎細胞的傳染性減低。
根據這些結果，可以推斷CpD-1具有抗病毒活性。
如上所述，本發明10-羥基脫鎂葉綠素a以及藥學上可接受的鹽顯示出改良的光敏性和良好的腫瘤細胞可吸收性。此外，本發明化合物在選擇破壞癌細胞和單線態氧的生產能力方面優於其它常規光敏劑，尤其是HpD。因此本發明化合物適合在光動力療法應用中作為光敏劑。
權利要求
1.式(Ⅰ)10-羥基脫鎂葉綠素a或其藥學上可接受的鹽。
2.製備權利要求1中所述的脫鎂葉綠素a或其藥學上可接受的鹽的方法，包括下述步驟(a)用適當溶劑從蠶提取物中提取葉綠素代謝物;(b)將提取得到的物質溶解在適當溶劑中，至過飽和;(c)將所得溶液經色譜分離出光敏組分;以及(d)收集顯示強光敏作用部分，隨後按常規方法純化。
3.製備權利要求1中所述的脫鎂葉綠素a或其藥學上可接受的鹽的方法，包括下述步驟(a)室溫下，將葉綠素a與HCl在乙醇或氯仿中反應，脫去其中的Mg離子;(b)室溫下，在暗淡的安全燈下或黑暗中，向所得的溶液內緩慢鼓入空氣一天或更長時間，用羥基取代C10位上的氫原子;以及(c)將生成產物按常規方法純化。
4.一種用於光動力治療癌症的光敏劑組合物，包括作為活性成分的在權利要求1中所述的10-羥基脫鎂葉綠素a或其藥學上可接受的鹽，和與其混合或結合的常規組分如載體，賦形劑，膨脹劑以及其它添加劑。
5.一種通過體內給用權利要求1中的10-羰基脫鎂葉綠素a或藥學上可接受的鹽的光動力治療癌症的方法。
全文摘要
本發明提供了式(1)10-羥基脫鎂葉綠素a或其藥學上可接受的鹽。這些化合物用作光動力癌症療法中的光敏劑。
文檔編號C07D487/22GK1074219SQ9211527
公開日1993年7月14日 申請日期1992年12月17日 優先權日1991年12月17日
發明者宋佖淳, 韓寶燮, 李元榮 申請人:第一製糖株式會社, 三星物產株式會社