截短gst蛋白熱誘導融合表達質粒及其製備方法

2023-09-14 23:18:00

專利名稱：截短gst蛋白熱誘導融合表達質粒及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物工程技術領域，具體涉及採用日本血吸蟲菲律賓株26 kDa穀胱甘肽 -S-轉移酶(Sj26GST)核心蛋白(188胺基酸組成)作為短肽(8肽 18肽)生物合成載體， 專供抗原表位作圖定位及其表位基序鑑定用的大腸桿菌熱誘導GST188重組表達質粒 pXXGST-l和pXXGST-2及其製備方法。
技術背景蛋白分子上的線性B細胞表位(B cell epitope, BCE)是其抗原性的基礎。詳細地繪製 特定抗原的表位圖譜及精細鑑定其抗體識別基序，對蛋白質的結構和功能研究，對疾病的 診斷、定點修飾蛋白質分子以降低蛋白質藥物的免疫原性、設計無毒副作用的合成肽疫苗， 特別是研製充分有效的多表位合成肽疫苗具有科學和應用的意義。因此，對獲得其抗體的 已知蛋白進行線性表位基序鑑定，或製備特異抗體對靶蛋白抗原線性表位掃描作圖 (Epitope mapping) —直是蛋白質化學、醫學和分子生物學，特別是疫苗學領域內重要研 究內容之一。長期以來，抗原表位作圖或定位的技術一直在發展中。早期的表位鑑定主要用化學降 解或酶解蛋白質的方法，或水解抗原-抗體複合物，然後對用不同生化方法收集的短肽片段 進行蛋白印跡或ELESA檢測，也可進行HPLC/質譜分析或短肽胺基酸測序，最終確定表 位肽段或抗體結合位點。雖然有成功的實例，但它們操作十分繁瑣，影響結果判定的因素 也多，所以近年來很少採用。短肽化學合成技術的形成，特別是上世紀八十年代中期發展的聚苯乙烯針 (polypropylene pin)多肽合成技術(Gensen HM， et al. : Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single acid, Tfeti h""'園，81: 3998-4002， 1984)和聚苯乙烯網袋(polypropylene mesh bag)合 成技術(Houghten RA. : General method for the the rapid solid-phase synthesis of large numbers of peptides: Specificith of antigen—antibody interaction at the level of individual amino acids, 屍roc 7VaW〃誠 82: 5131-5135， 1985)的建立，，使抗體識別表位的鑑定有了很大的進展。前者的特點是肽合成過程大大簡化，後者的特點是該針洗滌完全，可重複使用，且針上的肽可直接轉入酶標板中進行ELESA測 定。這一化學合成肽探針掃描技術的最大優點是可合成覆蓋全長蛋白序列前後片段互有9肽或10肽重疊的18肽或20肽進行用ELESA方法的表位肽鑑定；在需精細BCE基序的場 合，則可合成覆蓋已鑑定的18肽的前後互有7個胺基酸殘基(aa)重疊的8肽片段，根 據與特異單抗反應的肽片段數確定最小表位基序，也能以丙氨酸殘基逐一取代BCE基序中 的殘基，確定該表位的關鍵殘基。雖然用化學合成肽方法仍然是目前BCE掃描鑑定的經典 方法，但由於肽合成費用高，檢測需要特殊儀器設備，因而限制了其廣泛應用。隨著分子生物學技術的進步，八十年代中期也建立了基因亞克隆表位鑑定法(Mehra V， et al. : Efficient mapping of protein antigenic determinants, 屍roc ;Va〃 y4cac/ 5"cj' 〃W， 83: 7013-7017， 1986)，。該方法的要點是將靶基因用DNA酶隨機切割成200 1 000鹼基大小不等的片段，並將它們亞克隆重組插入Xgtll表達載體，然後用特異的單抗 篩選免疫反應陽性的克隆並進行DNA測序，最後依據那些插入片段共有的核苷酸序列推斷 出該單抗識別的BCE基序。因為酶切條件不易控制，不易獲得足以比較推斷的BCE基序的 不同長度片段亞克隆，操作也繁瑣，所以應用該方法鑑定靶蛋白BCE的報導迄今屈指可數。至於表位掃描鑑定原理與化學合成肽法和基因亞克隆法相似的隨機化學合成肽庫法 (Jung G and Beck-Sickinger AG: Multiple peptide synthesis methods and their applications. *《，C力棚// t W 31: 367-486, 1992; Geysen HM and Mason TJ:Screening chemically synthesized peptide libraries for biologically-relevant molecules. Bioorg Med Chem Lett. 3: 397-404， 1993)和基因工程肽庫法/稱噬菌體表 位展示文庫法(Scott JK and Smith GP: Searching for peptide ligands with an epitope library. Science, 249: 386-390， 1990)，前者肽庫含有各種可能序列的短肽，方便用 單抗和多抗篩選，但結合肽需要測序分析；後者則是將編碼6肽/8肽的大量合成DNA片段 混合物重組插入噬菌體基因組，使之以融合蛋白形式表達在外殼蛋白的氨基端，再用生物 素或酶標記的抗體篩選特異的噬菌體，挑取陽性斑擴增後進行DNA測序推斷出胺基酸序列。 很顯然，它們的應用也存在很大的局限性，因為兩者建庫要求高、工作量大、成本高且表 位篩選鑑定麻煩，另外還需要肽庫質譜儀/測序儀，購買商品化的合成肽庫或噬菌體表達 肽庫費用也昂貴，所以這些因素均非普通實驗室或課題組所能面對或承受。另外，也有不少實驗室採用通過相關計算機軟體，分別從肽段親水性、分子接觸可及 性、肽鏈骨架可塑性以及電荷分步等角度預測抗原表位(H叩pTP， Woods KR: Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. /Voci\to/」ok/<Sci {778(6): 3824-8, 1981; Kyte J, Doolittle RP: A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J Mol Biol, 157(l):105-32， 1982; Welling GW， et al,: Prediction of sequential antigenic regions in proteins, f朋5"^e", 188(2) : 215-8, 1985; KarplusPA, Schultz GE: Prediction of chain flexibility in proteins. 7Viaft/rw/^"5r/za/加,72(2):212-213， 1985.)，然後根據預測結果化學合成相應肽段作為免疫原，繼而用免疫血清檢測其是否能 識別靶抗原。雖然預測合成肽能產生可識別天然抗原的抗血清，但已有資料表明該天然抗 原免疫血清未必一定存在可結合預測序列的抗體，換言之，計算機預測的表位序列存在不 確定性，需要進一步驗證。以上概述表明掃描鑑定抗原表位已有多種方法可供選擇，但由於這樣那樣的缺陷，或 存在技術和設備條件的限制，而且多數離不開需具備特異單克隆抗體(單抗)或抗天然抗 原多克隆抗體(多抗)的先決條件。因此，以上種種方法顯然都不適宜在一般實驗室的廣 泛應用。2004年為檢測抗hCG多表位嵌合肽抗血清中是否存在抗各嵌入BCE抗體，我們曾經構 建了在Stv蛋白羧基端插入的人絨毛膜促性腺激素(hCG)卩亞基三個不同BCE單表位短肽 (short peptide, SP)的pTSA18/Stv_SP重組質粒，結果IPTG誘導表達的單表位融合蛋 白用Western blot檢測都能被它們的單抗或多抗特異識別，進而提示可建立以一高表達 蛋白為載體的生物合成肽表位掃描鑑定技術[徐萬祥等.人絨毛膜促性腺激素(3亞基單一 B-細胞表位(p5、 p9或P8)融合蛋白的表達和純化.主激工^^學艱，20 (1): 49-53， 2004]。 隨後華榮虹等報導了利用IPTG誘導的pGEX-6P-l質粒表達GST-SP融合蛋白法，掃描鑑定 了嚴重急性呼吸症候群(SARS)冠狀病毒S蛋白的BCE[華榮虹等.SARS冠狀病毒S蛋白 受體結合結構域的表達及其表位作圖.生激眾學與主激#^^_^展，32 (11): 1030-1037， 2005]。根據我們多年實踐，無論是使用表達Stv或GST融合蛋白的pTSA18和PGEX_4T等重 組質粒，不加IPTG誘導的場合都時常有"洩漏表達"(Leaky expression)現象，這一情 況顯然妨礙我們對SDS-PAGE凝膠上Stv-8肽融合蛋白是否表達的判定，那樣勢必先需要 通過插入片段的DNA測序，才能確定所挑取一組陽性克隆是否是含目的插入基因編碼片段 的重組質粒克隆。因此為了節約測序所需的時間和費用(鑑定表位基序後對產生印跡反應 的克隆仍需要測序驗證)，也為了進一步檢驗118個殘基組成的Stv核心蛋白(Stvll8)是 否是合適的短肽融合表達的載體，我們構建了可表達融合短肽的熱誘導型pSY621/Stv-l 重組質粒(命名為pXXStv-1)和可作為檢測對照(僅表達Stv118)的pXXStv-2重組質粒 (已申請國家發明專利，申請號200710043264.5)。此專利申請中提供了用構建的 pSY621/Stv-l質粒表達系列短肽適用性，以及用抗重組靶蛋白多抗鑑定人卵透明帶蛋白線 性BCE基序可靠性的實例。相比前述目前應用最多的化學合成肽法，此生物合成(融合表達)肽表位鑑定法優點明顯，如用抗重組蛋白多抗也能開展表位掃描作圖；鑑定費用花費少，1個殘基的DNA 正負鏈片段合成費用僅約是1個殘基合成的1/20;操作相對更簡便，分子克隆、表達和蛋 白印跡鑑定等都是目前成熟的技術， 一般實驗室都能開展；構建的克隆能保存備用，鑑定 結果明確且可重複檢驗等。但生物合成肽表位鑑定法尚處於發展初期階段，仍然有許多需 要改進的地方，如短肽生物合成載體的選擇及其截取長度的確定等。 發明內容本發明的目的在於提供一種截短GST蛋白熱誘導融合表達質粒及其製備方法，以便實 現短肽的生物合成。建立抗原表位鑑定原理或特徵，與化學合成肽法和基因亞克隆法相似，但短肽合成花 費大幅度降低且操作更方便，因而適宜在大多數實驗室應用生物合成肽法，本發明選用由 188 aa組成的新型截短GST188蛋白為載體，在大腸桿菌熱誘導表達系統表達短肽融合蛋 白的pXXGST-l重組質粒，以及用作表達對照的熱誘導型pXXGST-2重組質粒，從而實現短 肽生物合成的目的，專供抗原線性表位掃描作圖定位以及表位基序鑑定用。本發明利用本專利申請人構建的pSY621原核表達質粒(圖1)和依據GST基因公開信 息，通過基因工程構建熱誘導pXXGST-l和pXXGST-2重組質粒，並用於進行短肽融合表達， 並驗證先前已鑑定的huZP3上一個線性BCE基序，它們的構建(製備)具體步驟如下(1) 設計PCR引物，從pGEX-4T-質粒中擴增出編碼GST蛋白H88基因的大片段，該 大片斷在5'-和3'-端分別帶BamH I和Sal I的限制酶酶切位點；(2) 利用DNA重組技術，將目的GST基因擴增片段插入用EcoR I和BamH I雙酶切 的pSY621質粒，獲得的pSY621-GST重組質粒轉化大腸桿菌宿主菌，在加Amp的LB平板 上挑取它們的重組克隆，進行DNA測序(上海聯合基因集團公司)；(3) 合成兩端為Sal I和Pst I粘性末端中間帶TAATAG雙終止密碼子的二條互補DNA 片段，將之退火復性後重組插入基因測序正確並經雙酶切的PSY621-GST中Sal I和Pst I 位點之間，連接液轉化TG1宿主菌，再次外送DNA測序驗證的重組質粒，命名為pXXGST-l， 其核苷酸序列為SEQ. ID. N03;(4)以pXXGST-1質粒為模板，用設計的一對PCR引物擴增在GST編碼基因3'-端後添 加TAA終止密碼子的GST188基因片段，用EcoR I和BamH I限制酶雙酶切的擴增大片段， 被重組插入用同樣二個酶雙酶切的pSY621質粒，測序正確重組質粒被新命名為pXXGST-2; 其核苷酸序列為SEQ.ID.N04，具體為pXXGST-1質粒的核苷酸的序列SEQ.ID.N03中GGATCCGTCGAC後|TAATAG l雙終止密碼子去除，但在GGATCCGTCGAC前插入一個 TAA終止密碼子；(5)基於先前用pXXStv(118)-1鑑定出huZP3"""'肽段中存在一個基序為ENWNAEK,184 的抗原表位結果(專利申請號200710043264.5)，再將以前合成的huZP3177—19°的相互各重 疊7個殘基的系列8肽編碼基因片段，將之退火復性後分別重組插入pXXGST-l的BamH I 和Sal I位點，抽取轉化菌TG1的pXXGST-1/短肽質粒，再次轉化大腸桿菌BL21宿主菌， 熱誘導後通過SDS-PAGE檢測各GST短肽融合表達，以此確認pXXGST-1/短肽重組子和各 GST-短肽的表達，最後用兔抗huZP3'77—348抗血清和兔抗huZP3172"87合成肽抗血清進行 Western blot試驗，確認先前表位鑑定結果和pXXGST-1用於短肽生物合成和抗原表位鑑 定的適用性。本發明提供的表達短肽融合蛋白的pXXGSG-1重組質粒和pXXGST-2重組質粒具有如下 特點1、 作為融合表達載體，在GST188羧基端連接不同8 18個殘基短肽，都能恆定高表 達(短肽融合蛋白表達量佔細菌總蛋白的10%左右，適合進行免疫印跡試驗)；2、 在未進行熱誘導的情況下，SDS-PAGE檢測基本上看不到細菌總蛋白中目的短肽融 合蛋白的洩漏表達現象；3、 在使用抗重組靶蛋白抗血清的情況下，產生的短肽(8肽或18肽)融合蛋白印跡 帶位於大腸桿菌二條分子量分別約為18 kDa和32 kDa的強抗原印跡帶之間，因而不會影 響印跡結果判斷；4、 同時使用僅表達GST188蛋白的pXXGST-2重組質粒，大規模進行抗原表位作圖和 表位基序精細鑑定的場合，可進一步降低抗原表位鑑定費用，即，構建好GST-短肽重組質 粒後，無需都進行DNA測序篩選重組子，可先挑選加氨苄青黴素LB平板上生長克隆進行 熱誘導表達，然後通過SDS-PAGE檢測它們是否表達了短肽融合蛋白(相對GST188對照 條帶，觀察8肽或18肽有無約大於1 kDa或2 kDa的特異條帶存在)，進而進行蛋白印跡 試驗。最終只需將產生印跡的克隆或特異表達條帶位置有疑問的克隆送測序。很顯然，如 此也節省系統表位掃描鑑定的時間和工作量。本發明的內容進一步具體描述如下本發明提供能在大腸桿菌宿主菌中高表達GST-SP融合蛋白的熱誘導表達質粒 pXXGST-l (圖2)，供抗原表位掃描鑑定選擇使用。pXXGST-l特點如下為了克服IPTG誘導型表達系統常常發生目的蛋白或融合蛋白"洩 漏表達"的情況，以利於挑取克隆經熱誘導後細菌總蛋白的SDS-PAGE初步鑑定，即便於 判定在氨苄青黴素(Amp) LB平板上挑取的克隆是非載體質粒自連產物，同時在免疫印跡 試驗中避免出現陰性對照也產生陽性結果，本發明選用了己經構建且能高表達外源蛋白的pSY621質粒(圖1)[沈芸，應康，徐萬祥，謝毅大腸桿菌高效表達載體pSY621的構建. 學叛(^^^^^^)，39(3):313 - 317, 2000]作為新構建重組pXXStv-l的載體質粒。 依據GST基因公開信息[Henkle KJ， et al. : Comparison of the cloned genes of the 26- and 28-kilodalton glutathione S-transferases of Schistosoma japonic咖and Schistosoma mansoni. 5ioc/ e/z/屍arasiZ^, 40(1): 23 — 34， 1990.]，〈乍為失豆月太融 合表達載體重組插入pSY621質粒的GST蛋白長度適宜，即，我們合成的GST核心蛋白基 因(編碼188 aa，包括N端增加的1個起始密碼子編碼的甲硫氨酸殘基)連同其C端BamH I酶切位點編碼片段編碼的甘氨酸和絲氨酸2個殘基，熱誘導後在SDS-PAGE凝膠上顯示約 22kDa分子量的短肽蛋白條帶(圖7，圖8)。如圖6所示，在誘導菌總蛋白的SDS-PAGE染 色凝膠上，連接分別相差1個殘基的7個系列重組克隆都穩定地高表達了 GST-8肽融合蛋 白(約佔細菌總蛋白的10%)，而它們未熱誘導的克隆則都未見"洩漏表達"條帶。圖7 則表明GST-huZP3'77—'"和GST-huZP3'78—185被印跡的條帶正好位於兩條大腸桿菌蛋白印跡特徵 條帶(約20kDa和31 kDa，用抗重組huZP3b蛋白抗血清的場合一般都會產生)之間，結 果易判斷。顯然在此位置，GST連接18肽(約增加l kDa)的印跡結果判斷也不會受到其 前後二條大腸桿菌特徵帶的幹擾。用抗huZP3172—187合成肽抗血清則無此問題，背景清晰(圖 8)。以上構建的pXXGST-1質粒另一特點是，在載體蛋白GST18編碼基因3'-端的Sal I - Pst I克隆位點後插入了 TAATAG終止密碼子，以避免生物合成的靶短肽後續過多殘基對特定抗 原抗體反應可能產生的幹擾(若欲排除Sal I鹼基編碼的Val和Asp兩個殘基，可將TAA 或TAG加在所合成靶短肽編碼基因片段3'-端後Sal I位點前，略增加6個DNA鹼基合成 費用)。在懷疑8肽前BamH I鹼基編碼的Gly和Ser殘基是否對鑑定的Gly-Ser後8肽表 位基序有影響(如圖7的情況)，可在8肽編碼片段的5'-端增加2或3個丙氨酸編碼鹼基 加以驗證。本發明還提供一個在GST188蛋白編碼基因3'-端尾BamH I前接上TAA終止密碼子而 形成的熱誘導型pXXGST-2質粒(圖3)。在掃描鑑定靶抗原表位的場合，它們表達的分子 量約22 kDa的GST188蛋白，可先用於確認所選用單抗、多抗或抗重組蛋白多抗與之有無 交叉反應；也可用作通過SDS-PAGE鑑定pXXGST-1是否表達GST-8肽融合蛋白(分子量相 差1 kDa，在電泳後染色凝膠上可清楚辨別)的對照。通過此方法鑑定陽性重組克隆，隨 後直接進行Western blot檢驗，以節約DNA測序費用和時間。本發明提供的熱誘導型pXXGST-1和pXXGST-2質粒，在它們的EcoR I和BaraH I或其 後其他克隆位點重組插入帶ATG起始密碼子的外源基因，可熱誘導直接表達其他目的蛋白。PXXGST-1質粒也可誘導表達與GST118融合的其他目的蛋白。另外，在無特異單抗或多抗 的情況下，以上GST熱誘導表達質粒也為靶蛋白表位掃描作圖提供了便利和實施可能性， 即可先通過PCR分段擴增2 3個靶蛋白編碼基因大片段，分別重組插入GST188質粒進 行融合蛋白表達，電泳割膠回收(乾燥研磨或電洗脫後)直接免疫動物。此外，以Stvl08 或Stvll8蛋白為載體(己另外申請發明專利)構建對應的2 3個靶蛋白編碼基因大片 段(表達產物用作檢測抗GST融合蛋白抗血清抗體滴度時的抗原)，並構建表達相鄰互有9 aa重疊的系列Stv-18肽融合蛋白，繼而用收集確認的抗GST-靶大片段抗血清，進行覆蓋 大片段蛋白序列的表位掃描作圖。必要的話，就確定的表位肽構建相鄰互有7 aa重疊的 系列Stv-8肽，作進一步最小BCE基序鑑定。(若選用Stv蛋白作為載體，融合表達靶蛋 白大片段後製備抗血清，抗體滴度測定和表位掃描鑑定則需要使用GST蛋白為融合表達載 體。這也就是為什麼需要另外構建GST熱誘導融合表達的原因。)本發明也提供了藉助PXXGST-1質粒驗證一 BCE基序的應用實例，g卩，用之表達相鄰 片段均重疊7 aa的系列GST-8肽融合蛋白，並用兔抗重組人卵透明帶-3(human zona pellucida-3， huZP3)蛋白177_348抗血清和兔抗huZP3172—187合成肽抗血清，確證了先前用 Stvl18-SPs鑑定的huZP3上一個線性BCE基序(EENWNAE178—184 )。


圖1為pSY621原核熱誘導質粒示意圖。 圖2為構建的pXXGST-l質粒示意圖。注圖中BamH I和Sal I為目的短肽編碼基因片段的重組插入克隆位點。 圖3為構建的pXXGST-2質粒示意圖。注與pXXGST-1質粒比較，不同點僅是Sal I位點後無TAATAG終止密碼子，並在GST188 編碼基因3'-端尾BamH I位點前增加一個TAA終止密碼子。圖4為huZP3m—19°系列GST188-8肽表達的SDS-PAGE檢測圖。1，預染蛋白分子量標準；2 15，未誘導和誘導的MEENWNAE177—184、 EE雨NAEK178—1S5、 E麗NAEKR》186、麗NAEKRS18。-187、 WNAEKRSP18'—188、 NAEKRSPT182-189和AEKRSPTF,柳誘導菌總蛋白。注圖中箭頭分別指示各表達的8肽融合蛋白。在細菌總蛋白上樣量基本一致的情況 下，未熱誘導對照欄都未見目的短肽融合蛋白明顯洩漏表達，熱誘導欄都能看到表達量基 本一致的靶短肽融合蛋白高表達。圖5為huZP3177—^系列GST-8肽表達的SDS-PAGE檢測(A)和用抗重組huZP3177—348抗 血清的免疫印跡(B)圖。1，未誘導的GST-MEE麗NAE177—184工程菌總蛋白；2，預染蛋白分子量標準；3 9，誘導的GST-MEENWNAE177-184、 -EENWNAEK178-185、 -ENWNAEKR179-186、-隨NAEKRS18。—187、 -WNAEKRSP"、 NAEKRSPT182—189和AEKRSPTF183—'9°工程菌總蛋白；10，誘導的GST188工程菌總蛋白。注圖5A中箭頭分別指示各表達的8肽融合蛋白。圖5B中在各目的8肽融合蛋白上 方均存在大腸桿菌抗原特徵印跡條帶，在特徵印跡條帶的下方，唯見3和4欄中箭頭指示 的MEENWNAE177—184和EENWNAEK'78—185融合蛋白與兔抗重組huZP3肽"，抗血清產生清晰的印跡 條帶，依據兩者共有殘基順序，可判定EENWNAE178—w基序為huZP3蛋白的一個線性BCE。圖6為huZP3'77—19°系列GST-8肽表達的SDS-PAGE檢測(A)和用抗huZP3172—187合成肽 抗血清的免疫印跡(B)圖。注各欄上樣蛋白樣品同圖5標註。表位鑑定結果與圖5的一致，但背景清晰，無 大腸桿菌抗原特徵印跡條帶。
具體實施方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而 非限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，均按照常規條件以及[美]J.薩姆布魯克和D. W.拉塞爾編著黃培堂等譯的第三版《分子克隆實驗室手冊》(科學出版社，2002)和[美]E.哈洛和.萊恩編著沈關心等譯的《抗體技術實驗指南》(科 學出版社，2002)中所述的步驟，或按照生產銷售商所建議的條件進行。 材料和方法1. 熱誘導表達質粒pSY621(圖1)和大腸桿菌BL21 (DE3)菌株由復旦大學遺傳工程國 家重點實驗室構建和保藏。2. 含GST (Sj26)編碼基因的pGEX-4T-2質粒購自Amersham Pharmacia Biotech公司。3. 限制性內切酶EcoR I、 BamH I、 Sal I和Pst I以及T4DNA連接酶購自日本TaKaRa Biotecchnology公司，Taq I DNA聚合酶為復旦大學遺傳工程國家重點實驗室產品，氨苄 青黴素(Amp)預染蛋白質低分子量標準、辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗(IgG /HRP)、 二氨基聯苯胺(DAB)和硝酸纖維素膜購自華美生物工程公司產品。4. QIApr印spin minipr印Kit質粒抽提試劑盒、QIAquick PCR產物純化試劑盒和 quick凝膠回收試劑盒購自德國QIAGEN公司。5. 兔抗huZP3a和huZP3b抗血清由上海市計劃生育科學研究所製備(徐萬樣，何亞 萍，洪愛真，季朝能，錢吉，王曙，謝毅.人卵透明帶蛋白huZP3a22—176和huZP3"，肽段 在大腸桿菌中的表達及其純化.4—遭^"_^^, 24:143-148, 2004;宋力雯,汪玉寶，倪崖,何 亞萍，洪愛真，Hinsch E， Hinsch KD,周思暢，袁玉英，石其賢，徐萬祥.人卵透明帶蛋白ZP3a和ZP3b肽段的免疫原性及其其抗血清體外研製人精子-半透明帶結合.主;^^j乾57: 682 - 688， 2005)和保藏。用與KLH載體蛋白偶聯的ZPC172—187合成肽免疫紐西蘭白兔，制 備了兔抗ZPC172—187合成肽抗血清。PXXGST-1和pXXGST-2重組質粒製備的具體步驟如下1. GST118基因片段擴增GST188核心蛋白編碼核苷酸順序序列見SEQ ID NO: 1。對應的GST核心蛋白的氨基 酸順序序列見SEQ ID NO. 2。先在計算機輔助下設計擴增GST'—188編碼基因的二條正負鏈PCR引物，然後以pGEX-4T-2 質粒為模板，用二條合成引物PCR擴增(在94。C預變性3 min， 94"變性35 sec, 55°。退 火35 see,完成35個循環後72。C延伸60 sec)兩端帶EcoR I和BamH I的GST188 (564 bp) cDNA片段，經15%瓊脂糖凝膠電泳初步鑑定後，用EcoR I和BamH I限制酶酶切上述 PCR擴增片段，走15%瓊脂糖凝膠電泳後割膠過柱回收備用；2. pSY621_GST188 (pXXGST-1)重組質粒構建 重組質粒pXXGST-1的核苷酸順序序列見SEQ ID NO. 3。第一步，用EcoR I和BamH I先後酶切pSY621，將雙酶切回收的GST188片段重組插 入pSY621質粒，連接液轉化感受態TGI宿主菌，挑抗Amp陽性克隆送DNA測序，繼而在3 ml的LB培養液中擴增培養測序正確的克隆，收集菌體抽提它的重組子質粒，用Sal I和 Pst I雙酶切備用；第二步，將在Sal I和Pst I粘性末端中間添加TAATAG雙終止密碼子的正負鏈合成 短片段退火復性，重組插入上述雙酶切質粒，轉化感受態TGl宿主菌後挑抗Amp陽性克隆 送DNA測序，繼而在3 ml的LB培養液中擴增培養測序正確的克隆，收集菌體抽提命名為 pXXGST-1的質粒，作為本發明製品放置於-20'C冰箱備用；3. pSY621-GST188 (pXXGST-2)重組質粒構建再次合成在GST188編碼基因3'-端引入TAA終止密碼子的一條負鏈PCR引物，借用前 述的目的基因擴增5'-端引物，PCR (條件同前)擴增以pXXGST-l為模板的兩端為EcoR I 和BamH I的GST188編碼基因片段，通過T4 DNA連接酶重組插入用EcoR I和BamH I雙 酶切的pSY621，連接液轉化感受態TGI宿主菌，在LB平板上挑取Amp抗性克隆送DNA測 序，分別轉接測序正確的克隆於含A即的3 ml LB液中擴增培養，抽取命名為pXXGST-2 重組質粒，作為本發明製品放置於-20'C冰箱備用；4. 用pXXGST-1和pXXGST-2質粒的短肽融合表達法的一個線性抗原表位的鑑定 如前所述，我們在申請號為200710043264. 5的發明專利申請書中，已用pXXStv(118) -1鑑定出huZP3172—'81肽段中存在一個基序為ENWNAEK178—184的抗原表位。在此利用先前合成的 覆蓋huZP3177—19°序列相鄰肽段重疊7 aa的8肽編碼基因片段(7對共14條正負鏈)，分別 兩兩退火復性，重組插入pXXGST-l質粒，以檢驗各GST188-短肽熱誘導高表達融合蛋白的 穩定性。同時用兔抗重組huZP3"7，蛋白和抗huZP3172—187合成肽抗血清，檢驗了以截短 GST188蛋白為載體，通過短肽生物合成進行線性抗原表位鑑定的可行性和可靠性。第一步，先將1或2個0D的互補正負鏈片段(兩端設計為BamH I和Sal I粘性末端) 用ddH20溶解成20 nmol/Vl儲存液(根據DNA合成報告單數據)；各取10 pl儲存液和20 ddH20於1. 5 ml Eppendorf管中，94。C水浴加熱5 min,自然降至室溫後，在15 pi反應體 積中吸入2 pi退火片段、1 pi約200 ng/^il經BamH I和Sal I雙酶切的pXXGST-1質粒、 1 pi T4 DNA連接酶和其1.5 ial連接緩衝液，於16匸保溫瓶中連接過夜；第二步，翌日連接液轉化感受態BL21 (DE3)宿主菌(也可轉化效率高的TG1宿主菌)， 塗布含Amp的LB平板上，於37'C培養過夜；第二天挑取氨苄LB平板上長出的單克隆，轉 接平板或擴增培養抽提質粒後外送進行DNA測序(此步可省略，只在蛋白印跡後，送相關 克隆進行DNA測序)，或於翌日晚各挑取二個克隆於含Amp的3 ml LB液中30'C振蕩培養過夜，翌日晨按 1/50比例再分別轉接於3 ml加Amp的LB液中振蕩培養，待菌體0D值達到約0. 5時，將 培養溫度調高至42。C熱誘導表達4 h，離心收集的菌體加上樣裂解液煮沸5 min，用於15 %SDS-PAGE檢測。以pXXGST-2克隆誘導表達的GST188條帶為對照，目的克隆表達條帶在 後且兩者相差約l kDa的，即可判斷其為GST-短肽重組克隆(特異表達條帶明顯大於約3 kDa的，可能是合成片段中少合成l bp，以致TAA讀框移碼)；第三步通過SDS-PAGE檢測或DNA測序確定GST-短肽重組克隆後，誘導表達的細菌 蛋白樣品上樣10 15pl (儘可能保持目的短肽表達量一致，以利印跡結果判斷)，同時走 15%SDS-PAGE，電泳結束後， 一塊凝膠用考馬斯亮藍染色(結果見圖5A)， 一塊進行硝酸 纖維素膜電轉移約1.5 2 h (100 mA)，用麗春紅染轉印膜2 h，在目的短肽融合蛋白條 帶處用針頭打孔標記，然後用水衝洗掉麗春紅染色；第四步印跡膜用PBS緩衝液反覆洗滌四次，用5%脫脂奶粉封閉過夜，PBS緩衝液 洗滌四次，分別在8 10 ml反應液中加入30pl兔抗重組huZP3b177—348抗血清(一抗)， 室溫反應2 h， PBS緩衝液洗膜後加入10 |il羊抗兔IgG /服P (二抗)，室溫反應1 h，用 PBS緩衝液洗滌四次後進行DAB顯色(結果見圖7B)。重複以上第三和第四步操作，用2 pl兔抗huZP3m"^合成肽抗血清進行的免疫印跡 試驗(結果見圖5)。很顯然，以上可專供短肽生物合成的pXXGST-l質粒的構建，特別是用它再次驗證huZP3 一個已鑑定線性BCE基序的應用，為今後蛋白抗原表位的掃描鑑定提供了經濟、操作相對 方便，可利用抗重組蛋白或其片段多抗進行表位作圖，因而易在大多數實驗室開展的可選 擇研究方法和實驗材料，也進而為抗原表位鑑定生物合成肽法的廣泛應用奠定了良好的基 礎。儘管本發明描述了抗原表位鑑定的具體應用例子，然而有一點對於相關領域研究技術 人員來說是顯而易見的，即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下，可對本發明製品作各 種變化改動。因此，所附權利要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。本發明涉及的序列SEQ.ID.NO.l:重組插入的GST188的DNA正鏈序列 5，-ATGTCCCCTATACTAGGTTATTGGAAAATTAAGGGCCTTGTGCAACCCACTC GACTTCTTTTGGAATATCTTGAAGAAAAATATGAAGAGCATTTGTATGAGCGCGTGCAGAGATTTCAATGCTTGAAGGAGCGGTTTTGGATATTAGATACGGTGTTTCAAATGGTGATCATGTAACCCATCCTGACTTCATGTTGTATGACGCTCTTGATGT TGTTTTATACATGGACCCAATGTGCCTGGATGCGTTCCCAAAATTAGTTTGTTT TAAAAAACGTATTGAAGCTATCCCACAA-3，SEQ.ID.N0.2: GST188核心蛋白一字簡寫的胺基酸序列M-S-P誦I-L隱G-Y-W誦K-I-K-G誦L-V隱Q-P誦T-R-L-L墨L-E-Y-L誦E-E-K-Y-E-E-H誦L-Y-E-R-D-E-G -D-K-W-R-N-K-K-F-E-L-G-L-E-F-P-N-L隱P-Y-Y小D隱G-D-V-K隱L-T-Q-S-M-A-I小R-Y-I-A-D-K-H-N-M-L-G-G-C-P國K-E-R-A-E-I-S-M-L-E-G-A-V國L-D-I-R誦Y-G-V-S-R誦I誦A-Y-SK-D-F-E-T-L-K_VDF_L-SK_L_PE_M-L-K_M-F-E-DR-L-C-HK-T-Y-L-N-G-D-H-V-T-H-P-D-F誦M-L-Y-D-A-L-D國V-V-L墨Y-M-D-P隱M-C-L誦D隱A國F-P-K誦L-V-C-F-KK-R-I-E-A誦I-P-0SEQ.ID.N0.3:重組質粒pXXGST-l的DNA正鏈序列(4196bp)formula see original document page 14 formula see original document page 15GAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAASEQ.ID.N0.4:重組質粒pXXGST-2的DNA正鏈序列(4193 bp)，是將pXXGST-l正鏈序列SEQ.N03中GGATCCGTCGAC後^TAATAG l雙終止密碼子去除，但在GGATCCGTCGAC 前插入一個TAA終止密碼子，其序列不再單獨列出。
權利要求
1、一種截短GST蛋白熱誘導融合表達質粒，其特徵在於具有SEQ.ID.NO.3所示核苷酸序列，記為pXXGST-1。
2、 一種截短GST蛋白熱誘導融合表達質粒，其特徵在於具有SEQ. ID. NO. 4所示核苷 酸序列，記為pXXGST-2。
3、 一種如權利要求1所述的截短GST蛋白熱誘導融合表達質粒的製備方法，其特徵 在於具體步驟如下(1) 設計PCR引物，從pGEX-4T-質粒中擴增出編碼GST蛋白188基因的大片段，該 大片斷在5'-和3'-端分別帶BamH I和Sal I的限制酶酶切位點；(2) 利用DNA重組技術，將目的GST基因擴增片段插入用EcoR I和BamH I雙酶切 的pSY621質粒，獲得的pSY621-GST重組質粒轉化大腸桿菌宿主菌，在加Amp的LB平板 上挑取它們的重組克隆，進行DNA測序；(3) 合成兩端為Sal I和Pst I粘性末端中間帶TAATAG雙終止密碼子的二條互補DNA 片段，將之退火復性後重組插入基因測序正確並經雙酶切的pSY621-GST中Sal I和Pst I 位點之間，連接液轉化TG1宿主菌，再次外送DNA測序驗證的重組質粒，命名為pXXGST-l， 其核苷酸序列為SEQ. ID. N03。
4、 一種如權利要求2所述的截短GST蛋白熱誘導融合表達質粒的製備方法，其特徵在 於具體步驟如下以權利要求3所述方法製備的pXXGST-1重組質粒為模板，用設計的一 對PCR引物擴增在GST編碼基因3'-端後添加TAA終止密碼子的GST188基因片段，用EcoR I和BamH I限制酶雙酶切的擴增大片段，被重組插入用同樣二個酶雙酶切的pSY621質粒， 測序正確重組質粒被新命名為pXXGST-2;其核苷酸序列為SEQ. ID. N04。
全文摘要
本發明屬於生物工程技術領域，具體為一種截短GST蛋白熱誘導融合表達重組質粒及其製備方法。本發明選用由188aa組成的新型截短GST188蛋白為載體，在大腸桿菌熱誘導表達系統表達短肽融合蛋白的pXXGST-1重組質粒，以及用作表達對照的熱誘導型pXXGST-2重組質粒，從而實現短肽生物合成的目的，專供抗原線性表位掃描作圖定位以及表位基序鑑定用。本發明的實驗證明GST188核心蛋白作為短肽生物表達載體以及在抗原表位掃描鑑定方面，特別是使用抗重組靶蛋白抗血清進行表位基序鑑定的適用性和應用性。
文檔編號C12N15/70GK101215573SQ20071017330
公開日2008年7月9日 申請日期2007年12月27日 優先權日2007年12月27日
發明者何亞萍, 唐海平, 季朝能, 徐萬祥, 毅 謝, 顧少華 申請人:上海市計劃生育科學研究所;復旦大學;上海科學院