抗P2X₇肽和表位的製作方法

2023-09-13 07:15:00 5

專利名稱：抗P2X7肽和表位的製作方法
技術領域：
本發明涉及肽、表位以及由其生產單克隆抗體。
背景技術：
本說明書中對任何現有技術的引用都不視為也不應當視為承認或以任何形式暗 示該現有技術構成澳大利亞或任何其他管轄範圍中公知常識的一部分，或者可合理地預期 該現有技術可由本領域技術人員確定、理解和認為是相關的。嘌呤能(P2X)受體為ATP門控陽離子選擇性通道。每個受體由三個蛋白質亞基 或單體構成。迄今為止，已經鑑定出七個編碼P2X單體的獨立基因=PZXpPZ)^ P2X3> P2X4, P2Xg、P2Xg> P2X70P2X7受體受到格外關注，因為據了解這些受體的表達局限於具有進行程序性細胞 死亡之潛能的細胞，例如胸腺細胞、樹突細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和單核細胞。在正常的內 穩態中，例如在紅細胞上，存在一些P2X7受體的表達。令人感興趣的是，已在據了解不能進行程序性細胞死亡的細胞(例如腫瘤前細胞 和腫瘤細胞)上發現了這樣的P2)(7受體，所述受體含有一個或多個在ftx)210(根據

圖1中 的SEQ ID No:l)處具有順式異構化的單體並且不具有ATP結合功能。此同工型受體已被 稱為「非功能性」受體。用包含順式ftx)210的肽免疫接種產生的抗體結合非功能性P2X7受體。但是，它 們不與能夠結合ATP的P2)(7受體結合。因此，這些抗體可用於選擇性檢測許多形式的癌和 造血系統癌症以及治療這些病症中的某些。W002/057306A1和W003/020762A1均討論了用於區分功能性P2X7受體和非功能性 P2X7受體的單克隆抗體形式的探針。單克隆抗血清具有某些在多克隆抗血清(polysera)中未發現的血清學特徵，這 使得單克隆抗血清成為用於研究、診斷和治療的特別有價值的試劑。其中的關鍵是，與在多 克隆抗血清中發現的大多數特異性物質的親和力相比，單克隆抗體通常具有更高的抗原親 和力。迄今為止，獲得產生有用量的針對活細胞上表達之非功能性P2X7受體的單克隆抗 體(尤其是可用於多種診斷和治療應用的單克隆抗體)的雜交瘤非常困難。此外，就本發 明人所知，還未有針對活細胞上的功能性P2X7受體而產生的任何單克隆抗體。需要這樣的 試劑，特別是能夠區分活細胞上ATP結合和非ATP結合的P2X7受體的新抗體。此外，據本發明人所知，抗P2X7抗體一般不區分P2X7單體和由這些單體形成的三 聚化P2X7受體。鑑於所述三聚化受體特別地發現於晚期腫瘤組織上，因此，結合該三聚化 受體而不結合P2)(7單體的抗體對於癌症分期是有利的。

發明內容
本發明涉及用於產生與活細胞上非功能性P2)(7受體結合但不與功能性P2X7受體結合之抗體的肽和表位。所述肽還可用於產生與活細胞上功能性P2X7受體結合但不與非 功能性P2X7受體結合的抗體。本發明還涉及與這些肽結合的抗體、含有這些肽的組合物、 使用所述肽產生抗體的方法以及診斷和治療與非功能性P2)(7受體表達相關之疾病的方法。在某些實施方案中，提供了 P2X7受體的表位，所述表位由以下形成P2X7受體第一 單體區域形式的第一區域；和該受體第二單體區域形式的第二區域；其中所述第一和第二 區域在該受體中由受體單體(SEQ ID No:l)的第210位殘基順式異構化而形成；並且其中 所述第一和第二區域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許抗Ρ2)(7抗體的抗原結合位點與形 成所述表位的所述第一和第二區域結合。在另一些實施方案中，提供了具有上述表位的Ρ2Χ7受體。通常，所述受體的一個 或多個單體在單體(SEQ ID Νο:1)的第210位具有順式異構化。在另一些實施方案中，提供了與？2&受體表位相結合的抗體，所述表位由以下形 成Ρ2Χ7受體第一單體區域形式的第一區域；和該受體第二單體區域形式的第二區域；其 中所述第一和第二區域在該受體中由受體單體(SEQ ID No :1)的第210位殘基順式異構化 形成；並且其中所述第一和第二區域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許該抗體的抗原結 合位點與形成所述表位的所述第一和第二區域結合。在一個實施方案中，提供了一種與抗體結合的採用上述表位形式的免疫複合物。在另一個實施方案中，提供了包含N端區域和C端區域的肽，所述N端和C端區域 各自通過N端和C端殘基來定義，其中-所述N端區域包含序列HNYTTRNIL(SEQ ID NO 2)或其至少4個殘基的片段；-所述C端區域包含脯氨酸、丙氨酸或甘氨酸的C端殘基；其中所述N端區域的C端殘基與所述C端區域的N端殘基共價相連；其中所述C端區域的C端殘基通過長約10至40埃的接頭與其他肽相連；並且其中所述其他肽由序列KTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRFDILVFGTGGKFD(SEQ ID NO :6)或其至 少4個殘基的片段組成。在另一個實施方案中，提供了由式(A) (Xn) (B)定義的肽，其中-(A)是胺基酸序列GHNYTTRNILP(SEQ ID NO 8)或其至少4個胺基酸的片段-(Xn)是長10至40埃的接頭，所述接頭由一個或多個胺基酸殘基組成；-(B)是胺基酸序列AKYYKENNVEK(SEQ ID NO 9)或其至少4個胺基酸的片段。在另一些實施方案中，提供了具有下列序列的肽 GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK(SEQ ID NO: 10)。在另一些實施方案中，提供了一種與抗體結合的上文所述肽形式的免疫複合物。 通常，所述抗體結合非功能性P2X7受體但不結合功能性P2X7受體。在另一些實施方案中，提供了上述肽用於生產用於與非功能性P2X7受體結合的抗 體的用途。在又一些實施方案中，提供了上述抗體用於確定個體是否患有癌症的用途。在又一些實施方案中，提供了上述抗體用於治療患有癌症的個體的用途。在又一些實施方案中，提供了一種試劑盒，其包含上述抗體，以及任選的-如上所述的肽；
所述試劑盒包含用於診斷或治療癌症的書面說明。
具體實施例方式下面將詳細描述本發明的某些實施方案。雖然與實施方案一起描述了本發明，但 是應當理解並不意味著將本發明局限於這些實施方案。相反，本發明旨在覆蓋所有替代方 式、修改和等同方案，其可包含在權利要求所限定的本發明範圍內。本領域技術人員會認識到，許多類似於或等同於本文所述方法和材料的方法和材 料均可用於實施本發明。本發明絕不局限於所述的方法和材料。應當理解，本說明書所公開和定義的本發明擴展到由所述文本或附圖提及或可從 中顯而易見得出的兩個或更多個單個特徵的所有替代性組合。所有這些不同的組合構成本 發明的多個替代方面。除了上下文另有需要，否則，本文中使用的術語「包括」和該術語的變化形式(如 「包含」、「含有」和「包含有」)並不旨在排除其他添加物、組分、整數或步驟。本文中引用的所有專利和出版物均全文通過弓I用併入本文。在做出本發明時，可用的針對活細胞上表達的非功能性？2&受體的抗P2X7抗血清 全部都是多克隆的。本發明人已鑑定了專門在非ATP結合的P2X7受體(也稱為「非功能性受體」)上 表達的表位。已發現該表位和形成它的肽可用於產生與活細胞上所表達的非功能性？2&受 體相結合的單克隆抗體。活細胞結合是非常重要的，因為非功能性P2X7受體在細胞(例如上皮細胞)中或 上的表達被認為是許多癌症(例如上皮癌症及其他病症)的生物標誌物。因此，利用結合 活細胞的單克隆抗體可提供抗體本身形式或者抗體-細胞毒劑綴合物形式的針對多種以 非功能性P2X7受體表達為特徵之疾病的全身性治療劑。還可提供以非功能性P2X7受體表 達為特徵的疾病的體內成像和診斷或監測。本發明人已從本文另外描述的詳細分子建模觀察到，該表位僅在？2&受體(即由 P2X7單體形成的三聚體)上發現。更特別地，該表位跨越三聚P2X7受體中的相鄰？2&單 體。因此，沒有排列成非功能性三聚化受體的各P2X7單體不含有該表位。這有利地允許人 們對腫瘤進行分級。這對於既結合單體P2X7又結合三聚化受體的抗體來說更困難。出於解釋本說明書的目的，一般性適用下列定義，只要適用，以單數形式使用的術 語也包括複數含義，並且反之亦然。如果所述的任何定義與通過引用併入本文的任何文獻 相矛盾，則採用下文所述的定義。「嘌呤能受體」泛指使用嘌呤(例如ATP)作為配體的受體。「P2X7受體」泛指由三個蛋白質亞基或單體形成的嘌呤能受體，所述單體的至少 一個具有基本上如SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列。P2X7由三個單體形成，因此其為「三 聚物」或「三聚化」。"P2X7受體」可以是如下所述的功能性或非功能性受體。「PSA受體」 涵蓋P2X7受體的天然變體，例如，其中P2X7單體是剪接變體、等位變體和同工型，包括形成 P2X7受體的天然截短或分泌形式的單體(例如由細胞外結構域序列組成的形式或其截短形 式)、天然變體形式(例如選擇性剪接形式)和天然等位變體。在本發明的某些實施方案 中，本文公開的天然序列P2X7單體多肽是成熟的或全長天然序列多肽，其包含SEQ ID NO1所示的全長胺基酸序列。在某些實施方案中，P2X7受體可以是經修飾的胺基酸序列，例如 SEQ IDNO=I中所示序列中的多個胺基酸可以被替換、缺失或可插入殘基。「功能性P2X7受體」泛指具有結合ATP之結合位點或裂隙的P2X7受體形式。當結 合ATP時，該受體形成孔樣結構，其使得鈣離子能夠進入胞質溶膠內，其後果之一可能是程 序性細胞死亡。在正常體內穩態中，功能性P2X7受體的表達一般局限於進行程序性細胞死 亡的細胞，例如胸腺細胞、樹突細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和單核細胞。在紅細胞上也可有功 能性P2X7受體的一些表達。「非功能性P2X7受體」泛指其中一個或多個單體在ftx)210 (根據SEQID NO :1)處 具有順式異構化的P2X7受體形式。該異構化可來源於任何分子事件，其導致單體錯誤摺疊， 包括例如單體一級序列的突變或者異常的翻譯後加工。異構化的後果之一是受體不能結合 ATP0在這些情況下，受體不能形成孔，這限制了鈣離子可進入胞質溶膠的程度。非功能性 P2X7受體在多種上皮癌和造血系統癌症中表達。「抗體」或「免疫球蛋白」或「Ig」是Y球蛋白，其存在於血液或脊椎動物的其他體 液中，其在免疫系統中起到結合抗原並由此識別和/或中和外來物質的作用。抗體一般是異四聚體糖蛋白，其由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)構 成。每條L鏈通過一個共價二硫鍵與H鏈相連。取決於H鏈的同種型，兩條H鏈通過一個 或多個二硫鍵彼此相連。每條H鏈和L鏈也具有規則間隔的鏈內二硫橋。H鏈和L鏈定義了特定的Ig結構域。更特別地，每條H鏈在N端具有可變結構域 (Vh)，其後對於α和Y鏈各自是三個恆定結構域(Ch)，對於μ和ε同種型是四個Ch結構 域。每條L鏈在N端具有可變結構域(\)，其後在其另一端是恆定結構域(CJ。\與V1^i 齊，Q與重鏈的第一個恆定結構域(ChI)對齊。抗體可劃分為不同的種類或同種型。免疫球蛋白分五類IgA、IgD、IgE、IgG和 IgM，其分別具有命名為α、δ、ε、Y和μ的重鏈。γ和α類又根據Ch序列和功能中相 對小的差異分為若干亞類，例如入表達下列亞類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。可 根據其恆定結構域的胺基酸序列將來自任何脊椎動物物種的L鏈劃歸為兩種明顯不同的 類型之一，稱為κ和入。恆定結構域包含Fc部分，其包含通過二硫鍵連接在一起的兩條H鏈的羧基端部 分。抗體的效應物功能(例如ADCC)由Fc區域中的序列所決定，該區域也是某些類型細胞 上所發現的Fc受體(FcR)所識別的部分。Vh和\配對一起形成「可變區，，或「可變結構域」，其包含抗體重鏈或輕鏈的氨基 端結構域。重鏈的可變結構域可稱為「VH」。輕鏈的可變結構域可稱為「VL」。V結構域含 有影響抗原結合併限定特定抗體對其特定抗原之特異性的「抗原結合位點」，其。V區域跨 越約110個胺基酸殘基，由相對不變的稱為框架區(FR)(通常約4個)的15-30個胺基酸 的片段組成，所述框架區被稱為「高變區」(一般約3個)的變化極大的較短區域間隔開，所 述「高變區」各自長9-12個胺基酸。FR大多採取β片層構型，所述高變區形成連接β片 層結構(有時構成其一部分)的環。「高變區」指抗體可變結構域中在序列上具有高度可變性和/或在結構上形成限 定環的區域。一般來說，抗體包含六個高變區；VH中有3個(H1、H2、H3)，VL中有3個(Li、 L2、L3)。
「框架」或「FR」殘基是除了本文定義的高變區殘基之外的可變結構域殘基。「完整」或「整個」抗體是包含抗原結合位點以及Q和至少重鏈恆定結構域^^、^^ 的抗體。恆定結構域可以是天然序列恆定結構域(例如人天然序列恆定結構域)或
其胺基酸序列變體。「包含可變結構域的完整抗體片段」包括Fab、Fab'、F(ab'片段；雙功能 抗體(diabodies)；線性抗體、單鏈抗體分子；以及由抗體片段形成的多特異性抗體。"Fab片段」由整個L鏈和H鏈之可變結構域(Vh)以及一條重鏈的第一個恆定結構 域(ChI)組成。每個Fab片段對於抗原結合而言是單價的，即其具有單個抗體結合位點。"Fab'片段」與Fab片段的不同在於，前者在ChI結構域的羧基端具有另外的幾個 殘基(包括來自抗體鉸鏈區的一個或多個半胱氨酸)。Fab' -SH在本文中表示恆定結構域 的半胱氨酸殘基帶有游離巰基的Fab'。"F(ab' )2片段」大致相當於兩個二硫鍵連接的Fab片段，其具有二價抗原結合活 性，並且仍能夠交聯抗原。「Fv」是含有完整的抗原識別和結合位點的最小抗體片段。此片段由緊密非共價連 接的一個重鏈可變區結構域和一個輕鏈可變區結構域的二聚體組成。在單鏈Fv(SCFV)類型中，一個重鏈可變區結構域和一個輕鏈可變結構域可通過 柔性肽接頭共價連接，使得輕鏈和重鏈可以類似於兩條鏈Fv類型中的「二聚化」結構相結 合。這兩個結構域的摺疊產生六個高度可變的環(來自H鏈和L鏈的各3個環)，其提供了 用於抗原結合的胺基酸殘基並將抗原結合特異性賦予抗體。「單鏈Fv〃(還縮寫為「sFv」或「scFv」 )是包含相連形成單個多肽鏈之Vh和\ 抗體結構域的抗體片段。優選地，所述scFv多肽還包含Vh和\結構域之間的多肽接頭，其 使得scFv能夠形成抗原結合所需的結構。「單可變結構域」是Fv的一半(僅包含三個抗原特異性的OTR)，其具有識別和結 合抗原的能力，儘管比整個結合位點的親和力低。「雙功能抗體」指具有兩個抗原結合位點的抗體片段，其片段在同一多肽鏈 (VH-VL)中包含與輕鏈可變結構域(VL)相連的重鏈可變結構域(VH)。通過下列方式製備小 抗體片段在Vh與\結構域之間使用短接頭(約5-10個殘基)構建sFv片段(見前段)， 使得形成V結構域的鏈間而非鏈內配對，得到二價片段，即具有兩個抗原結合位點的片段。雙功能抗體可以是二價的或雙特異性的。雙特異性雙功能抗體是兩個「交換」 sFv 片段的異二聚體，其中兩個抗體的Vh和\結構域存在於不同的多肽鏈上。三功能抗體 (triabodies)和四功能抗體(tetrabodies)也是本領域中一般已知的。「分離的抗體」是已經鑑定並已與其之前存在的環境中組分分離和/或從其中回收 的抗體。雜質組分是會干擾抗體治療用途的物質，可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質 溶質。「人抗體」指具有對應於人所產生抗體之胺基酸序列的胺基酸序列的抗體。人抗體 可使用本領域中已知的多種技術產生，包括噬菌體展示文庫。人抗體可以通過向已經修飾 從而在應答於抗原激發時產生此種抗體而其自身的內源基因座已失活的轉基因動物施用 這些抗原來製備。非人(例如齧齒動物)抗體的「人源化」形式是含有來源於非人抗體之儘可能少的序列的嵌合抗體。在很大程度上，人源化抗體是人免疫球蛋白(受者抗體)，其中來自接 納抗體高變區的殘基被具有所需抗體特異性、親和性和能力的來自非人物種(例如小鼠、 大鼠、兔或非人靈長類)(供者抗體)之高變區的殘基所替代。在一些情況下，人免疫球蛋 白的框架區(FR)殘基被相應的非人殘基所替代。此外，人源化抗體還可包含未在受者抗體 或供者抗體中發現的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能。一般說來，人源化抗體 會包含至少一個以及通常兩個可變結構域的基本上全部，其中所有或基本上所有的高可變 環對應於非人免疫球蛋白的高變環，並且所有或基本上所有的FR都是人免疫球蛋白序列 的FR。人源化抗體任選地還會包含免疫球蛋白(通常為人免疫球蛋白)恆定區(Fe)的至 少一部分。「單克隆抗體」是指由基本上同一抗體群體獲得的抗體，S卩，除可能少量存在的天 然突變外，包含所述群體的各個抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異性的，其針對抗原上 的單個抗原位點或決定簇。除了其特異性之外，單克隆抗體的優勢還在於它們可以合成而 不被其他抗體汙染。單克隆抗體可以通過雜交瘤方法來製備。「單克隆抗體」也可利用所述 技術從噬菌體抗體文庫分離出來。術語「抗P2X7受體抗體」或「結合P2X7受體的抗體」是指能夠結合P2X7受體的抗 體，其親和力足夠使得所述抗體可作為靶向？2\受體(通常為非功能性P2X7受體)的診 斷劑和/或治療劑。優選地，P2X7受體抗體結合不相關的P2X7受體蛋白的程度小於該抗體 與P2X7受體結合程度的約10%，例如通過放射性免疫測定(RIA)所測得的。在某些實施方 案中，結合P2X7受體的抗體具有< 1μΜ、< 100nM、< 10nM、< InM或<0. InM的解離常數 (Kd)。抗非功能性Ρ2Χ7受體的抗體通常是具有這些血清學特徵中的一些或全部特徵並且 結合非功能性Ρ2)(7受體但不結合功能性Ρ2Χ7受體的抗體。「親和力成熟」抗體是在其一個或多個高變區中具有一個或多個改變並導致抗體 對抗原之親和力提高(與不具有這些改變的親本抗體相比)的抗體。優選的親和力成熟抗 體將具有針對靶抗原的納摩爾每升或甚至皮摩爾每升的親和力。親和力成熟抗體由本領域 已知的方法產生。「阻斷」抗體或「拮抗劑」抗體是抑制或降低其所結合之抗原的生物活性的抗體。優 選的阻斷抗體或拮抗劑抗體基本上或完全抑制抗原的生物活性。本文使用的「激動劑抗體」是模擬目的多肽至少一種功能活性的抗體。「結合親和力」泛指分子(例如抗體)的單個結合位點與其結合配偶體(例如抗 原)之間的非共價相互作用的總和強度。除非另外指明，否則本文使用的「結合親和力」表 示內在結合親和力，其反映結合配對成員(例如抗體和抗原)之間的1 1相互作用。分 子X與其配偶體Y的親和力一般可由解離常數(Kd)表示。親和力可通過本領域已知的普 通方法來測定，包括本文中所述的那些。低親和力抗體一般緩慢結合抗原，並且傾向於容易 地解離，而高親和力抗體則通常更快地結合抗原並且傾向於保持結合更長時間。測量結合 親和力的多種方法是本領域中已知的，其中的任何方法都可用於本發明目的。「表位」泛指抗體之抗原結合位點所結合的抗原部分。表位可以是「線性的」，其意 為形成抗原結合位點的抗體CDR的高變環結合一級蛋白質結構的胺基酸序列。在某些實施 方案中，所述表位是「構象表位」，即其中CDR的高變環結合三級或四級蛋白質結構中存在 的殘基。
在一個實施方案中，提供了 P2X7受體的表位，該表位由以下形成-P2X7受體第一單體區域形式的第一區域；和-所述受體第二單體區域形式的第二區域；其中所述第一和第二區域通過所述受 體單體(SEQ ID NO 1)的第210位處殘基的順式異構化在該受體中形成；並且其中所述第一和第二區域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許抗P2X7抗體的抗原 結合位點與形成所述表位的所述第一和第二區域結合。通常，所述表位是構象表位。在這些實施方案中，所述第一和第二區域各自定義了 分子空間，其各自包含SEQ ID NO :1中的一個或多個殘基。通常，所述第一區域定義了包 含SEQ ID NO :1中一個或多個殘基的分子空間，其暴露用於結合抗體的抗原結合位點，其是 具有SEQ ID N0:1所示序列之單體的ftx)210順式異構化的結果。這些殘基包括Gly200、 His201、Asn202、Tyr203、Thr204、Thr205、Arg206、Asn207、Ile208、Leu209 和 Pro210。在 一個實施方案中，所述第一區域包含這些殘基中的至少一個。通常，所述第一區域包含這些 殘基中的至少4個，但是其可以更少，例如2個或3個，這取決於所述第二區域中存在多少 殘基。在一個實施方案中，所述第一區域包含下表1中所示的至少1對殘基表 權利要求
1.結合P2X7受體表位的抗體，所述表位由下列形成 -P2X7受體第一單體區域形式的第一區域；和-所述受體第二單體區域形式的第二區域；其中所述第一和第二區域通過所述受體單體SEQ ID NO :1第210位殘基的順式異構化 在該受體中形成；並且其中所述第一和第二區域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許所述抗體的抗原結合位 點與形成所述表位的所述第一和第二區域結合。
2.根據權利要求1的抗體，其中所述第一區域包含SEQID NO 1的下列一個或多個殘 基Gly 200，His 201，Asn 202, Tyr 203, Thr 204, Thr205, Arg 206，Asn 207，lie 208 和 Leu 209。
3.根據權利要求2的抗體，其中所述第一區域還包含SEQID NO :1的下列一個或多個 殘基=Arg 125，Lys 193，Phe 275 和 Arg 294。
4.根據權利要求1的抗體，其中所述第一區域包含SEQID No=I的下列序列之一 Gly 200 至 Tyr 203，His 201 至 Thr 204， Asn 202 至 Thr 205， Tyr 203 至 Arg 206， Thr 204 至 Asn 207， Thr 205 至 Ile 208， Arg 206 至 Leu 209。
5.根據前述權利要求中任一項的抗體，其中所述第二區域包含下列一個或多個殘基 Lys 297,Tyr 298,Tyr 299、Lys 300、Glu301、Asn 301、Asn 303,Val 304,Glu 305 和 Lys 306。
6.根據權利要求5的抗體，其中所述第二區域還包含Arg307和/或Lys 311。
7.根據權利要求1的抗體，其中所述第二區域包含SEQID No=I的下列序列之一 Lys 297 至 Lys 300,Tyr 298 至 Glu 301， Tyr 299 至 Asn 301， Lys 300 至 Asn 303， Glu 301 至 Val 304， Asn 301 至 Glu 305， Asn 303 至 Lys 306。
8.根據前述權利要求中任一項的抗體，其中所述第一區域含有比所述第二區域多的殘基。
9.根據前述權利要求中任一項的抗體，其中所述第一區域含有約4至約10個殘基。
10.根據前述權利要求中任一項的抗體，其中所述第二區域含有比所述第一區域多的殘基。
11.根據前述權利要求中任一項的抗體，其中所述第二區域含有約4至約10個殘基。
12.根據前述權利要求中任一項的抗體，其中所述第一和第二區域間隔約10埃。
13.根據前述權利要求中任一項的抗體，其為基本上經純化或分離的形式。
14.P2X7受體的表位，所述表位由以下形成 -P2X7受體第一單體區域形式的第一區域；和 -所述受體第二單體區域形式的第二區域；其中所述第一和第二區域通過所述受體單體SEQ ID NO :1第210位殘基的順式異構化 在所述受體中形成；並且其中所述第一和第二區域在該受體中彼此相鄰排列，從而允許抗P2X7抗體的抗原結合 位點與形成所述表位的所述第一和第二區域結合。
15.根據權利要求14的表位，其為基本上經純化或分離的形式。
16.P2X7受體，其包含前述權利要求中任一項的表位。
17.根據權利要求16的受體，其中並非該受體所有的單體都在單體210位殘基具有順 式異構化。
18.根據權利要求16的受體，其中所述受體單體中的2個在210位殘基具有順式異構化。
19.根據權利要求16的受體，其中所述受體單體中的1個在210位殘基具有順式異構化。
20.根據前述權利要求中任一項的受體，其為基本上經純化或分離的形式。
21.前述權利要求中任一項之抗體形式的免疫複合物，其結合至P2X7受體上的表位。
22.根據前述權利要求中任一項的免疫複合物，其中所述受體的所有表位均與抗體結I=I O
23.根據前述權利要求中任一項的免疫複合物，其中所述受體中少於三個表位被抗體糹口口。
24.根據前述權利要求中任一項的免疫複合物，其中所述複合物含有比受體更多的抗 體分子。
25.根據前述權利要求中任一項的免疫複合物，其中所述複合物含有比受體更少的抗 體分子。
26.—種肽，其含有N端區域和C端區域，所述N端和C端區域各自通過N端和C端殘 基而限定，其中-所述N端區域包含序列HNYTTRNIL(SFQ ID NO 2)或其至少4個殘基的片段； -所述C端區域包含脯氨酸、丙氨酸或甘氨酸的C端殘基； 其中所述N端區域的C端殘基共價連接至所述C端區域的N端殘基； 其中所述C端區域的C端殘基通過長約10至30埃的接頭連接至其他肽；並且 其中所述其他肽由序列 KTTNVSLYPGYNFRYAKYYKENNVEKRTLIKVFGIRFDILVFGTGGKFD 或 其至少4個殘基的片段組成。
27.根據權利要求沈的肽，其中所述N端區域包含序列HNYTTRNIL(SEQID NO 2)。
28.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述N端區域包含序列GHNYTTRNIL(SEQID NO 3)。
29.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述N端區域包含序列DFPGHNYTTRNIL(SEQ ID NO 4)。
30.根據前述權利要求中任一項的肽，其中對於SEQID NO :2至4中任一項而言 D殘基可保守性替換為E、N或Q殘基；F殘基可保守性替換為Y或W殘基； G殘基可保守性替換為A、V、L或I殘基； H殘基可保守性替換為K或R殘基； N殘基可保守性替換為D、E或Q殘基； Y殘基可保守性替換為F或W殘基； T殘基可保守性替換為C、S或M殘基； R殘基可保守性替換為H或K殘基； I殘基可保守性替換為G、A、V或L殘基；以及 L殘基可保守性替換為G、A、V或I殘基。
31.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述N端區域包含序列 MPACCSCSDVFQYETNKVTRIQSMNYGTIKWFFHVIIFSYVCFALVSDKL YQRKEPVISSVHTKVKGIAEVKEEIVENGVKKLVHSVFDTADYTFPLQGN SFFVMTNFLKTEGQEQRLCPEYPTRRTLCSSDRGCKKGWMDPQSKGIQTG RCWHEGNQKTCEVSAWCPIEAVEEAPRPALLNSAENFTVLIKNNIDFPG HNYTTRNIL(SEQ ID NO :5)。
32.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述N端區域包含序列SEQID NO. 5中的序 列，所述序歹Ij SEQ ID NO. 5在C端包含HNYTTRNIL。
33.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述C端區域的C端殘基是脯氨酸。
34.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述脯氨酸處於順式構象。
35.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述C端區域由脯氨酸、甘氨酸或丙氨酸組成。
36.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述C端區域由脯氨酸組成。
37.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述接頭是一個或多個胺基酸殘基。
38.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述接頭是一個或兩個胺基酸。
39.根據前述權利要求中任一項的肽，其中所述所述胺基酸殘基選自甘氨酸和丙氨酸。
40.由式㈧0(η)⑶定義的肽，其中-(A)是GHNYTTRNILP的胺基酸序列或其至少4個胺基酸的片段； -(Xn)是長10至30埃的接頭，所述接頭由一個或多個胺基酸殘基組成； -(B)是AKYYKENNVEK的胺基酸序列或其至少4個胺基酸的片段。
41.根據權利要求40的肽，其中所述肽具有下列序列GHNYTTRNILPGAGAKYYKENNVEK。
42.與根據前述權利要求中任一項的肽相結合的抗體。
43.與抗體相結合的根據前述權利要求中任一項的肽的形式的免疫複合物。
44.根據前述權利要求中任一項的肽用於生產結合非功能性P2X7受體之抗體的用途。
45.根據前述權利要求中任一項的抗體用於確定個體是否患有癌症的用途。
46.根據前述權利要求中任一項的抗體用於治療患癌症個體的用途。
47.一種試劑盒，其包含根據前述權利要求中任一項的抗體，以及任選地包含 根據前述權利要求中任一項的肽；所述試劑盒包含用於診斷或治療癌症的書面說明。
全文摘要
本發明涉及對癌症中所涉及的非功能性P2X7受體上新表位的鑑定。該表位包含來自該三亞基受體內兩個相鄰單體的區域。描述了結合該表位的抗體以及產生所述抗體的肽。所述抗體和肽可用於診斷和治療癌症。
文檔編號C07K14/05GK102143978SQ200980134521
公開日2011年8月3日 申請日期2009年7月3日 優先權日2008年7月4日
發明者A·基得利-拜爾德, J·A·巴登 申請人:生物權威國際有限公司