促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠的製作方法

2023-09-13 18:03:55 2

促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠的製作方法
【專利摘要】本發明提供促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠，其是通過以下方法製得：（1）將切除的臍帶置於保存液內，所述保存液為磷酸鹽緩衝液含雙抗，在4℃下保存直至處理；（2）在無菌條件下用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶，以75%乙醇浸泡20秒，取出後分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm3的小塊；（3）轉移至無菌離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩衝液置4℃下48秒，間或震蕩，溶脹組織；（4）用高速勻漿機4℃下勻漿打碎，再用玻璃勻漿器4℃勻漿後，再次用高速勻漿機4℃下儘量將勻漿打碎；（5）以12000轉離心30分鐘，取上清，即得到所述活性基質膠成品。
【專利說明】促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及一種用於體外培養，可以延緩間充質幹細胞(mesenchymalstemcells, MSCs)的複製性衰老、促進細胞增殖並維持MSCs的「乾性」的活性基質膠。
【背景技術】
[0002]間充質幹細胞MSCs是來源於中胚層的一類成體幹細胞，可從骨髓、臍帶、胎盤、肌肉、脂肪等多種組織中分離出來。MSCs具有自我更新以及多向分化的潛能，在體內整個生命周期、以及疾病與創傷條件下參與組織器官的更新與修復。間充質幹細胞具有免疫調節特性及分泌豐富的營養因子，且具極低的免疫原性，因此具有廣泛的臨床應用研究的潛能，已被應用於缺血性心臟病、免疫系統疾病、神經系統疾病、糖尿病、GVHD等臨床基礎與應用研究。但是，原始存在於骨髓、脂肪的MSCs的數目較少，難以滿足臨床治療和研究方面的需求，因此需要在體外對間充質幹細胞進行大量擴增。然而，像人體其它體細胞一樣，間充質幹細胞的體外的擴增培養，由於體外失去體內幹細胞生存的微環境，在體外培養中從開始就存在著複製性衰老的特性，使MSCs的分化能力及自我更新能力以及相關的特性隨著衰老的逐漸加重而丟失。使得人們很難獲得既能滿足數量上的需求又保持幹細胞的特性的細胞，因此嚴重製約了間充質幹細胞的基礎與應用研究。
[0003]間充質幹細胞在體內能保持自我更新及複製能力是取決於所處的幹細胞微環境的緣故。研究表明，幹細胞生存的微環境，包含了包括細胞外基質(ECM)成分及眾多的細胞因子的適宜調控因素，調節著幹細胞的特性包括自我更新及多向分化的能力。因此，人們試圖體外模擬體內幹細胞微環境解決體外培養擴增存在的複製性衰老的難題。模擬微環境含有的主要成分是膠原蛋白，在一定程度上促進了間充質幹細胞的增殖及延緩了衰老的出現。同時使用MSCs特異的ECM，即用來源於骨髓間充質幹細胞的ECM為自然的成分模擬體內微環境，在體外明顯 促進了間充質幹細胞的增殖，抵抗複製性衰老的過早出現。體外利用ECM成分模擬體內微環境，在一定程度解決了複製性衰老的問題。但是，由於參與幹細胞微環境調控的既有ECM成分又包括了細胞因子成分，是個複雜的有機體，現有的合成的方法很難再現其複製性。利用MSCs的ECM構建的幹細胞的微環境，由於MSCs本身存在的衰老的及無法大量製備等缺陷更限制了其大量製備，限制了其在臨床及基礎研究中的應用。因此，隨著MSCs大量的臨床及基礎研究的開展，亟待解決其在體外培養過程中存在的複製性衰老的的問題。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於，提供一種能在體外包被培養皿的表面模擬體內微環境，延緩MSCs的衰老的發生、促進MSCs增殖的製品。
[0005]為了實現上述目的，本發明採用以下技術方案:
[0006]一種促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠，其特徵在於，其是通過以下方法製得:[0007](I)將切除的臍帶置於保存液內，所述保存液為含IOOu的青黴素及100 μ g的鏈黴素的0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，在4°C下保存直至處理；
[0008](2)在無菌條件下用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶，以75%乙醇浸泡20秒，取出後分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm3的小塊；
[0009](3)轉移至無菌離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩衝液置4°C下48小時，間或震蕩，溶脹組織；
[0010](4 )用高速勻漿機4 °C下勻漿打碎，再用玻璃勻漿器4 °C勻漿後，再次用高速勻漿機4°C下儘量將勻漿打碎；
[0011](5)以12000轉離心30分鐘，取上清，即得到所述活性基質膠成品。
[0012]如上所述的活性基質膠，優選地，步驟(1)中，所述臍帶在4°C下保存不超過24小時。
[0013]如上所述的活性基質膠，優選地，步驟(2)中，所述用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶為衝洗3次。
[0014]如上所述的活性基質膠在促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老中的用途，其特徵性在於，所述的用途是將來源於動物或人體的間充質幹細胞體外培養於所述活性基質膠，從而促進間充質幹細胞體外增殖及延緩其複製性衰老。
[0015]如上所述的用途，優選地，將所述活性基質膠以磷酸鹽緩衝液0.05-10%g/mL的濃度，於培養容器中37°C下包被2小時，或4°C下包被16-24小時後，用於所述間充質幹細胞的體外培養。`
[0016]一種促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠的製備方法，其特徵在於，所述製備方法的步驟如下:
[0017](I)將切除的臍帶置於保存液內，所述保存液為含IOOu的青黴素及100 μ g的鏈黴素的0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，在4°C下保存直至處理；
[0018](2)在無菌條件下用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶，以75%乙醇浸泡20秒，取出後分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm3的小塊；
[0019](3)轉移至無菌離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩衝液置4°C下48小時，間或震蕩，溶脹組織；
[0020](4 )用高速勻漿機4 °C下勻漿打碎，再用玻璃勻漿器4 °C勻漿後，再次用高速勻漿機4°C下儘量將勻漿打碎；
[0021](5)以12000轉離心30分鐘，取上清，即得到所述活性基質膠成品。
[0022]如上所述的製備方法，優選地，步驟(1)中，所述臍帶在4°C下保存不超過24小時。
[0023]如上所述的製備方法，優選地，步驟(2)中，所述用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶為衝洗3次。
[0024]本發明的有益效果為:
[0025]本發明採用剪碎、溶脹、凍融、高速破碎、組織勻漿等物理提取技術，較完整的保留了華通基質膠組份。這些成份在體內構成了 MSCs生存的微環境，在這樣的微環境中，間充質幹細胞維持著自我更新、自我複製以及多項分化潛能，維持著幹細胞的特性。利用本發明活性基質膠提取物包被培養皿，體外模擬體內微環境培養MSCs，可以比普通培養方法延緩至少30H)S以上出現衰老。得到的幹細胞具有較高的成骨與成脂分化的能力，為MSCs基礎與臨床研究提供了更多、更穩定的種子細胞。
[0026]下面結合附圖及最佳實施方式對本發明做進一步說明，以使公眾對
【發明內容】
有整體和充分的了解，而並非對本發明保護範圍的限定。凡依照本發明公開內容進行的任何本領域公知的等同替換，均屬於對本發明的侵犯。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1為本發明活性基質膠在培養皿表面的形態特點，其中a為相差顯微鏡下形態，b為掃描電子顯微鏡下形態。
[0028]圖2為UC-MSCs形態變化示意照片，其中a為在正常對照培養皿中的照片，b為在本發明活性基質膠中的照片。
[0029]圖3為UC-MSCs生長動力學曲線，其中a和b為培養早期MTT測定UC-MSCs增殖能力的曲線，a為10PD，b為20PB，c為長期培養的UC-MSCs生長曲線。
[0030]圖4為UC-MSCs免疫表型的變化，其中a為30PD，b為50H)。
[0031]圖5為UC-MSCs成脂分化能力的變化示意照片，其中a為在正常對照培養皿中的照片，b為在本發明活性基質膠中的照片。
[0032]圖6為SA- β -gal活性示意圖，其中a和b為普通光鏡下SA- β -gal活性示意照片，且a為在正常對照培養皿中的照片，b為在本發明活性基質膠中的照片，c為SA- β -gal染色陽性率統計圖。
【具體實施方式】
[0033]本發明經過優化組合，選取了去除臍帶外膜、血管，剪碎後溶脹再勻漿加超速及超聲破碎的物理萃取的方案，得到了臍帶華通膠提取物。提取物中既含有細胞外基質的主要成分包括膠原蛋白、纖連蛋白等，也包含了豐富的包括鹼性成纖維細胞生長因子、血小板樣生長因子等生長因子。這些成分構成的混合物曾液態膠狀，是MSCs良好的微環境，MSCs在此物質包被的培養環境中，複製性衰老被延遲出現。本發明優化了混合物包被的的濃度，培養得到的細胞數目明顯增多。採用本發明的混合物用於促進間充質幹細胞體外增殖及延緩複製性衰老，為基於基礎及臨床研究的為目的的MSCs的體外培養提供新的生物材料與技術。
[0034]下面以具體實施例對本發明作進一步詳細說明如下:
[0035]實施例1本發明活性基質膠的製備
[0036]本發明活性基質膠製備的材料來自臍帶。臍帶可以來自醫院中新生兒的廢棄臍帶或從實驗動物小型豬上切除的臍帶。若處理來自醫院中新生兒的廢棄臍帶時，在收取臍帶前必須與新生兒父母籤署知情同意書。
[0037](I)將切除的臍帶置於保存液內，所述保存液為含IOOu的青黴素及100 μ g的鏈黴素的0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，4°C保存直至處理，一般不超過24小時。
[0038](2)在無菌條件下用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶三次，去除紅細胞；75%乙醇浸泡20秒，取出，分解成小段，去除血管及外膜，用無菌剪刀剪碎至呈約Imm3的小塊。
[0039](3)轉移至無菌離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩衝液置4°C下48小時，間或震蕩，溶脹組織。[0040](4 )用高速勻漿機4 °C下勻漿打碎，再用玻璃勻漿器4 °C勻漿後，再次用高速勻漿機4°C下儘量將勻漿打碎。
[0041](5) 12000轉下離心30分鐘，取上清，即得到本發明活性基質膠成品，測定蛋白含量。
[0042]實施例2本發明活性基質膠的包被及形態特點
[0043](I)以磷酸鹽緩衝液稀釋活性基質膠成品至0.1~10%g/mL，4°C過夜或37°C 2小時包被培養皿。
[0044](2)棄去多餘的基質膠，用磷酸鹽緩衝液浸洗2次，待用。
[0045](3)如圖1a所示，在光學相差顯微鏡下觀察，包被在培養皿表面的本發明活性基質膠呈均勻的顆粒狀。
[0046](4)將包被好的培養皿用2.5%多聚甲醛4°C固定24h後，用體積百分比70、75、80、85、90、95和100%的乙醇依次脫水，每個濃度脫水2次，每次15分鐘，之後真空乾燥。噴金後用掃描電子顯微鏡檢測。包被於培養皿表面的活性基質膠呈直徑為2-5 μ m的顆粒狀排列，其照片如圖1b所示。
[0047]實施例3利用本發明活性基質膠進行UC-MSCs分離、培養和擴增
[0048](I) UC-MSCs分離、培養和擴增
[0049]A.臍帶切除後於保存液內，所述保存液為含IOOu的青黴素及100 μ g的鏈黴素的
0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液`，一般不超過24小時。
[0050]B.在無菌條件下用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶三次，去除紅細胞；75%乙醇浸泡20秒，取出，分解成小段，去除血管及外膜，用無菌剪刀剪碎至呈約Imm3的小塊。
[0051]C.轉移到IOOmL三角燒瓶中，按每釐米臍帶加入ImL消化液，所述消化液含終濃度為0.2mg/mL的膠原酶II及I μ g/mL的透明質酸酶,37°C磁力攪拌器作用下消化14~20h。消化液變粘稠，直至全部消化。
[0052]D.加5倍體積的磷酸鹽緩衝液稀釋，2000轉離心30分鐘，棄上清液，沉澱用磷酸鹽緩衝液清洗、離心，用含10%胎牛血清的完全培養基稀釋培養。以5 X 106/mL個細胞接種於25cm2承裝有上述培養基的培養瓶中。37°C、5%C02、飽和溼度下培養，5天全量換液去除非貼壁細胞，以後每3-4天換液一次。
[0053]E.當細胞達60-70%融合時，以0.25%胰蛋白酶_0.02%EDTA消化細胞傳代培養。
[0054](2) UC-MSCs的衰老相關的監測指標
[0055]A.與衰老相關的細胞形態的變化
[0056]MSCs形態的改變直接反映細胞衰老的變化。我們在普通光學顯微鏡下連續觀察了UC-MSCs形態學的改變。在早期即ioro (即群體倍增指數)時，無論是培養在本發明活性基質膠上還是正常培養皿上，細胞均呈現正常的細長成纖維細胞狀的形態，在中晚期3oro或50PD，仍能大部分保持這種形態特點，如圖2a和b所示。
[0057]B.細胞生長曲線
[0058]分別取相對於10HK20PD的培養細胞，製備單細胞懸液，計數，用完全培養基調整細胞濃度為5 X IOVmL,接種於96孔細胞培養板中。分別從1_6天，每天取3孔加入終濃度
0.25mg/mL 二苯基四氮唑溴鹽37°C 20分鐘，然後換用0.2mL的二甲基亞碸。使用酶聯儀測定0D540nm的值，以時間(天)為橫坐標，以OD值為縱坐標，繪製生長曲線，如圖3a所示。[0059]結果證實，UC-MSCs培養在本發明活性基質膠包被的培養皿中與正常對照相比未見明顯差別，本發明活性基質膠並不影響UC-MSCs的增殖能力。
[0060]C.群體倍增指數(PD)
[0061]UC MSCs從第一次傳代開始定義為培養起始濃度，以2000/cm2密度接種T75培養瓶，融合度達70%傳代並計數重複接種同樣的細胞數，直到複製性衰老的跡象出現，細胞停止生長。計算ros的公式為:
[0062]ro=log2(D/D0)，其中DO=接種的細胞數，D=收穫的細胞總數。
[0063]結果顯示，本發明活性基質膠明顯提高了細胞的增殖能力，大約提高約30H)，如圖3b所示。
[0064]D.表型檢測
[0065]分別取細胞懸液ImL (IXlO6細胞/mL)，在每一管中分別加入2mL磷酸鹽緩衝液緩衝液，並充分混勻，室溫中靜置5分鐘。1000轉/分鐘離心5分鐘，用磷酸鹽緩衝液緩衝液衝洗重懸。加入連接有螢光素的單克隆抗體及其同型對照進行免疫標記反應，暗箱室溫下孵育30分鐘。1000轉/分鐘離心10分鐘。用磷酸鹽緩衝液緩衝液衝洗重懸，重複衝洗一次，上機檢測。結果如圖4a和b所示，⑶34、⑶45、HLA-DR呈陰性;CD73、⑶90、CD 105呈陽性，且30H)和50H)檢測的結果基本一致。
[0066]E.向脂肪細胞誘導分化
[0067]分別收集 消化後的10、30、50ro的MSCs，按2 X 104/cm2接種於6孔板，待細胞融合達50%以上後，用含10%胎牛血清的低糖DMEM培養液，加入脂肪誘導體系,所述體系為:地塞米松I μ mol/L、人胰島素5mg/L、IBMX 0.5mmol/L、消炎痛100 μ mol/L。每3天全量換液，維持3周。細胞經油紅O染色，鏡下觀察細胞內脂肪小滴形成情況。結果如圖5a和b所示，本發明活性基質膠明顯抑制了 MSCs隨著體外培養的不斷進行而出現的脂肪分化能力的下降。
[0068]F.SA- β -gal 活性
[0069]與衰老相關的β-gal活性直接顯示細胞的狀態。分別檢測了 MSCs在30H)、50PD時SA-β -gal活性，結果如圖6a、b和c所示，本發明活性基質膠明顯抑制了 MSCs的SA-β-gal的活性。
【權利要求】
1.一種促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠，其特徵在於，其是通過以下方法製得: (1)將切除的臍帶置於保存液內，所述保存液為含IOOu的青黴素及100μ g的鏈黴素的0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，在4°C下保存直至處理； (2)在無菌條件下用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶，以75%乙醇浸泡20秒，取出後分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm3的小塊； (3)轉移至無菌離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩衝液置4°C下48小時，間或震蕩，溶脹組織； (4)用高速勻漿機4°C下勻漿打碎，再用玻璃勻漿器4°C勻漿後，再次用高速勻漿機4°C下儘量將勻漿打碎； (5)以12000轉離心30分鐘，取上清，即得到所述活性基質膠成品。
2.如權利要求1所述的活性基質膠，其特徵在於，步驟(1)中，所述臍帶在4°C下保存不超過24小時。
3.如權利要求1所述的活性基質膠，其特徵在於，步驟(2)中，所述用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶為衝洗3次。
4.如權利要求1至3中任一項所述的活性基質膠在促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老中的用途，其特徵性在於，所述的用途是將來源於動物或人體的間充質幹細胞體外培養於所述活性基質膠，從而促進間充質幹細胞體外增殖及延緩其複製性衰老。
5.如權利要求4所述的活性基質膠在促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老中的用途，其特徵在於，將所述活性基質膠以磷酸鹽緩衝液0.05-10%g/mL的濃度，於培養容器中37°C下包被2小時，或4°C下包被16-24小時後，用於所述間充質幹細胞的體外培養。
6.一種促進間充質幹細胞體外增殖及延緩衰老的活性基質膠的製備方法，其特徵在於，所述製備方法的步驟如下: (1)將切除的臍帶置於保存液內，所述保存液為含IOOu的青黴素及100μ g的鏈黴素的0.01mol/L的磷酸鹽緩衝液，在4°C下保存直至處理； (2)在無菌條件下用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶，以75%乙醇浸泡20秒，取出後分解成小段，去除血管及外膜，剪碎至呈0.5-1.5mm3的小塊； (3)轉移至無菌離心管中，加入等體積的磷酸鹽緩衝液置4°C下48小時，間或震蕩，溶脹組織； (4)用高速勻漿機4°C下勻漿打碎，再用玻璃勻漿器4°C勻漿後，再次用高速勻漿機4°C下儘量將勻漿打碎； (5)以12000轉離心30分鐘，取上清，即得到所述活性基質膠成品。
7.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，步驟(1)中，所述臍帶在4°C下保存不超過24小時。
8.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，步驟(2)中，所述用磷酸鹽緩衝液衝洗臍帶為衝洗3次。
【文檔編號】C12N5/0775GK103820386SQ201210469902
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2012年11月19日 優先權日:2012年11月19日
【發明者】韓為東, 郝好傑, 付小兵, 劉傑傑, 趙亞力, 伍志強 申請人:中國人民解放軍總醫院