木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法
2023-09-13 16:58:10 1
專利名稱：木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法
木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法
技術領域：
本發明涉及生物基化學品的生物製造和生物煉製領域，具體地說，是以玉米秸杆等木質纖維素為原料，使用同步糖化與發酵工藝生產微生物油脂，並將纖維素酶部分回收和廢水循環利用的方法。
背景技術：
生物柴油是最重要的可再生液體燃料產品之一，是採用動物或植物油脂及酯化交換反應得到的、具有與石化柴油同標號、相同使用效果的一種合成燃料。以植物油脂為原料生產生物柴油,原料成本佔生產成本的70% -85%。同時，作為生物柴油原料的菜籽油、大豆油、棉籽油、工業廢脂肪酸以及廚餘油等價格均高於或接近生物柴油成品。因此，生物油脂資源是制約生物柴油產業發展的主要瓶頸。自然界有少量微生物可以在適宜的條件下代謝環境中的碳水化合物，合成並貯存超過其細胞自身乾重20 %以上的油脂組分，具有這種特性的微生物統稱產油微生物。產油微生物細胞積累的油脂組分與植物油脂具有高度相似性，是一種優質的合成生物柴油的油脂資源。木質纖維素原料是自然界最為豐富的碳水化合物資源，全球每年的木質纖維素產量可達IO11噸。因此，利用廉價、豐富的木質纖維素原料生產微生物油脂具有廣闊的應用前景。近年來，發酵生產油脂的研究多有報導。Economou等用黴菌Mortierellaisabellina以甜高粱作物基質進行半固體發酵，含水量為92%時，產油量達到llg/100g乾物質。Angerbauer等用Lipomyces starkeyi以活性汙泥為基質進行發酵,含油率達到68%,經過超聲處理的汙泥產油達到1.0g/L。Chanika等用Rhodotorula glutinis以甘油為碳源，硫酸銨為氮源，吐溫20為表面活性劑進行發酵研究，在反補發酵過程中，最高油脂產量6.05g/L,油脂含量為60.r10A。Chen等篩選出了一種能夠廣泛耐受木質纖維素降解物的一株 Trichosporon cutaneum CXl0目前，儘管發酵生產油脂的研究有很多報導，但是，大多數微生物發酵生產油脂的底物都是澱粉基葡萄糖或環境和工業廢棄物，高昂的原料成本大大限制了微生物油脂的產業化發展，而微生物油脂生產產業化的關鍵在於廉價的發酵底物。同時，使用木質纖維素作為微生物油脂的發酵原料最大的成本在於纖維素酶的價格，因此，如何提高纖維素酶的酶解效率，降低纖維素酶加量，回收纖維素酶，成為進一步降低成本的關鍵。本發明提供一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，同時實現了纖維素酶的部分回收和發酵廢液的循環利用，有效降低了微生物油脂的生產成本，為微生物油脂的產業化提供了相關的技術儲備。
發明內容本發明目的在於將木質纖維素原料通過同步糖化與發酵技術轉化為可發酵糖並同時生產微生物油脂，以及發 酵結束後通過離心分離回收發酵醪上清液中纖維素酶的方法。本發明的構思:一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，具體地說是將發明人所在實驗室篩選分離的耐抑制物皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum CXl,活化之後接種於同步糖化與發酵的生物反應器中，加入纖維素酶，皮狀絲孢酵母把纖維素酶解生成的可發酵性糖同步轉化為微生物油脂；同步糖化發酵過程解除了糖化過程中葡萄糖濃度過高對酶解過程的抑制，以及發酵初始時葡萄糖濃度過高對皮狀絲孢酵母的生長和產油的抑制，因此可實現高效的同步糖化與發酵木質纖維素原料生產微生物油脂。另外，通過離心分離發酵醪，回收上清液中的纖維素酶，可以充分利用纖維素酶，實現纖維素酶的高效利用。本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，具體步驟為，(I)木質纖維素原料的預處理；所述的木質纖維素原料包括玉米秸杆、麥杆、稻杆、油菜杆、甜高粱杆、甘蔗渣、木屑、廢紙、柳枝稷或者麻風樹籽殼中的一種或幾種的混合物；所述的預處理方法包括稀酸預處理、機械預處理、鹼法預處理、熱水預處理、蒸汽爆破預處理、氨纖維膨爆預處理、生物預處理等，優選稀酸預處理；
(2)預處理後的物料脫毒處理；所述的脫毒方法包括水洗脫毒、過鹼化處理(Overliming)、活性炭吸附、樹脂吸附和生物脫毒等，優選生物脫毒；(3)對發酵菌種進行馴化培養；將凍存管中的菌種皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum CXl在種子培養基中活化24小時，然後經含有50% (v/v)種子培養基的木質纖維素水解液馴化培養24小時，最後接入水解液中馴化培養24小時，水解液由經過預處理的木質纖維素原料酶解獲得；所述的微生物油脂發酵菌種包括皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum、Rhodosporidium toruloides、Rhodotorula glutinis、Lipomyces starkey1、Yarrowialipolytico等，以及通過誘變、基因操作等方法改造的上述菌株或其他菌株；所述的菌種馴化方法是先將凍存的菌種在合成培養基中活化，然後在不同濃度的木質纖維素酶解液中進行馴化培養，最後在100%的木質纖維素酶解液中進行菌種培養；(4)將馴化好的菌種與原料、纖維素酶加入到反應器中進行同步糖化與發酵；將纖維素酶和脫毒後的木質纖維素原料加入反應器，加入營養鹽，在50°C，pH4.8的條件下預酶解0-24小時；然後在30°C，pH5.0的條件下接入馴化好的皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum CXl進行同步糖化與發酵生產微生物油脂；所述的同步糖化發酵生產微生物油脂時，木質纖維素的固體含量為10-15% (w/w)，纖維素酶量為3.0-15.0 FPU/g DM，溶氧水平10%-40%，發酵時間為24 96小時；營養鹽的添加量為:硫酸銨0-5.0g/L,七水合硫酸鎂0.5g/L，磷酸二氫鉀0-0.5g/L。FPU (Filter Paper Unit)是指纖維素酶濾紙酶活，DM (Dry matter)是指幹基木質纖維素；溶氧水平是指在一定條件下，溶解於水中分子狀態的氧的含量；(5)將發酵後的發酵醪液進行液固分離，固相組分進行微生物油脂提取，液相部分作為纖維素酶重新循環利用；將步驟(4)獲得的發酵醪經過固液分離，上清液全部回收使用，作為水和酶的混合物，同體則使用酸熱法進行油脂提取。所述的利用同步糖化與發酵生產的微生物油脂包括油酸、亞麻酸、亞油酸、二十二碳六烯酸等一系列飽和與不飽和脂肪酸所組成的甘油三酯。所述的發酵醪的固液分離包括離心、抽濾、壓濾、板框過濾等多種方法。所述的油脂提取方法包括酸熱法、有機溶劑提取法、超聲波破碎提取法等多種方法，優選酸熱法提取油脂。所述的發酵醪上清液中回收纖維素酶包括外切酶、內切酶和糖苷酶在內的所有纖維素酶組分；循環利用發酵醪上清液進行同步糖化與發酵時，可以補加部分纖維素酶，也可不補加纖維素酶；發酵醪上清液可以循環使用1-3次。與現有技術相比，本發明的積極效果是:(I)本發明使用同步糖化發酵技術，實現了纖維素原料生產微生物油脂，大大降低了固液分離工段的成本，同時，消除了葡萄糖對酶解過程的抑制，有效提高纖維素的酶解效率，減少了纖維素酶用量，降低生產成本；(2)本·發明對發酵後上清液進行了回收利用，實現了對纖維素酶的充分利用，大大降低了使用纖維素酶的成本，極大減少了發酵過程中水的用量，既降低了成本，又減少了廢水排放。
圖1實施例1發酵過程曲線圖；圖2實施例2發酵過程曲線圖。
具體實施方式以下提供本發明木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法的具體實施方式
。實施例1請參見附圖1，經粉碎、洗滌、烘乾後的玉米秸杆與稀硫酸溶液混合(固液比2: I, w/w),浸潤過夜後,含水量約為33% (w/w),基於幹稻杆的硫酸濃度2.5% (w/w);在190°C下預處理3分鐘，預處理後物料調節pH到5.5，含水量約60% (w/w)，加入生物脫毒所用菌種Amorphotheca resinae ZNl, 25°C固態培養5天；收穫物料,物料在115°C下滅菌20分鐘，冷卻後加入發酵罐中，發酵罐中固體含量質量分數分別為10%和15%，纖維素酶用量為7FPU/gDM，50°C預先糖化6小時和12小時，5摩爾每升氫氧化鈉控制發酵過程pH在
5.0，30°C下發酵72小時，最終油脂濃度分別為3.03和4.02g/L。實施例2請參見附圖2，經粉碎、洗滌、烘乾後的玉米秸杆與稀硫酸溶液混合(固液比2: I, w/w),浸潤過夜後,含水量約為33% (w/w),基於幹稻杆的硫酸濃度2.5% (w/w);在190°C下預處理3分鐘，預處理後物料調節pH到5.5，含水量約60% (w/w)，加入生物脫毒所用菌種Amorphotheca resinae ZNl, 25°C固態培養5天；收穫物料,物料在115°C下滅菌20分鐘，冷卻後加入發酵罐中，發酵罐中固體含量質量分數為10%，纖維素酶用量為7FPU/g DM, 50°C預先糖化6小時，5摩爾每升氫氧化鈉控制發酵過程pH在5.0，30°C下發酵72小時，最終油脂濃度為3.03g/L j5 4000rpm離心分離3分鐘後，發酵上清液完全回收使用，發酵操作如前所述，最終油脂濃度為1.57g/L以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對於本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護 範圍內。
權利要求
1.一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，具體步驟為， (1)木質纖維素原料的預處理； (2)預處理後的物料脫毒處理； (3)對發酵菌種進行馴化培養； 將凍存管中的菌種皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum CXl在種子培養基中活化24小時，然後經含有50% (v/v)種子培養基的木質纖維素水解液馴化培養24小時，最後接入水解液中馴化培養24小時，水解液由經過預處理的木質纖維素原料酶解獲得； (4)將馴化好的菌種與原料、纖維素酶加入到反應器中進行同步糖化與發酵； 將纖維素酶和脫毒後的木質纖維素原料加入反應器，加入營養鹽，在50°C，pH4.8的條件下預酶解0-24小時；然後在30°C，pH5. O的條件下接入馴化好的皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum CXl進行同步糖化與發酵生產微生物油脂； (5)將發酵後的發酵醪液進行液固分離，同相組分進行微生物油脂提取，液相部分作為纖維素酶重新循環利用； 將步驟(4)獲得的發酵醪經過固液分離，上清液全部回收使用，作為水和酶的混合物，固體則使用酸熱法進行油脂提取。
2.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的木質纖維素原料為玉米秸杆、麥杆、稻杆、油菜杆、甜高粱杆、甘蔗渣、木屑、廢紙、柳枝稷或者麻風樹籽殼中的一種或幾種的混合物。
3.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的預處理方法為稀酸預處理、機械預處理、鹼法預處理、熱水預處理、蒸汽爆破預處理、氨纖維膨爆預處理、生物預處理，優選稀酸預處理。
4.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的脫毒方法為水洗脫毒、過鹼化處理(Overliming)、活性炭吸附、樹脂吸附和生物脫毒，優選生物脫毒。
5.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的微生物油脂發酵菌種包括皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum>Rhodosporidium toruloides>Rhodotorula glutinis>Lipomycesstarkeyi、Yarrowia lipolytico,以及通過誘變、基因操作方法改造的上述菌株。
6.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的菌種馴化方法是先將凍存的菌種在合成培養基中活化，然後在不同濃度的木質纖維素酶解液中進行馴化培養，最後在100%的木質纖維素酶解液中進行菌種培養。
7.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的同步糖化發酵生產微生物油脂時，木質纖維素的固體含量為10-15% (w/w)，纖維素酶量為3. 0-15. O FPU/gDM，溶氧水平10%-40%，發酵時間為24 96小時；營養鹽的添加量為硫酸銨0-5. Og/L，七水合硫酸鎂O. 5g/L，磷酸二氫鉀.0-0. 5g/L ；FPU (Filter Paper Unit)是指纖維素酶濾紙酶活，DM (Dry matter)是指幹基木質纖維素。
8.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的利用同步糖化與發酵生產的微生物油脂包括油酸、亞麻酸、亞油酸、二十二碳六烯酸飽和與不飽和脂肪酸所組成的甘油三酯。
9.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的發酵醪的固液分離包括離心、抽濾、壓濾、板框過濾方法; 所述的油脂提取方法包括酸熱法、有機溶劑提取法、超聲波破碎提取法方法，優選酸熱法提取油脂。
10.如權利要求I所述的一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，其特徵在於，所述的發酵醪上清液中回收纖維素酶包括外切酶、內切酶和糖苷酶在內的所有纖維素酶組分；循環利用發酵醪上清液進行同步糖化與發酵時，補加部分纖維素酶，或者不補加纖維素酶；發酵醪上清液循環使用1-3次。
全文摘要
本發明涉及一種木質纖維素同步糖化與發酵生產微生物油脂並回收使用纖維素酶的方法，具體步驟為，(1)木質纖維素原料的預處理；(2)預處理後物料脫毒處理；(3)對發酵菌種進行馴化；(4)將步驟(3)中獲得的發酵菌種與原料、纖維素酶加入到反應器中進行同步糖化發酵；(5)將發酵後的醪液進行液固分離，固相進行微生物油脂提取，液相作為纖維素酶重新循環實施步驟(4)和(5)。本發明的優點以木質纖維素為原料採用同步糖化發酵工藝生產微生物油脂，提高了設備利用率和微生物油脂的生產效率；循環利用發酵醪中的液相組分，實現了纖維素酶的部分回收和發酵廢液的循環利用，減少了酶用量和廢水排放，降低了微生物油脂的生產成本。
文檔編號C12P7/64GK103255185SQ20121003975
公開日2013年8月21日 申請日期2012年2月21日 優先權日2012年2月21日 公開號201210039756.8
發明者鮑傑, 劉威, 張建 申請人:華東理工大學