陸地棉GhLFY蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
2023-09-13 03:36:15
專利名稱：陸地棉GhLFY蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及ー種陸地棉GhLFY蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
棉花是我國最重要的經濟作物之一，在國民生產中佔有重要 地位，但由於糧棉爭地，在一定程度限制了棉花的發展。短季棉品種的選育和推廣，可以緩解糧棉爭地的矛盾，是實現糧棉雙豐收的有效途徑。但目前短季棉存在早熟性不夠的問題。早熟性作為棉花的重要性狀之一，成為陸地棉重要的育種目標。研究表明，開花早晚與棉花的早熟性密切相關。因此克隆開花相關基因，對其進行表達分析和轉基因功能驗證，為短季棉育種提供優質的基因資源。
發明內容
本發明的ー個目的是提供ー種陸地棉GhLFY蛋白及其編碼基因。本發明提供了蛋白，是如下(a)或(b):(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過ー個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關的由序列2衍生的蛋白質。上述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。編碼上述蛋白的基因也是本發明保護的範圍。上述基因為如下I) -5)中任一一種的DNA分子I)序列表中序列I所示的DNA分子；2)序列表中序列I自5』末端第11-1231位核苷酸所示的DNA分子；3)序列表中序列I自5』末端第3-1300位核苷酸所示的DNA分子；4)在嚴格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼與植物開花相關蛋白的DNA分子；5)與I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物開花相關蛋白的DNA分子。上述嚴格條件為也可為在6父55(，0.5%505的溶液中，在65° C下雜交，然後用2 X SSC, O. 1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。含有上述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也是本發明保護的範上述重組載體具體為將上述基因插入表達載體中，得到表達上述蛋白的重組載體。上述重組載體具體為pRIlOl-GhLFY，為將序列表中的序列I插入pRIlOl的NdeI和EcoRI之間得到的載體。擴增上述基因全長或其任意片段的引物對也是本發明保護的範圍。上述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列4。上述蛋白、上述基因或上述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在如下I) -4)至少ー種中的應用也是本發明保護的範圍I)調節植物抽薹；2)調節植物開花；3)調節植物蓮座葉數量；4)調節植物莖生葉數量。上述應用中，所述調節植物抽薹為促進植物抽薹；所述調節植物開花為促進植物開花；所述調節植物蓮座葉數量為減少植物蓮座葉數量；所述調節植物莖生葉數量為增加植物莖生葉數量；所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進ー步具體為擬南芥。本發明的另ー個目的是提供ー種培育轉基因植物的方法。本發明提供的方法，為將上述蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物具有如下I) -4)中至少ー種表型I)所述轉基因植物的抽薹時間早於所述目的植物；2)所述轉基因植物的開花時間早於所述目的植物；3)所述轉基因植物的蓮座葉數量少於所述目的植物；4)所述轉基因植物的莖生葉數量多於所述目的植物。上述方法中，將上述蛋白的編碼基因通過上述的重組載體導入目的植物；上述目的植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進ー步具體為擬南芥。本發明的實驗證明，本發明發現了ー種新基因GhLFY，將其進行轉基因，得到轉基因植物的開花時間提前，且抽薹時間也提前，同時植物蓮座葉數量減少，莖生葉數量増加；因此利用該基因可用來培育生育期短的棉花，為轉基因植物的培育奠定了基礎。
、
圖I為GhLFY螢光定量分析圖2為植物表達載體pRI IOl-GhLFY表達載體的構建圖3為轉基因植株的PCR鑑定圖4為長日照條件下3個轉基因株系T3代純合體轉基因植株表型統計結果圖5為長日照條件下GhLFy基因在擬南芥的超表達表型
具體實施方式
下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。供試材料為早熟棉品種中棉所36 (CCRI36)(購自中國農業科學院棉花研究所)，於2010年種植於中國農業科學院老所部試驗田中，於2010年5月份取根、莖、葉、花、頂芽等不同組織，立即放入盛有液氮的液氮罐中，帶回實驗室後於_80°C冰箱存放備用。載體為pGEM '-TEasy Vector,購自 Promega 公司。菌種為大腸桿菌DH5ci購自天根生物技術有限公司。Taq DNA聚合酶購自普金生物有限公司，DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物技術有限公司，Amp、X_gal、IPTG、Rif、鏈黴素、Kan等抗生素為Sigma公司產品，SuperScriptTM III First-Strand Synthesis System for RT-PCR 試劑盒購自 invitrogen 公司，其餘試劑均為進口或國產分析純試劑。實施例I、棉花基因GhLFY的克隆一、棉花基因GHLFY的克隆1、RNA 的提取按照CTAB法，RNA的提取操作步驟(I)在離心管架上放置50ml的離心管，加15ml提取液於離心管後加入300ul
3-巰基乙醇，65°C水浴鍋預熱IOmin ；(2)將研缽及杵洗淨擦乾後倒入少許酒精燃燒殺菌，冷卻後再加液氮預冷，將2_3g早熟棉品種中棉所36的不同組織放入冷卻後的研缽中，迅速研磨，待研磨成細末狀後，將其用預冷的小勺刮入65°C預熱的提取液中，劇烈震蕩後放入65°C溫浴lOmin，期間震蕩3-4次；(3)加入等體積的氯仿異戍醇(24:1),立即劇烈震蕩IOmin, 13000rpm, 4°C下離心 5min;(4)小心取上清液，再加入等體積的氯仿異戊醇(24:1)，馬上劇烈震蕩，震蕩IOmin, 13000rpm, 4°C離心 5min;(5)取上清液於一新管，在上清液中加入1/4倍體積的lOmol/lLicl，輕柔混勻，
4°C冰箱過夜沉澱RNA;(6)將經過夜沉澱後的溶液在4°C條件下，13000rpm離心12min，將上清液倒掉，用400ul DEPC處理過的水溶解沉澱；(8)加入等體積的酹後立即劇烈震蕩，13000rpm,4°C離心5min ；(9)小心取上清液於一新管，在上清液中加入等體的氯仿異戊醇(24 :1)，立即劇烈震蕩，IOOOOrpm, 4°C，離心 5min ；(10)小心取上清液於另一新管，加1/10倍體積的3mol/L醋酸鈉和2. 5倍體積的無水乙醇，_70°C條件下沉澱大與30min ；(11) 4°C條件下，13000rpm 離心 IOmin,棄上清液，(12) 70%酒精洗沉澱1-2次；無水乙醇洗一次，風乾後溶於20ul DEPC處理過水中，取Iul電泳檢測，_70°C冰箱保存。2、cDNA的製備步驟使用Invitrogen 公司的 SuperScript III First-Strand Synthesis System forRT-PCR，使用前將每種複合物都短暫離心混勻。I)將DEPC處理過的0. 5ml的離心管放冰上，按下列順序加入Total RNA3ug50uM Oligo (dT) 20IulIOmM dNTP MixIul用DEPC-treated water 補足 IOul,配成 RNA/Primer mixture ；2) 65°C 保溫 5min，冰浴至少 Imin ；
3)在DEPC處理過的0. 5ml的離心管中準備cDNA SynthesisMix
CompenentVolume
IOxRT buffer2ul
25mM Mgcl24ul
0.IM DTT2ul
RNase OUTTM(40U/ul)Iul
SuperScriptTM III RTIul
Total VolumeIOul4)將 IOul cDNA SynthesisMix 加到 RNA/Primer mixture 中，輕柔混勻，短暫離心；5) 50°C保溫50min ;85°C保溫5min後放冰上，離心數秒收集反應液；6)加 IulRNaseH 到反應液中，37°C保溫 20min ；7)取Iul反轉錄產物電泳檢測，其餘_20°C保存備用。3、RACE 步驟SMARTer RACE cDNA Amplification kit購自 Clotech 公司，3，-RACE-Ready cDNA 的製備I)先在DEPC處理過的0. 2ml離心管中按照下列配方準備足量的Buffer Mix
成份體積
SxFirst-Strand Buffer2. Oul
DTT(20mM)I. Oul
dNTP Mix(IOmM)LOul
Total Volume4. Oul渦旋混勻後短暫離心，室溫放置，待用；2)在一新的 DEPC 處理過的 0. 2ml 離心管中加 3. 75ulRNA 和 Iul 3，-CDS PrimerA,渦旋混勻後短暫離心；在PCR儀上72°C孵育3min，42°C孵育2min後14000g離心IOsec ；3)按照下列順序室溫下準備Master Mix成份體積
Buffer Mix from step I)4. Oul
RNase Inhibitor(40U/ul)0 Z5ul
SMARTScribeTM Reverse Transcriptase(100U)I. Oul
Total Volume5.25ul4)將上一步配製的5. 25ul Master Mix加入到第2)步配製的4. 75ul反應液中，共IOul，輕輕吸打混勻後，在PCR儀上42°C孵育90min繼而72°C孵育IOmin ；5)用20ul Tricine-EDTA Buffer稀釋反應液,立即用於後續試驗或_20°C保存備用。4、3，-RACE PCR 擴增I)按照下列順序準備PCR Master Mix
成份體積
PCR-Grade Water34. bu丄
IOxAdvantage 2 PCR Buffer5ul
dNTP MixIul
50xAdbantage 2 Polymerase MixIul
Total Volume41. 5ul將反應液渦旋混勻後短暫離心。2)在 0. 5ml PCR 管中準備 PCR reactions
成份體積
3』 -RACE-Ready cDNA2. 5ul
UPM(IOx)5u I
GSP2(IOuM)Iul
Master Mix41. 5ul
Total Volume50ul3)在PCR儀上按照以下程序進行PCR:5cycles:94°C 30sec，72°C 3min5cycles:94°C 30sec，70°C 30sec，72°C 3min25cycles:94°C 30sec,68°C 30sec,72°C 3min瓊脂糖電泳檢測、膠回收、連接轉化和測序。5、基因克隆在NCBI上下載蓖麻、楊樹、葡萄、擬南芥、金魚草、玉米、大豆、水稻等物種的LFY同源基因蛋白序列，在雷蒙德氏棉基因組資料庫中執行blastx，將所得序列用CAP3在線拼接，將拼好的CONTIG在NCBI上做blastx分析。將通過在雷蒙德氏棉基因組資料庫裡做本地blast所得序列進行在線拼接，將拼接到的Contigs在NCBI上做blastx,根據比對結果，挑選含有起始密碼子的Contig5設計上遊引物，為得到較長序列挑選比對結果靠近3』端的Contigl的設計下遊引物。根據Contig5 和 ContigI 設計的上下遊引物(F: 5 』 -ATGGACCCTGAGACTTTTGC-3 』 ； R:5』-CATGTCCACCAGAAACCGAA-3』)，以中棉所36頂芽cDNA為模板進行PCR擴增，得到1095bp核心cDNA序列，為得到完整的0RF，以已擴增得到的cDNA核心序列為模板設計3』 RACE引物(F: 5，-GAGCACCCTTTCATCGTAACGGAGCC-3，; R: 5，-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3，(R 為試劑盒中提供的通用引物))，一次PCR即得到770bp的特異性條帶，根據重疊序列的比較和polyA尾巴的發現，確定所得序列為目的序列。整合核心cDNA和RACE結果，設計引物(F:5，-ATGGACCCTGAGACTITTGCT-3』 ；R:5』 -GCGAGGCTAAACTAAACTAAAC-3』)擴增 cDNA 序列，送去測序得到1336bp序列，開放閱讀框為1221bp，。1336bp的片段具有序列表中的序列1，將該序列所示的基因命名為GhLFY，其開放閱讀框長為1221bp，為序列表中序列I自5』末端第11-1231位核苷酸，編碼406個胺基酸，該基因編碼的蛋白的氣基酸序列為序列表中的序列2。二、棉花基因GhLFY的時空表達模式分析以中棉所36不同組織的cDNA稀釋50倍數作為模板，進行螢光定量，所用引物為F: 5 』 -GCAGTGTCGGGATTTCTTGATT-3，;R:5 』 -AGGCAATGTAGGGCGTAGCAAT-3，。具體操作步驟如下I)用01igo6.0設計螢光定量引物，PCR檢測引物特異性；2)按照下列順序配製螢光定量PCR體系
成份體積
SYBR GREEN I12. 5ul
Forward primerIul
Reverse primerIul
cDNA 模板2ul
ddHa09.5ul
Total Volume25ul設置3個重複，由於加樣會存在些許誤差，因此要按照樣品的個數多配製一些，以防樣品不足。3)採用相對定量A ACt法分析，以ACTIN為內參，引物序列為F:ATCCTCCGTCTTGACCTTG; R: 5 』 -TGTCCGTCAGGCAACTCAT-3，4) PCR 程序首先95°C預變性lOmin，然後95°C變性10s，60°C退火35s，72°C延伸35s，40個循環，72°C延伸lOmin，在72°C，30s處收集螢光信號。5)數據分析為了研究GhLFY基因的表達模式，qRT-PCR被用於檢測GhLFY在各個組織中的表達情況。
結果如圖I所示，a) GhLFY在不同組織中的表達分析，b) GhLFY在頂芽不同發育時期的表達分析I、II、III、IV、V分別代表第一片真葉至第五片真葉展平時的頂芽；發現，GhLFY在頂芽中優勢表達，而在根莖葉中表達量較低，這和其作為花分生組織特性基因控制花序分生組織向花分生組織轉換的職能相吻合。實施例2、棉花基因GhLFY的在促進植物開花中的應用—、表達載體的構建以中棉所36頂芽cDNA為模板(也可以人工合成的序列I作為模板)，以infusion引物(F: 5 』 -CACTGTTGATACATATGCTTCAAAAATGGACCCTGAGAC-3，(序列 3 ) ; R: 5 』 -TGTTGATTCAGAAITCTTCAGITCCAACTTAAACCATACA-3』(序列4)，擴增得到包含GhLFY基因完整開放閱讀框的PCR產物，經過測序，為序列表中序列I自5』末端第3-1300位核苷酸；將植物表達載體pRIlOl (Takara Code D3262)經過NdeI和EcoRI酶切，得到載體骨架； 將上述載體骨架與上述PCR產物用Clotech的Infusion連接試劑盒連接。pRIlOl的酶切體系如下
成份體積
IOxNEB緩衝液5ul
PRIlOl 質粒18ul
NdelIul
EcoRlIul
滅菌雙蒸水26ul
總體積50ulInfusion連接試劑盒的連接體系如下
成份體積
5xInfusion Buffer2ul
In-fusion EnzymeIul
_切後的pRIlOl載體4ul
PCR純化產物3ul
總體積IOul將連接產物37°C溫育15min，50°C溫育15min，放置冰上。用TE(PH8. 0)將連接液稀釋50倍，轉化大腸桿菌細胞，挑單克隆菌液提取質粒進行，結果為該質粒為將序列表中 的序列I自5，末端第3-1300位核苷酸插入pRIlOl的NdeI和EcoRI之間得到的載體，命名為pRIlOl-GhLFY，其結構示意圖如圖2所示。二、轉GhLFY擬南芥的獲得I、轉GhLFY擬南芥的獲得I)重組農桿菌的獲得
將質粒pRI 101-GhLFY 轉入農桿菌 LBA4404 (TAKARA Code :9115)感受態細胞中，得到重組菌。提取重組菌的質粒送去測序，該質粒為PRI 101-GhLFY，將含有該質粒的重組菌命名為 LBA4404/pRI 101-GhLFY。2)轉化 (I)擬南芥的種植先將野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana(ecotypeColumbia) (ABRC seed stock,Ohio State University facility))種子消毒(75% 的酒精洗3min, ddH20洗5次,0. 1%升萊洗3min, ddH20洗5次),在無菌的濾紙上晾乾,然後用無菌的牙籤將其挑至MS培養基上，用封口膜封口，再包上錫箔紙放置4°C春化，2-3天後去掉錫箔紙將其轉移至光溫培養箱(22°C，16h光照/8h黑暗)培養，待長出四片葉子後移栽至土中，轉移至擬南芥培養室培養架上(25°C，16h光照/8h黑暗)。(2)擬南芥的轉化接種LBA4404/pRIIOl-GhLFY於5mlLB培養基(含終濃度為50ug/ml的卡那)中，28°C，180rpm，振蕩過夜；以1:50比例轉接到200mlLB培養基中，280C，180rpm培養至0D600=1. 2 ；4000rp離心15min收集菌體，將菌體重懸於滲透緩衝液，以重懸滲透液為對照，調節0D600=0. 8 ;將開花的野生型擬南芥植株已授粉和結莢的用消過毒的剪刀剪去，將擬南芥花浸入裝有滲透緩衝液的小燒杯中浸染50seC，然後將浸染過的擬南芥植株放置大塑料桶中黑暗培養，24hr後於擬南芥培養室繼續培養；待果莢成熟後混合收種，得到Ttl代轉GhLFY擬南芥種子。將Ttl代種子經消毒春化後在加抗生素卡那黴素的MS培養基上培養，非轉基因株不能正常生長，篩選得到陽性Ttl代轉GhLFY擬南芥。2、轉基因後代的分子鑑定提取陽性Ttl 代轉 GhLFY 擬南芥的基因組 DNA，以 Forward primer (5』-GACGCACAATCCCACTATCC-3』)和 Reverse primer (5』-CCACCTATTACCATCTCCCAC-3』)為引物進行PCR擴增，以野生型擬南芥(WT)為對照。PCR 體系(25ul)如下
成份體積
ddH204ul
Kod Fx Neo buffer12. 5ul
dNTP5ul
Forward primerIul
Reverse primerIul
Kod Fx Neo0 5ul
DNAIul
Total Volume25ulPCR程序如下
權利要求
1.ー種蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質； (b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過ー個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關的由序列2衍生的蛋白質。
2.編碼權利要求I所述蛋白的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於所述基因為如下I)-5)中任一一種的DNA分子 1)序列表中序列I所不的DNA分子； 2)序列表中序列I自5』末端第11-1231位核苷酸所示的DNA分子； 3)序列表中序列I自5』末端第3-1300位核苷酸所示的DNA分子； 4)在嚴格條件下與I)或2)或3)限定的DNA序列雜交且編碼與植物開花相關蛋白的DNA分子； 5)與I)或2)或3)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼與植物開花相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌； 所述重組載體具體為將權利要求2或3所述基因插入表達載體中，得到表達權利要求I所述蛋白的重組載體。
5.擴增權利要求2或3所述基因全長或其任意片段的引物對。
6.根據權利要求5所示的引物對，其特徵在於所述引物對中的一條引物的核苷酸序列為序列表中的序列3，所述引物對中的另一條弓I物的核苷酸序列為序列表中的序列4。
7.權利要求I所述蛋白、權利要求2或3所述基因或權利要求4所述重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌在如下I) -4)至少ー種中的應用 1)調節植物抽薹； 2)調節植物開花； 3)調節植物蓮座葉數量； 4)調節植物莖生葉數量。
8.根據權利要求7所述的應用，其特徵在於 所述調節植物抽薹為促進植物抽薹； 所述調節植物開花為促進植物開花； 所述調節植物蓮座葉數量為減少植物蓮座葉數量； 所述調節植物莖生葉數量為增加植物莖生葉數量； 所述植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進ー步具體為擬南芥。
9.ー種培育轉基因植物的方法，為將權利要求I所述蛋白的編碼基因導入目的植物中，得到轉基因植物，所述轉基因植物具有如下I)-4)中至少ー種表型 1)所述轉基因植物的抽薹時間早於所述目的植物； 2)所述轉基因植物的開花時間早於所述目的植物； 3)所述轉基因植物的蓮座葉數量少於所述目的植物； 4)所述轉基因植物的莖生葉數量多於所述目的植物。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於 所述將權利要求I所述蛋白的編碼基因通過權利要求4所述的重組載體導入目的植物； 所述目的植物具體為雙子葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物進ー步具體為擬南芥。
全文摘要
本發明公開了一種陸地棉GhLFY蛋白及其編碼基因與應用。本發明提供的蛋白，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物開花相關的由序列2衍生的蛋白質。本發明的實驗證明，本發明發現了一種新基因GhLFY，將其進行轉基因，得到轉基因植物的開花時間提前，且抽薹時間也提前，同時植物蓮座葉數量減少，莖生葉數量增加；因此利用該基因可用來培育生育期短的棉花，為轉基因植物的培育奠定了基礎。
文檔編號C12N1/19GK102718853SQ201210213009
公開日2012年10月10日 申請日期2012年6月26日 優先權日2012年6月26日
發明者喻樹迅, 宋美珍, 龐朝友, 李潔, 範術麗, 魏恆玲 申請人:中國農業科學院棉花研究所