規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法
2023-09-20 07:01:25
專利名稱：規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法
技術領域：
本發明涉及微生物學技術領域，具體涉及一種規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法。
背景技術：
光合細菌作為一類重要的生物資源，在農業、畜牧業、水產養殖、環境修復和治理、 醫藥保健以及能源等領域已有深入的研究，並且在菌種資源、生產設備、製劑和產品、以及應用等方面取得了重要進展。但針對生產實踐和發展的要求，仍需要著力開發光合細菌菌種資源，規模化生產專一性好、效果穩定、高質量、高穩定性的產品和製劑。實現光合細菌製劑規模化生產離不開生產光合細菌的設備和裝置，自1980年以來，隨著光合微生物規模化應用的需求和發展，國內外對光生物反應器的研究和開發取得了很大進展，使生產規模有了很大提高，雖然「光」是光合細菌光生物反應器設計的核心問題，但無菌操作和徹底滅菌也是生產高純度高活性微生物製劑成敗的關鍵環節。若生產過程中達到嚴格無菌要求，一旦某個環節控制不嚴而發生雜菌汙染，不僅使生產效率降低，也使液態菌劑不純，產品在包裝、儲存和運輸過程中雜菌繁殖，甚至導致產品變質，將嚴重影響產品質量。
光生物反應器及其與反應器連接的裝置和連接管線能否徹底滅菌，是光合細菌純培養的關鍵。黃遵錫等(CN 2575103Y)為代表的採用金屬材料製備的反應器，光照採用耐高溫玻璃窗光照設計，雖然反應器和培養基能夠採用行業上公認的高溫方式滅菌，達到高純度培養，但其採用外置光源，光利用率低，由於受光源的限制，罐容積不能太大，否則反應器內部出現暗區，而且也沒有解決光合細菌趨光貼壁影響光傳遞效率的問題。目前，絕大多數大型光生物反應器和內置光源管光生物反應器都採用非金屬透光材料設計製造，其優點是光源利用率高，也可以直接利用太陽光，光利用率高，生產規模大。但採用傳統的高溫蒸汽滅菌很不安全，甚至損壞反應器。雖然這些透光材料化學性質穩定，具有很強的抗腐蝕性， 可以使用常規的化學消毒劑消毒，但消毒留有死角，很難達到整個反應器徹底滅菌的要求， 而且消毒劑有殘留，汙染環境。因而採用這類光生物反應器，滅菌不徹底，通常採用加大菌種接種量，培養優勢菌群，因而很難達到高純度培養的要求。如何解決滅菌的問題，是光生物反應器高效、高純度純培養光合細菌的關鍵。因此，建立一種適合於現有透光材料製造的光生物反應器、操作簡便、節能的滅菌方法是非常必要的。
臭氧具有強烈的殺菌作用。早在1991年，我國衛生部頒布的「消毒技術規範」中， 對臭氧的殺菌作用，使用範圍及使用方法都有明確的規定。明確肯定了臭氧的殺菌作用， 其殺菌原理是臭氧在常溫常壓下很不穩定，很快分解成O2和活性氧原子，活性氧原子具有很強的氧化殺菌作用，多餘的活性氧重新結合形成O2，因此，臭氧是一種無有害殘留的綠色殺菌劑。臭氧又是一種光譜的殺菌劑，可殺滅細菌、黴菌、芽孢、病毒和真菌等。我國的「消毒技術規範」充分說明了臭氧滅菌的原理和特點，為製藥廠選用臭氧滅菌工藝提供了依據， 也極大地推動了臭氧發生器製造工業的發展。儘管我國在GMP認證過程中早已推薦了臭氧滅菌方法，但臭氧在藥品生產中的應用是在近些年才熱起來，比較成功地應用在容器的滅菌、潔淨區域淨化、車間等空間的消毒滅菌、物品表面的消毒滅菌、水的消毒滅菌以及非無菌液體製劑微生物控制中用於生產設備、工具、容器、貯罐和輸液、輸料管道對產品的汙染等方面。除了在藥品生產中的應用以外，由於臭氧具有廣譜、高效、快速、安全的殺毒滅菌作用和特有的除臭和清潔空氣的作用，目前在工業、農業、食品和飲料、醫療衛生、環境汙染的治理、飲用水處理、汙水處理、畜牧養殖、水產養殖等各個領域廣泛應用，甚至應用於家庭。 市場上也有發酵罐消毒臭氧發生器的供應，並初步應用於傳統的金屬制發酵罐的消毒和滅菌，而且綠色、環保、節能，可以說是發酵行業滅菌的一場革命。發酵罐上連接很多管道和閥門，如何使臭氧滅菌不留死角，徹底滅菌是臭氧滅菌需要解決的關鍵問題。規模化發酵，發酵罐很多且體積較大，要求使用的臭氧發生器規模大，臭氧濃度高。若像傳統的蒸汽滅菌一樣，滅菌過程中將閥門適當開啟，使臭氧氣體流動，有利於臭氧滅菌，但臭氧排出，廠房內臭氧濃度過高，即使廠房通風，長期作業對操作人員身體有害，如何解決這一問題，也是臭氧在發酵行業上應用的基礎。再者，目前所使用的發酵罐材質多為金屬材質，抗腐蝕、抗氧化能力強，尤其是不鏽鋼材質內膽拋光發酵罐，對培養光合細菌而言，光利用率低，臭氧在發酵罐上使用的方法和參數工藝尚不明確的情況下，是否能用於有機玻璃等非金屬透光材料製作的光生物反應器系統的滅菌，是否對光生物反應系統有損壞作用，造成罐體、連接管線和閥門的腐蝕和滲漏。
有鑑於此，本發明人對非金屬透光材料製作的光生物反應器系統的臭氧滅菌方法進行了研究和改進，本案由此產生。發明內容
本發明的目的在於提供一種規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，針對非金屬高透光材料製備的光生物反應器難以採用傳統高溫蒸汽滅菌技術的一種滅菌補充，實現了對非金屬透光材料設計製造的光生物反應器的徹底滅菌，克服了化學消毒劑滅菌不徹底和消毒劑有害殘留的問題，操作簡單，節能環保。
為了達成上述目的，本發明的解決方案是
規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，將光生物反應器和光合細菌培養基的滅菌過程彼此分離，光生物反應器採用臭氧滅菌，培養基採用傳統的方式滅菌， 將滅菌的培養基移入滅菌的光生物反應器中進行光合細菌的高純度培養。採用臭氧對難以進行高溫滅菌的非金屬透光材料設計製造的光生物反應器內部進行滅菌，臭氧發生器安裝在光生物反應器上，對光生物反應器內部、連接的所有管道和閥門內部進行徹底滅菌，用於光合細菌的高純度培養。
進一步，對非金屬透光材料製造的光生物反應器採用臭氧方法滅菌，要求反應器與臭氧接觸的材質具有耐臭氧氧化的能力，包括罐體、內置光源及其套管、罐體組裝的墊圈、熱交換器、加熱器及驅動循環泵；閥門內部包括密封膠墊；內置光源套管安裝在罐體內部；熱交換器、加熱器及驅動循環泵安裝在罐體外部。
進一步，非金屬透光材料為耐臭氧氧化的材質，包括有機玻璃、玻璃和石英玻璃為主體設計製造的光生物反應器的罐體和內置光源管；要求反應器安裝所需要的密封墊和圈為矽橡膠材質；要求連接管道為PVC或PPR管或不鏽鋼管和相應的連接管件；閥門為優質塑料和不鏽鋼材質；閥門內部膠墊一律更換為聚四氟乙烯材料的墊片；要求驅動循環泵為電磁泵；熱交換器和加熱器材質為石英、不鏽鋼或玻璃。
進一步，臭氧發生器與光生物反應器底部進氣口通過管道和閥門連接，上排氣口安裝淨化氣體交換器和閥門，通過淨化氣體交換器的閥門與通向室外的管道連接，使臭氧氣體排出室外；光生物反應器上的連接管道，通過閥門控制安裝於臭氧發生器上，連接管道另一端連接到相應的氣體交換器。保持臭氧滅菌過程中，反應器和管道內部臭氧氣體的流動，使滅菌徹底。
進一步，多臺臭氧發生器連接在一個小型金屬儲氣罐罐上，通過儲氣罐的出口與光生物反應器連接；一個儲氣罐通過閥門控制和管道，可以與多組光生物反應器連接，由於臭氧發生器連續使用，產生臭氧的效率會下降，因此每臺臭氧發生器可以獨立工作，以便輪流使用。
進一步，廣3臺臭氧發生器連接在一個小型金屬儲氣罐進氣口上，儲氣罐的出口與光生物反應器連接，通過連接管道可以連接到光生物反應器上。通過閥門控制和臭氧發生器電源的開關，控制兩臺或三臺臭氧發生器可輪流使用。
進一步，採用光生物反應器直接通入臭氧和光生物反應器抽真空通入臭氧兩種方式滅菌。
進一步，光生物反應器直接通入臭氧的方式滅菌的方法為開啟臭氧控制器閥門和光生物反應器排氣閥門，將臭氧氣體通入光生物反應器、連接管道和相應的氣體交換裝置內部，臭氧通氣量達到反應器容積的41倍時，排氣口臭氧濃度不低於15ppm，繼續通氣 60mirT80min。先關閉氣體排出閥門，再關閉臭氧氣體進入閥門，反應器內部的臭氧氣體繼續在反應器中保持40mirT60min,即可達到徹底滅菌,滅菌後殘餘的臭氧氣體通過氣體交換器排出室外。在實際操作過程中，適當延長臭氧通氣滅菌時間，延長臭氧在反應器中保持時間，對設備和光合細菌的培養未見異常影響。
進一步，光生物反應器抽真空通入臭氧滅菌的方法為關閉相關閥門，開啟真空泵和抽真空控制閥門，將光生物反應器內部抽真空，真空度達到O. 05MPa^0. 08MPa，關閉抽真空控制閥門和真空泵開關。開啟臭氧發生器管道控制閥門，通入臭氧氣體，臭氧通氣量達到反應器容積的4、倍，開啟排氣閥門，排氣口臭氧濃度不低於15ppm,繼續通入臭氧氣體40mirT60mim,關閉排氣閥門和臭氧進氣控制閥門，臭氧在光生物反應器中保持為 20mirT40min,即可達到徹底滅菌,滅菌後殘餘的臭氧氣體通過氣體交換器排出室外。在實際操作過程中，適當延長臭氧通氣滅菌時間，延長臭氧在反應器中保持時間，對設備和光合細菌的培養未見異常影響。
本發明針對非金屬高透光材料製備的光生物反應器難以採用傳統高溫蒸汽滅菌技術的一種滅菌方法，用於光生物反應器菌懸液排空後殘留微生物菌體的滅菌，以及清洗後進入無菌培養基料前的滅菌。
本發明的基本思路是將光生物反應器和光合細菌培養基的滅菌過程彼此分離，光生物反應器採用臭氧滅菌，培養基採用傳統的方式滅菌，將滅菌的培養基移入滅菌的光生物反應器中進行光合細菌的高純度培養。本發明的滅菌方法，克服了現有常規化學消毒劑消毒，消毒劑只能消毒其達到的部位能，留有死角，很難達到整個反應器徹底滅菌的要求， 而且有消毒劑殘留，甚至導致二次汙染的問題。該方法彌補了非金屬高透光材料製備的光生物反應器難以採用傳統高溫蒸汽滅菌技術滅菌的難題，操作簡單、節能環保、無有害殘具體實施方式
實施例I
直接臭氧滅菌方法
八聯單控圓柱型光生物反應器，反應器罐體內徑為O. 40m,高為2. 0m，8個反應器以串聯的方式用管道連通，總容積約為2m3。罐體和內置光源套管材質為有機玻璃，上封頭和下封頭靠法蘭與罐體連接，連接處密封墊材質為矽橡膠，主要連接管道為PVC管和相應的連接管件，閥門為優質塑料材質，閥門內部膠墊一律更換為聚四氟乙烯材料的墊片。驅動循環泵為MP-100RM-380電磁泵。熱交換器為玻璃材質，加熱管為石英材質。選用臭氧產量為100g/h，流量約為O. 5^0. SmVmin的臭氧發生器滅菌。關閉或開啟反應器其它相關閥門，開啟臭氧控制器閥門和光生物反應器排氣閥門，將臭氧氣體通入光生物反應器、連接管道和相應的氣體交換裝置內部，臭氧通氣量分別達到反應器容積的4和8倍時，排氣口臭氧濃度均大於15ppm,排氣口排出的臭氧濃度已達到滅菌要求。反應器中連續通入臭氧2小時，停止滅菌。無菌操作將無菌水移入反應器中，接種沼澤紅假單胞菌菌種10L，開啟循環泵 lOmin，排空反應器。採用臭氧方法滅菌。滅菌結束後，將滅菌的無菌水泵入反應器內，開啟循環泵，使液體在反應器中循環10分鐘，無菌操作從反應器中取50ml液體，加入500ml藍蓋培養瓶中，加滿沼澤紅假單胞菌培養基，間隔I分鐘取樣，重複取樣6次，於20001uX培養箱中30°C培養10天，觀察培養液是否渾濁、變紅。
實驗一反應器中繼續通入臭氧時間分別為20min、40min、60min、80min,關閉排氣閥和臭氧發生器控制閥，停止通入臭氧，反應器中的臭氧在反應器中保持40min，分別取樣測定，臭氧通氣60min 80min,檢測瓶中均未見細菌生長。
實驗二 反應器中繼續通入臭氧通入時間分別為60min，關閉排氣閥和臭氧發生器控制閥，停止通入臭氧，反應器內部的臭氧氣體在反應器中保持0min、20min、40min、 60min,分別取樣測定,臭氧在反應器中保持20min"60min,檢測瓶中均無菌生長。
依據實驗結果，提高滅菌程度的把握，將通入臭氧時間定為60mirT80min，臭氧在反應器中保持時間定為40mirT60min。
實施例2
反應器抽真空，臭氧滅菌方法
利用實施例I的反應器和臭氧滅菌檢測方法，與實施例I不同之處，在於將反應器抽真空後，再通入臭氧滅菌，真空度在O. 05MPa^0. 08MPa之間。
實驗一通入臭氧氣體，臭氧通氣量分別達到反應器容積的4和8倍時，打開排氣口閥門，檢測排氣口臭氧濃度均大於15ppm,排氣口排出的臭氧濃度已達到滅菌要求。
實驗二 反應器中通入臭氧時間分別為20min、40min、60min、80min,關閉排氣閥和臭氧發生器控制閥，停止通入臭氧，反應器中的臭氧在反應器中保持40min，分別取樣測定，臭氧通氣40min"80min,檢測瓶中均無菌生長,達到滅菌要求。
實驗三反應器中通入臭氧時間為40min，關閉排氣閥門和臭氧進氣控制閥門， 臭氧在光生物反應器中保持為20min、40min、60min。分別取樣測定,臭氧在反應器中保持 20min^60min,檢測瓶中均無菌生長。
依據實驗結果，提高滅菌程度的把握，將通入臭氧時間定為40mirT60min，臭氧在反應器中保持20min 40min。
實施例3
光合細菌製劑的無菌檢測
紫硫細菌283-1菌株為厭氧菌，在固體平板上培養，不生長，將菌懸液塗布在固體平板上，若有菌生長，即為雜菌。採用實施例I的光生物反應器和臭氧滅菌方法對反應器滅菌，在滅菌罐中高溫滅菌紫硫細菌283-1菌株的培養基，冷卻至約35°C，無菌操作移入反應器。接種，控制溫度29°C 31°C，光照培養7天，常規管理，菌體在反應器中生長良好。取樣進行純度檢測，將樣品Iml塗布在5個肉湯瓊脂培養基的平皿中，未見雜菌生長，臭氧滅菌效果良好，培養過程中反應器封閉程度良好，反應器內部未被空氣汙染。經過12個月的運行，未見反應器內部和相關附件的腐蝕和滲漏。
本發明的滅菌方法將臭氧殺菌應用於光生物反應器的滅菌，實現了對非金屬透光材料製備的光生物反應器的徹底滅菌，奠定了光合細菌高純度培養的基礎，克服了現有常規化學消毒劑對反應器滅菌不徹底和消毒劑有害殘留的問題，解決了非金屬高透光材料製備的光生物反應器難以採用傳統高溫蒸汽滅菌技術滅菌的難題。與現有化學消毒劑消毒方法相比，操作簡單可靠、無有害殘留、綠色環保。與微生物發酵行業上，採用傳統的高溫蒸汽滅菌方法相比，操作更為簡單方便、節能環保、成本低廉。
以上僅為本發明的具體實施例，但本發明的設計構思並不局限於此，凡利用此構思對本發明進行非實質性的改動，均應屬於侵犯本發明保護範圍的行為。
權利要求
1.規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，光生物反應器米用非金屬透光材料製造，其特徵在於在光生物反應器上安裝臭氧發生器，利用臭氧對光生物反應器內部、連接的管道和閥門內部進行滅菌。
2.如權利要求I所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，其特徵在於光生物反應器，包括罐體、內置光源及其套管、罐體組裝的墊圈、熱交換器、加熱器及驅動循環泵；閥門內部包括密封膠墊；內置光源及套管安裝在罐體內部；熱交換器、加熱器及驅動循環泵安裝在罐體外部。
3.如權利要求2所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，其特徵在於罐體和內置光源管主體的材質採用有機玻璃、玻璃或石英玻璃；罐體組裝的墊圈材質為矽橡膠；熱交換器和加熱器材質為石英、不鏽鋼或玻璃；驅動循環泵為電磁泵；連接管道的材質為PVC、PPR或不鏽鋼；閥門的材質為塑料或不鏽鋼；閥門內部的密封膠墊材質為聚四氟こ烯。
4.如權利要求I所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，其特徵在於臭氧發生器與光生物反應器底部進氣ロ通過管道和閥門連接，反應器罐體上排氣ロ安裝淨化氣體交換器和閥門，通過淨化氣體交換器的閥門與通向室外的管道連接；光生物反應器上的連接管道，通過閥門控制安裝於臭氧發生器上，連接管道另一端連接到相應的氣體交換器。
5.如權利要求4所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，其特徵在於若干臭氧發生器連接在金屬儲氣罐罐上，通過儲氣罐的出口與光生物反應器連接；儲氣罐通過閥門控制和管道，與至少ー個光生物反應器連接；通過儲氣罐閥門控制和臭氧發生器電源的開關，控制一臺以上的臭氧發生器輪流工作。
6.如權利要求I所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，其特徵在於臭氧滅菌有兩種方式，ー種方式是臭氧直接通入光生物反應器中滅菌，另ー種是先將光生物反應器抽真空，再通入臭氧滅菌。
7.如權利要求6所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，其特徵在於臭氧直接通入光生物反應器中滅菌的具體方法開啟臭氧控制器閥門和光生物反應器排氣閥門，將臭氧氣體通入光生物反應器、連接管道和相應的氣體交換裝置內部，臭氧通氣量達到反應器容積的4 8倍時,排氣口臭氧濃度不低於15ppm,繼續通氣60min"80min,先關閉氣體排出閥，再關閉臭氧氣體進入閥，反應器內部的臭氧氣體在反應器中保持40min 60min,滅菌後殘餘的臭氧氣體通過氣體交換器排出室外。
8.如權利要求6所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，其特徵在於反應器抽真空通入臭氧滅菌的具體方法關閉相關閥門，開啟真空泵和抽真空控制閥門，將光反應器內部抽真空，真空度達到O. 05MPa^0. 08MPa，關閉抽真空控制閥門和真空泵開關。開啟臭氧發生器管道控制閥門，通入臭氧氣體，臭氧通氣量達到反應器容積的Γ8倍，開啟排氣閥門，排氣口臭氧濃度不低於15ppm,繼續通入臭氧氣體40mirT60mim,關閉排氣閥門和臭氧進氣控制閥門，臭氧在光生物反應器中保持20mirT40min,滅菌後殘餘的臭氧氣體通過氣體交換器排出室外。
9.如權利要求I所述的規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法的應用，其特徵在於用於光生物反應器排空後殘留微生物菌體的滅菌，以及清洗後進入無菌培養基 料前的滅菌。
全文摘要
本發明公開了一種規模化培養光合細菌的光生物反應器的臭氧滅菌方法，將光生物反應器和光合細菌培養基的滅菌過程彼此分離，光生物反應器採用臭氧滅菌，培養基採用傳統的高壓蒸汽的方式滅菌，將滅菌後的培養基移入滅菌後的光生物反應器中進行光合細菌的高純度培養。採用臭氧對難以進行高溫滅菌的非金屬透光材料設計製造的光生物反應器進行滅菌，利用臭氧的強氧化性對光生物反應器內部、連接的所有管道和閥門進行徹底滅菌。該方法操作簡單方便、節能環保且成本低廉，為光合細菌規模化高純度培養奠定基礎。
文檔編號A61L101/10GK102973961SQ201210480338
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者楊素萍, 趙春貴, 孟寧生, 張永軍 申請人:華僑大學, 石家莊乾豐生物科技有限公司