一種基因改組的方法及所獲得的重組基因和編碼蛋白的製作方法

2023-09-20 07:16:00 1

專利名稱：一種基因改組的方法及所獲得的重組基因和編碼蛋白的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因指導進化的方法，具體的說是一種基因改組方法及其應用，是一種特別適用於同源性較低的基因間改組的方法。
背景技術：
指導進化就是在實驗室中人為創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制(如突變、重組)，並定向選擇出所需性質的蛋白分子而不需要了解蛋白質的空間結構和功能。目前這一機制已經被廣泛的應用於蛋白質藥物，農業，化學工業，生物工程等領域(Patten，P.A.，Howard，R.J.Stemmer，W.P.C.Applications of DNA shuffling to pharmaceuticals and vaccines.Curr Opin Biotechnol.1997，8724-733)特別是被應用於提高酶的活性(Crameri，A.，Raillard，S-A.，Bermudez，E.Stemmer，W.P.C.DNAshuffling of a family of genes from diverse species acceleratesdirected evolution.Nature.1998，391，288-291.)穩定性(Oh，K.H.，Nam，S.H.Kim，H.S.Improvement of Oxidative and Thermostabilityof N-Carbamyl-D-Amino Acid Amidohydrolase by Directed Evolution.Protein Eng.2002，15，689-695.)，和表達水平(Bulter，T.et.al.Functional expression of a fungal laccase in Saccharomycescerevisiae by directed evolution.Appl.Environ.Microbiol.2003，69，987-995.)。隨著各種新型突變技術和新型的檢測系統的出現，對於指導進化的研究將向縱深發展。從某種程度上講，定向進化的基本策略與自然進化十分相似，兩個關鍵的步驟就是通過隨機誘變和體外重組產生分子多樣性並通過定向篩選或選擇得到優化的突變體。目前已經有很多種基因體外改組方法被提出並成功的應用，其中第一個也是最經典的是DNAshuffling技術(Stemmer，W.P.C.Rapid evolution of a protein in vitroby DNA shuffling.Nature 1994，370，389-391.)，該技術是由美國Stemmer於1994年提出的，它是對一組基因群體(進化上相關的DNA序列或曾篩選出的性能改進序列)進行改組，創造出新基因的方法。這種方法產生的多樣性文庫，可以有效積累有益突變，排除有害突變和中性突變，同時也可實現目的蛋白多種特性的共進化。但是當同源性低於70％的序列用該方法進行基因改組時，產物往往嚴重傾向於形成父母鏈的重新聚合鏈。儘管此後一些依賴於序列同源性的重組方法(Ostermeier，M.，Shim，J.H.Benkovic，S.J.A combinatorial approach to hybridenzymes independent of DNAhomology.Nat.Biotechnol.1999，17，1205-1209.；Zhao，H.，Giver，L.，Shao，Z.Arnold，F.H.Molecular evolution by staggeredextension process(StEP)in vitro recombination.Nat.Biotechnol.1998，16，258-261.；Jon，E.et al.Synthetic shuffling expandsfunctional protein diversity by allowing amino acids to recombineindependently.Nat.Biotechnol.2002，20，1251-1255.)被提出，但是都不能從根本上解決這一問題。

發明內容
本發明的目的是提出一種新的基因改組方法，即分隔-混合法(separating-mixing，簡稱SeMi)，有效的減少了改組過程對序列同源性的依賴；並提供運用該方法產生了改組基因和活性提高的改組蛋白。
為實現上述目的，本發明採用的技術方案為本發明利用了來自一個基因的單鏈DNA經過酶切的片段通過其3』端與另一個基因的同源性及5』端與自身基因的同一性的特徵，先將反應分成兩組，每一組先經過預重組，再將兩組反應物混合，經過一系列PCR反應步驟，經過一輪反應實現基因間的改組；具體為，1)選取兩種線性雙鏈基因A和B，基因的末端分別帶有能產生切口為不同粘性凸出末端的內切酶識別序列(如BglII和PstI等)，分別用ExoIII消化產生方向相反的兩組單鏈DNA---A』和B』；2)經消化後，分別取其中部分，用DNaseI消化成小片段A」和B」，並進行純化；3)將A』和B」及A」和B』分別混合，形成兩個反應體系I和II，然後進行單向PCR；隨後，在I體系中加入對應A』的5』端的反向引物，在II體系中加入對應B』的5』端的反向引物，分別反向擴增；4)將上述兩個體系混合，經套疊PCR擴增出全長片段；選擇目的大小的重組基因，進行篩選和表達。
本發明首先分別以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和大腸桿菌(Escherichia coli)總DNA為模板，擴增分別帶有EcoRI和NotI的metk(見圖1)和sam2(見圖2)基因，將兩個分別克隆到pSE380相應的酶切位點。以重組質粒位模板，擴增分別帶有BglII和PstI酶切位點並具有一段載體序列的sam2和metk基因，即上述兩種線性雙鏈基因A和B，其分別具有序列表SEQ ID No1中的核苷酸序列和序列表SEQ ID No2中的核苷酸序列；以上述兩基因為初始基因，經以下步驟實現基因間的改組1)對以上兩基因進行BglII和PstI雙酶切，並對酶切後的片段進行純化；2)用ExoIII消化(單向酶切)上述片段，以獲得單鏈DNA(ssDNA)並加以純化；3)分別取兩基因的50％總量的單鏈DNA基因用DNaseI進行酶切，得到小片段用80％乙醇沉澱，回收；4)反應分為兩組，在每一組中將來自一個基因的單鏈DNA片段與來自另一基因的全長單鏈DNA混合，並以全長單鏈DNA為模板，通過片段3』端的序列同源性，在taq DNA聚合酶作用下單向擴增至模板5』端；5)加入單向引物，通過不對稱PCR擴增雜合片段的互補單鏈，在此過程中通過短暫的復性/延伸實現交錯延伸；6)將兩組反應物混合，方向相反的互補片段間將會以交錯延伸的方式形成全長雙鏈，並在PCR過程中實現擴增；7)將重組基因連入表達載體並轉入釀酒酵母，通過篩選，得到抗乙硫氨酸的工程菌株，通過腺苷蛋氨酸含量的測定，分離得到含量提高的菌株及其所包含的重組基因。所獲得的重組基因及其編碼蛋白，具有序列表SEQID No3中的核苷酸序列及序列表SEQ ID No4中的胺基酸序列。
本發明具有以下優點1.本發明通過獨特的分組反應過程提供了一個新的基因改組方法，該方法特別適用於同源性較低的基因間的改組；2.使用本發明進行基因改組，僅通過一輪反應即可獲得改組基因；3.使用本發明獲得的改組基因是一種新的重組基因，核酸序列來源於兩個原始基因，並具有多點重組特徵，該基因可以在大腸桿菌中高效表達；4.使用本發明所獲得的重組蛋白(能催化腺苷蛋氨酸)分別來源於兩種初始酶；並且具有兩個胺基酸突變133Ala→Thr，354Glu→Asp，具有腺苷蛋氨酸合成酶活性，並且活力優於起始酶，具有更高的活性；5.引用本發明，可進一步提供直接用於生產重組酶的工程菌株。


圖1為擴增metk的瓊脂糖凝膠電泳圖；Lane MDNA marker DL2000；Lane1大腸桿菌基因組DNA；Lane2metk。
圖2為擴增sam2的瓊脂糖凝膠電泳圖；Lane MDNA marker DL2000；Lane1釀酒酵母基因組DNA；Lane2sam2。
圖3為本發明反應過程的示意圖；新的基因改組方法分隔-混合法；反應過程為1.兩種不同來源的DNA(白色的條形柱代表metk，黑色的條形柱代表sam2)分別用BglII和PstI雙酶切；2.上述片段分別用ExoIII單向酶切獲得單鏈DNA；3.部分單鏈DNA用DNaseI進行消化；4.通過無引物PCR單向擴增；5.通過有引物PCR獲得互補的單鏈DNA；6.混合兩組反應產物並擴增全長DNA；7.將重組基因克隆入載體並進行篩選和選擇。
圖4為改組過程的瓊脂糖凝膠電泳圖；Lane MDNA marker DL2000；Lane1metk；Lane2sam2；Lane3單鏈的metk；Lane4單鏈的sam2；Lane5經DNaseI消化的單鏈metk；Lane6經DNaseI消化的單鏈sam2；Lane7改組DNA；Lane8特異性延伸目的大小的改組DNA。
圖5為改組基因Ks09在釀酒酵母中表達的蛋白電泳圖；M為中分子量蛋白質Marker；Lane1-4分別代表包含有不同質粒的釀酒酵母的誘導表達蛋白Lane1包含有pYES2；Lane2包含有pYES2+metk；Lane3包含有pYES2+sam2；Lane4包含有pYES2+Ks09(改組基因)。
圖6為檢測重組酶誘導表達菌株腺苷蛋氨酸合成的HPLC圖(HPLC檢測腺苷蛋氨酸的胞內積累量)；a，b，c，d分別代表包含有不同質粒的釀酒酵母經誘導表達和抽提後的產物，其中a包含有pYES2，b包含有pYES2+metk，c包含有pYES2+sam2，d包含有pYES2+Ks09(改組基因)；e為腺苷蛋氨酸標準樣。
圖7為改組基因Ks09的測序圖譜。
具體實施例方式
實施例1一種來源於大腸桿菌JM109菌株的編碼腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因metk，具有序列表SEQ ID No1中的鹼基序列。
SEQ ID No1ATGGCAAAACACCTTTTTACGTCCGAGTCCGTCTCTGAAGGGCATCCTGACAAAATTGCTGACCAAATTTCTGATGCCGTTTTAGACGCGATCCTCGAACAGGATCCGAAAGCACGCGTTGCTTGCGAAACCTACGTAAAAACCGGCATGGTTTTAGTTGGCGGCGAAATCACCACCAGCGCCTGGGTAGACATCGAAGAGATCACCCGTAACACCGTTCGCGAAATTGGCTATGTGCATTCCGACATGGGCTTTGACGCTAACTCCTGTGCGGTTCTGAGCGCTATCGGCAAACAGTCTCCTGACATCAACCAGGGCGTTGACCGTGCCGATCCGCTGGAACAGGGCGCGGGTGACCAGGGTCTGATGTTTGGCTACGCAACTAATGAAACCGACGTGCTGATGCCAGCACCTATCACCTATGCACACCGTCTGGTACAGCGTCAGGCTGAAGTGCGTAAAAACGGCACTCTGCCGTGGCTGCGCCCGGACGCGAAAAGCCAGGTGACTTTTCAGTATGACGACGGCAAAATCGTTGGTATCGATGCTGTCGTGCTTTCCACTCAGCACTCTGAAGAGATCGACCAGAAATCGCTGCAAGAAGCGGTAATGGAAGAGATCATCAAGCCAATTCTGCCCGCTGAATGGCTGACTTCTGCCACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAAACCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAAACCGACAAAGCGCAGCTGCTGCGCGATGCTGCCGGTCTGAAGTAA(1)SEQ ID No1的信息(參見序列表)(a)序列特徵*長度1155鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA
(c)假設否(d)反義否(e)最初來源大腸桿菌(E.coli.)JM109菌株的編碼腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的metk基因(2)來源於大腸桿菌(E.Coli.)JM109菌株的編碼腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的metk基因的製備正向引物5』-ACCGAATTCATGGCAAAACACCTTTTTACGTCC-3』；反向引物5』-TACGCGGCCGCTTACTTCAGACCGGCAGCATCG-3』；下劃線序列分別為EcoRI和NotI酶切位點。
擴增條件以大腸桿菌JM109菌株總DNA為模板，以pfu DNA聚合酶進行擴增。
反應體系2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmol L-1dNTP、1mmol L-1各引物、100ng的DNA模板，總反應體積100μl；反應條件94℃變性2min；30個循環的94℃30s，64.2℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。PCR產物回收按上海華舜試劑盒使用說明書。目的產物見瓊脂糖凝膠電泳(圖1)。將目的基因經EcooRI和NotI酶切後克隆入pSE380載體的相應酶切位點，構建pSE380-metk重組質粒。
實施例2一種來源於釀酒酵母INVScI菌株的編碼腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因sam2，具有序列表SEQ ID No2中鹼基序列。
SEQ ID No2ATGTCCAAGAGCAAAACTTTCTTATTTACCTCTGAATCCGTCGGTGAAGGTCACCCAGACAAGATTTGTGACCAAGTTTCTGATGCTATTTTGGACGCTTGTTTAGAACAAGATCCATTCTCCAAGGTTGCCTGTGAAACAGCTGCCAAAACTGGTATGATTATGGTTTTCGGTGAAATTACCACCAAAGCTAGACTTGACTACCAACAAATAGTAAGAGATACCATCAAGAAGATTGGTTATGACGATTCTGCCAAGGGTTTCGACTACAAGACATGTAATGTTTTAGTAGCTATCGAACAACAATCTCCAGATATCGCTCAAGGTCTGCACTATGAAAAGAGCTTAGAAGACTTAGGTGCTGGTGACCAAGGTATAATGTTTGGTTACGCTACAGACGAAACTCCAGAAGGGTTACCATTGACCATTCTTTTGGCTCACAAATTGAACATGGCTATGGCAGATGCTAGAAGAGATGGTTCTCTCCCATGGTTGAGACCAGACACAAAGACTCAAGTCACTGTCGAATACGAAGACGACAATGGTAGATGGGTTCCAAAGAGGATAGATACCGTTGTTATTTCTGCTCAACATGCTGATGAAATTTCCACCGCTGACTTGAGAACTCAACTTCAAAAAGATATTGTTGAAAAGGTCATACCAAAGGATATGTTAGACGAAAATACCAAATATTTCATCCAACCATCCGGTAGATTCGTCATCGGTGGTCCTCAAGGTGACGCTGGTTTGACCGGTAGAAAGATTATTGTCGACGCTTACGGTGGTGCCTCATCCGTCGGTGGTGGTGCCTTCTCCGGTAAGGACTATTCCAAGGTCGATCGTTCCGCTGCTTACGCTGCTAGATGGGTTGCCAAGTCTCTAGTTGCCGCTGGTTTGTGTAAGAGAGTCCAAGTCCAATTTTCATATGCTATTGGTATTGCTGAACCATTGTCTTTACATGTGGACACCTATGGTACAGCTACAAAATCAGATGACGAAATCATTGAAATTATTAAGAAGAACTTCGACTTGAGACCAGGTGTGTTAGTAAAGGAATTAG
ATTTGGCTAGACCAATTTACTTACCAACCGCTTCTTATGGTCACTTCACTAATCAAGAGTACTCATGGGAAAAACCAAAGAAATTGGAATTTTAA(1)SEQ ID No2的信息(參見序列表)(A)序列特徵*長度1155鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA(c)假設否(d)反義否(e)最初來源釀酒酵母INVScI菌株的編碼腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因sam2。
(2)來源於釀酒酵母INVScI菌株的編碼腺苷蛋氨酸合成酶(2.5.1.6)的基因sam2的製備正向引物；5』-TCAGAATTCATGTCCAAGAGCAAAACT-3』；反向引物5』-CAAGCGGCCGCTTAAAATTCCAATTTCTTTGG-3』；下劃線序列分別為EcoRI和NotI酶切位點。
擴增條件以釀酒酵母INVScI菌株總DNA為模板，以Pfu DNA聚合酶進行擴增。
反應體系2.5U的pfu DNA聚合酶、1×pfu buffer、200μmol L-1dNTP、1mmol L-1各引物、100ng的DNA模板，總反應體積100μl；反應條件94℃變性2min；30個循環的94℃30s，59℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。PCR產物回收按上海華舜試劑盒使用說明書。目的產物見瓊脂糖凝膠電泳(圖2)。將目的基因經EcoRI和NotI酶切後克隆入pSE380載體的相應酶切位點，構建pSE380-sam2重組質粒。
實施例3採用新的基因改組方法對metk和sam2進行改組，獲得編碼熱穩定性高的重組酶的雜合基因，具有序列表SEQ ID No3的鹼基序列。
SEQ ID No3ATGTCCAAGAGCAAAACTTTCTTATTTACCTCTGAATCCGTCGGTGAAGGTCACCCAGACAAGATTTGTGACCAAGTTTCTGATGCTATTTTGGACGCTTGTTTAGAACAAGATCCATTCTCCAAGGTTGCCTGTGAAACAGCTGCCAAAACTGGTATGATTATGGTTTTCGGTGAAATTACCACCAAAGCTAGACTTGACTACCAACAAATAGTAAGAGATACCATCAAGAAGATTGGTTATGACGATTCTGCCAAGGGTTTCGACTACAAGACATGTAATGTTTTAGTAGCTATCGAACAACAATCTCCAGATATCGCTCAAGGTCTGCACTATGAAAAGAGCTTAGAAGACTTAGGTGCTGGTGACCAAGGTATAATGTTTGGTTACGCTACAAACGAAACTCCAGAAGGGTTACCATTGACCATTCTTTTGGCTCACAAATTGAACATGGCTATGGCAGATGCTAGAAGAGATGGTTCTCTCCCATGGTTGAGACCAGACACAAAGACTCAAGTCACTGTCGAATA
CGAAGACGACAATGGTAGATGGGTTCCAAAGAGGATAGATACCGTTGTTATTTCTGCTCAACATGCTGATGAAATTTCCACCGCTGACTTGAGAACTCAACTTCAAAAAGATATTGTTGAAAAGGTCATACCAAAGGATATGTTAGACGAAAATACCAAATTCTTCATCAACCCGACCGGTCGTTTCGTTATCGGTGGCCCAATGGGTGACTGCGGTCTGACTGGTCGTAAAATTATCGTTGATACCTACGGCGGCATGGCGCGTCACGGTGGCGGTGCATTCTCTGGTAAAGATCCATCAAAAGTGGACCGTTCCGCAGCCTACGCAGCACGTTATGTCGCGAAAAACATCGTTGCTGCTGGCCTGGCCGATCGTTGTGAAATTCAGGTTTCCTACGCAATCGGCGTGGCTGAACCGACCTCCATCATGGTAGAAACTTTCGGTACTGAGAAAGTGCCTTCTGAACAACTGACCCTGCTGGTACGTGAGTTCTTCGACCTGCGCCCATACGGTCTGATTCAGATGCTGGATCTGCTGCACCCGATCTACAAAGAATCCGCAGCATACGGTCACTTTGGTCGTGAACATTTCCCGTGGGAAAAACCAAAGAAATTGGAATTTTAA(1)SEQ ID No3的信息(參見序列表)(A)序列特徵*長度1155鹼基對*類型核酸*鏈型雙鏈*拓撲結構線性(b)分子類型DNA(C)假設否(d)反義否(2)採用新的綜合的基因改組機制對metk和sam2進行改組。
將上述兩個腺苷蛋氨酸合成酶基因metk和sam2經純化的PCR產物及pSE380載體分別用EcoRI和NotI進行消化(參照TaKaRa公司產品說明書)，然後以華舜試劑盒(上海華舜生物技術有限公司，下同)進行片段的純化，並以T4DNA連接酶(TaKaRa)分別將PCR片段和載體片段連接，構建成重組質粒pSE380-metk和pSE380-sam2。兩質粒分別被應用於擴增帶有共同載體末端同源片段的目的基因metk』和sam2』，其末端分別引入BglII和PstI限制性酶切位點(下劃線序列)。用於PCR擴增metk』的引物如下f15』-CAGAGATCTAATCACTGCATAATTCGTG-3』；r15』-CTGCTGCAGTCGTTTTATTTGATGCCTG-3』；用於PCR擴增sam2』的引物如下f25』-CAGCTGCAGAATCACTGCATAATTCGTG-3』；r25』-CTGAGATCTTCGTTTTATTTGATGCCTG-3』；上述兩個PCR都是在以下條件下進行94℃變性2min，隨後30個循環的94℃30s，53℃30s，72℃3min，然後72℃延伸10min。反應體系如下2.5U的pfu DNA聚合酶(TaKaRa)，2ng模板，1×pfu buffer，0.2mol L-1的dNTP混合物，1.0m mol L-1的MgCl2，反應總體積100μl。產物用PCR純化試劑盒純化，純化的片段用BglII和PstI(TaKaRa)進行酶切，反應條件參照產品說明書。酶切產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳，目的大小的DNA條帶用膠回收試劑盒進行回收。所得DNA片段經ExoIII(TaKaRa)單向酶切獲得全長單鏈DNA。分別取0.2μg的兩種單鏈DNA進行DNaseI消化，具體條件參照文獻(Zhao，H.Arnold，F.H.Optimization of DNAshuffling for high fidelity.Nucleic Acids Res.1997，25，1307-1308.)。在隨後的步驟中，反應被分為兩組進行，在每一組中，20ng的一種單鏈DNA和等量的來自另一個DNA的單鏈DNA片段分別混合在PCR管中，反應體系還包括1×taq buffer，0.2mmol L-1的dNTP混合物，1.5mmol L-1的MgCl2和1.25U taq DNA聚合酶(TaKaRa)，總反應體系是50μl。反應條件是94℃變性2min；10個循環的94℃30s，53℃2min；72℃延伸10min，然後分別加入16pmol的相應的反向引物r1 and r2，並進入下一個PCR反應，條件為94℃變性2min；60個循環的94℃30s，46℃10s。將兩組反應產物混合，添加2U的taq DNA聚合酶和5.3mmol的如下引物f35-CATCCGGCTCGTATAATGTGTG-3；r35-CGCCAGGCAAATTCTGTTTTATC-3；反應條件如下94℃變性2min；40個循環的94℃30s，46℃10s；10個循環的94℃30s，66℃10s。產物經0.8％的瓊脂糖凝膠電泳後，目的大小(約1.3kb)的片段經膠回收試劑盒純化後作為模板用於特異性的擴增目的基因，反應體系為1×taq buffer，0.2mmol L-1的dNTP混合物，50ng模板DNA，1.5mmol L-1的MgCl2和1.25U taq DNA聚合酶總體積為50μl。反應條件為94℃變性2min；30個循環的94℃30s，52℃30s，72℃3min；72℃延伸10min。產物經PCR純化試劑盒純化後，用EcoRI和NotI(TaKaRa)消化。產物經膠回收試劑盒純化後在T4DNA連接酶作用下連入經同樣雙酶切的pSE380載體(反應條件參照產品說明書)。重組質粒轉入E.coli JM109並塗布於含有100μg ml-1Amp和10mmol L-1ethionine的LB平板上，37℃培養12h。從存活菌株中提取重組質粒，並分別用EcoRI和NotI進行消化，產物經0.8％的瓊脂糖凝膠電泳後，目的大小的片段經膠回收試劑盒純化後亞克隆入經同樣雙酶切的pYES2表達載體，並轉化釀酒酵母INVScI。作為對照，將經過EcoRI和NotI雙酶切的metk和sam2克隆入經同樣雙酶切的pYES2表達載體，構建pYES2+metk和pYES2+sam2，上述兩質粒與pYES2分別被轉化入釀酒酵母INVScI。具體反應條件參照產品說明書。挑取基因工程菌單菌落接種到15ml修改的SC-U培養基(6.7g酵母氮源；5g蛋氨酸；0.1g的腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，賴氨酸，絡氨酸，蘇氨酸；0.05g的天冬氨酸，組氨酸，異亮氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，色氨酸和纈氨酸；終體積1L)，包括2％棉籽糖。30℃培養至OD600＝0.4，然後4℃下1500×g離心5min，然後將細胞重懸於2ml誘導培養基(修改的SC-U培養基，包含2％的半乳糖)，再接種到50ml的誘導培養基內，30℃條件下150r min-1搖床內培養6h。然後4℃下1500×g離心5min，倒掉上清，將沉澱重懸於500μl的純淨水。4℃下1500×g離心5min，倒掉上清，細胞用於檢測SAM積累。每1g菌體中加入5ml 1.5mol L-1的高氯酸以120r min-1搖動1h.進行抽提，生成的SAM水平用BioCAD 700E型HPLC(Perseptive Biosystem，Inc.U.S.A.)進行檢測。本試驗選用弱陽離子交換柱Poros20CM(4.6mm×100mm)，流動相為0.5mol L-1的HCOONH4，pH調整為4.0，流速為5ml min-1，在260nm波長下檢測產物，室溫22℃。以含有pYES2，pYES2+metk和pYES2+sam2的釀酒酵母菌株誘導表達產物作為對照，並以10μmol L-1SAM標準品標定SAM的生成。
取1ml發酵液離心，菌體沉澱用1ml蒸餾水洗滌，離心後重懸於1倍的上樣緩衝液中，沸水浴煮10min，12000×g離心2min。取10μl進行SDS-PAGE電泳，0.1％考馬斯亮藍染色，然後檢測蛋白的表達。
結果1.運用本發明所述的基因改組方法，經過一輪反應即獲得目的大小的重組DNA；2.在工程菌的細胞全蛋白電泳中有一條明顯的表達帶，誘導蛋白如圖5所示。分子量約為4.2K dalton；3.通過HPLC檢測，得到一株腺苷蛋氨酸胞內積累量提高的釀酒酵母菌株，並對其所含質粒pYES2+Ks09進行序列分析，確定其含有改組基因，並且具有多位點重組。
重組基因SEQUENCE LISTING110中國科學院瀋陽應用生態研究所120一種基因改組的方法及所獲得的重組基因和編碼蛋白130
1606170PatentIn version 3.121012111155212DNA213大腸桿菌(E.coli.)JM109菌株220
221CDS222(1)..(1155)223
4001atg gca aaa cac ctt ttt acg tcc gag tcc gtc tct gaa ggg cat cct48Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro1 5 10 15gac aaa att gct gac caa att tct gat gcc gtt tta gac gcg atc ctc96Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu20 25 30gaa cag gat ccg aaa gca cgc gtt gct tgc gaa acc tac gta aaa acc144Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr35 40 45ggc atg gtt tta gtt ggc ggc gaa atc acc acc agc gcc tgg gta gac192Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp50 55 60atc gaa gag atc acc cgt aac acc gtt cgc gaa att ggc tat gtg cat240Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His65 70 75 80tcc gac atg ggc ttt gac gct aac tcc tgt gcg gtt ctg agc gct atc288Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile85 90 95ggc aaa cag tct cct gac atc aac cag ggc gtt gac cgt gcc gat ccg336Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro100 105 110ctg gaa cag ggc gcg ggt gac cag ggt ctg atg ttt ggc tac gca act384Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr115 120 125aat gaa acc gac gtg ctg atg cca gca cct atc acc tat gca cac cgt432Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg130 135 140ctg gta cag cgt cag gct gaa gtg cgt aaa aac ggc act ctg ccg tgg480Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp145 150 155 160ctg cgc ccg gac gcg aaa agc cag gtg act ttt cag tat gac gac ggc528Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly165 170 175aaa atc gtt ggt atc gat gct gtc gtg ctt tcc act cag cac tct gaa576
重組基因Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu180 185 190gag atc gac cag aaa tcg ctg caa gaa gcg gta atg gaa gag atc atc624Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile195 200 205aag cca att ctg ccc gct gaa tgg ctg act tct gcc acc aaa ttc ttc672Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe210 215 220atc aac ccg acc ggt cgt ttc gtt atc ggt ggc cca atg ggt gac tgc720Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys225 230 235 240ggt ctg act ggt cgt aaa att atc gtt gat acc tac ggc ggc atg gcg768Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala245 250 255cgt cac ggt ggc ggt gca ttc tct ggt aaa gat cca tca aaa gtg gac816Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp260 265 270cgt tcc gca gcc tac gca gca cgt tat gtc gcg aaa aac atc gtt gct864Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala275 280 285gct ggc ctg gcc gat cgt tgt gaa att cag gtt tcc tac gca atc ggc912Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly290 295 300gtg gct gaa ccg acc tcc atc atg gta gaa act ttc ggt act gag aaa960Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys305 310 315 320gtg cct tct gaa caa ctg acc ctg ctg gta cgt gag ttc ttc gac ctg1008Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu325 330 335cgc cca tac ggt ctg att cag atg ctg gat ctg ctg cac ccg atc tac1056Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr340 345 350aaa gaa acc gca gca tac ggt cac ttt ggt cgt gaa cat ttc ccg tgg1104Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp355 360 365gaa aaa acc gac aaa gcg cag ctg ctg cgc gat gct gcc ggt ctg aag1152Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys370 375 380taa11552102211384212PRT213大腸桿菌(E.coli.)JM109菌株4002Met Ala Lys His Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Ser Glu Gly His Pro1 5 10 15Asp Lys Ile Ala Asp Gln Ile Ser Asp Ala Val Leu Asp Ala Ile Leu20 25 30Glu Gln Asp Pro Lys Ala Arg Val Ala Cys Glu Thr Tyr Val Lys Thr35 40 45Gly Met Val Leu Val Gly Gly Glu Ile Thr Thr Ser Ala Trp Val Asp50 55 60Ile Glu Glu Ile Thr Arg Asn Thr Val Arg Glu Ile Gly Tyr Val His65 70 75 80Ser Asp Met Gly Phe Asp Ala Asn Ser Cys Ala Val Leu Ser Ala Ile85 90 95Gly Lys Gln Ser Pro Asp Ile Asn Gln Gly Val Asp Arg Ala Asp Pro100 105 110Leu Glu Gln Gly Ala Gly Asp Gln Gly Leu Met Phe Gly Tyr Ala Thr115 120 125Asn Glu Thr Asp Val Leu Met Pro Ala Pro Ile Thr Tyr Ala His Arg130 135 140Leu Val Gln Arg Gln Ala Glu Val Arg Lys Asn Gly Thr Leu Pro Trp145 150 155 160Leu Arg Pro Asp Ala Lys Ser Gln Val Thr Phe Gln Tyr Asp Asp Gly165 170 175Lys Ile Val Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Ser Thr Gln His Ser Glu180 185 190Glu Ile Asp Gln Lys Ser Leu Gln Glu Ala Val Met Glu Glu Ile Ile195 200 205
重組基因Lys Pro Ile Leu Pro Ala Glu Trp Leu Thr Ser Ala Thr Lys Phe Phe210 215 220Ile Asn Pro Thr Gly Arg Phe Val Ile Gly Gly Pro Met Gly Asp Cys225 230 235 240Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile Val Asp Thr Tyr Gly Gly Met Ala245 250 255Arg His Gly Gly Gly Ala Phe Ser Gly Lys Asp Pro Ser Lys Val Asp260 265 270Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg Tyr Val Ala Lys Asn Ile Val Ala275 280 285Ala Gly Leu Ala Asp Arg Cys Glu Ile Gln Val Ser Tyr Ala Ile Gly290 295 300Val Ala Glu Pro Thr Ser Ile Met Val Glu Thr Phe Gly Thr Glu Lys305 310 315 320Val Pro Ser Glu Gln Leu Thr Leu Leu Val Arg Glu Phe Phe Asp Leu325 330 335Arg Pro Tyr Gly Leu Ile Gln Met Leu Asp Leu Leu His Pro Ile Tyr340 345 350Lys Glu Thr Ala Ala Tyr Gly His Phe Gly Arg Glu His Phe Pro Trp355 360 365Glu Lys Thr Asp Lys Ala Gln Leu Leu Arg Asp Ala Ala Gly Leu Lys370 375 38021032111155212DNA213釀酒酵母INVScI菌株220
221CDS222(1)..(1155)223
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重組基因180 185 190gtt att tct gct caa cat gct gat gaa att tcc acc gct gac ttg aga624Val Ile Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Ser Thr Ala Asp Leu Arg195 200 205act caa ctt caa aaa gat att gtt gaa aag gtc ata cca aag gat atg672Thr Gln Leu Gln Lys Asp Ile Val Glu Lys Val Ile Pro Lys Asp Met210 215 220tta gac gaa aat acc aaa tat ttc atc caa cca tcc ggt aga ttc gtc720Leu Asp Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val225 230 235 240atc ggt ggt cct caa ggt gac gct ggt ttg acc ggt aga aag att att768Ile Gly Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile245 250 255gtc gac gct tac ggt ggt gcc tca tcc gtc ggt ggt ggt gcc ttc tcc816Val Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser260 265 270ggt aag gac tat tcc aag gtc gat cgt tcc gct gct tac gct gct aga864Gly Lys Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg275 280 285tgg gtt gcc aag tct cta gtt gcc gct ggt ttg tgt aag aga gtc caa912Trp Val Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln290 295 300gtc caa ttt tca tat gct att ggt att gct gaa cca ttg tct tta cat960Val Gln Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His305 310 315 320gtg gac acc tat ggt aca gct aca aaa tca gat gac gaa atc att gaa1008Val Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Asp Glu Ile Ile Glu325 330 335att att aag aag aac ttc gac ttg aga cca ggt gtg tta gta aag gaa1056Ile Ile Lys Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu340 345 350tta gat ttg gct aga cca att tac tta cca acc gct tct tat ggt cac1104Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His355 360 365ttc act aat caa gag tac tca tgg gaa aaa cca aag aaa ttg gaa ttt1152Phe Thr Asn Gln Glu Tyr Ser Trp Glu Lys Pro Lys Lys Leu Glu Phe370 375 380taa11552104211384212PRT213釀酒酵母INVScI菌株4004Met Ser Lys Ser Lys Thr Phe Leu Phe Thr Ser Glu Ser Val Gly Glu1 5 10 15Gly His Pro Asp Lys Ile Cys Asp Gln Val Ser Asp Ala Ile Leu Asp20 25 30Ala Cys Leu Glu Gln Asp Pro Phe Ser Lys Val Ala Cys Glu Thr Ala35 40 45Ala Lys Thr Gly Met Ile Met Val Phe Gly Glu Ile Thr Thr Lys Ala50 55 60Arg Leu Asp Tyr Gln Gln Ile Val Arg Asp Thr Ile Lys Lys Ile Gly65 70 75 80Tyr Asp Asp Ser Ala Lys Gly Phe Asp Tyr Lys Thr Cys Asn Val Leu85 90 95Val Ala Ile Glu Gln Gln Ser Pro Asp Ile Ala Gln Gly Leu His Tyr100 105 110Glu Lys Ser Leu Glu Asp Leu Gly Ala Gly Asp Gln Gly Ile Met Phe115 120 125Gly Tyr Ala Thr Asp Glu Thr Pro Glu Gly Leu Pro Leu Thr Ile Leu130 135 140Leu Ala His Lys Leu Asn Met Ala Met Ala Asp Ala Arg Arg Asp Gly145 150 155 160Ser Leu Pro Trp Leu Arg Pro Asp Thr Lys Thr Gln Val Thr Val Glu165 170 175Tyr Glu Asp Asp Asn Gly Arg Trp Val Pro Lys Arg Ile Asp Thr Val180 185 190Val Ile Ser Ala Gln His Ala Asp Glu Ile Ser Thr Ala Asp Leu Arg195 200 205Thr Gln Leu Gln Lys Asp Ile Val Glu Lys Val Ile Pro Lys Asp Met
重組基因210 215 220Leu Asp Glu Asn Thr Lys Tyr Phe Ile Gln Pro Ser Gly Arg Phe Val225 230 235 240Ile Gly Gly Pro Gln Gly Asp Ala Gly Leu Thr Gly Arg Lys Ile Ile245 250 255Val Asp Ala Tyr Gly Gly Ala Ser Ser Val Gly Gly Gly Ala Phe Ser260 265 270Gly Lys Asp Tyr Ser Lys Val Asp Arg Ser Ala Ala Tyr Ala Ala Arg275 280 285Trp Val Ala Lys Ser Leu Val Ala Ala Gly Leu Cys Lys Arg Val Gln290 295 300Val Gln Phe Ser Tyr Ala Ile Gly Ile Ala Glu Pro Leu Ser Leu His305 310 315 320Val Asp Thr Tyr Gly Thr Ala Thr Lys Ser Asp Asp Glu Ile Ile Glu325 330 335Ile Ile Lys Lys Asn Phe Asp Leu Arg Pro Gly Val Leu Val Lys Glu340 345 350Leu Asp Leu Ala Arg Pro Ile Tyr Leu Pro Thr Ala Ser Tyr Gly His355 360 365Phe Thr Asn Gln Glu Tyr Ser Trp Glu Lys Pro Lys Lys Leu Glu Phe370 375 38021052111155212DNA213人工序列220
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權利要求
1.一種基因改組的方法，其特徵在於1)選取兩種線性雙鏈基因A和B，基因的末端分別帶有能產生切口為不同粘性凸出末端的內切酶識別序列，分別用ExoIII消化產生方向相反的兩組單鏈DNA---A』和B』；2)經消化後，分別取其中部分，用DNaseI消化成小片段A」和B」，並進行純化；3)將A』和B」及A」和B』分別混合，形成兩個反應體系I和II，然後進行單向PCR；隨後，在I體系中加入對應A』的5』端的反向引物，在II體系中加入對應B』的5』端的反向引物，分別反向擴增；4)將上述兩個體系混合，經套疊PCR擴增出全長片段；選擇目的大小的重組基因，進行篩選和表達。
2.按照權利要求1所述基因改組的方法，其特徵在於所述兩種線性雙鏈基因A和B分別具有序列表SEQ ID No1中的核苷酸序列和序列表SEQ ID No2中的核苷酸序列，以兩基因為初始基因，經以下步驟實現基因間的改組1)對以上兩基因進行BglII和PstI雙酶切，並對酶切後的片段進行純化；2)用ExoIII消化上述片段，以獲得單鏈DNA並加以純化；3)分別取兩基因的50％總量的單鏈DNA基因用DNaseI進行酶切，得到小片段用80％乙醇沉澱，回收；4)反應分為兩組，在每一組中將來自一個基因的單鏈DNA片段與來自另一基因的全長單鏈DNA混合，並以全長單鏈DNA為模板，通過片段3』端的序列同源性，在taq DNA聚合酶作用下單向擴增至模板5』端；5)加入單向引物，通過不對稱PCR擴增雜合片段的互補單鏈，在此過程中通過短暫的復性/延伸實現交錯延伸；6)將兩組反應物混合，方向相反的互補片段間將會以交錯延伸的方式形成全長雙鏈，並在PCR過程中實現擴增；7)將重組基因連入表達載體並轉入釀酒酵母，通過篩選，得到抗乙硫氨酸的工程菌株，通過腺苷蛋氨酸含量的測定，分離得到含量提高的菌株及其所包含的重組基因。
3.一種權利要求1所述方法獲得的重組基因及其編碼蛋白，其特徵在於具有序列表SEQ ID No3中的核苷酸序列及序列表SEQ ID No4中的胺基酸序列
全文摘要
本發明涉及基因指導進化的方法，具體地說是一種基因改組方法及其應用，利用了來自一個基因的單鏈DNA經過酶切的片段通過其3』端與另一個基因的同源性及5』端與自身基因的同一性的特徵，先將反應分成兩組，每一組先經過預重組，再將兩組反應物混合，經過一系列PCR反應步驟，經過一輪反應實現基因間的改組。通過測序結果分析，該方法在明顯優於以往基因改組方法，並特別適用於對同源性較低的基因進行改組；分別以來自於大腸桿菌和釀酒酵母的腺苷蛋氨酸合成酶基因metk和sam2為起始基因(其序列同源性僅為56％)驗證了該方法的有效性，並獲得了活性提高的重組酶。
文檔編號C12N15/52GK1834248SQ20051004603
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月16日 優先權日2005年3月16日
發明者吳文芳, 安迎鋒, 呂安國 申請人:中國科學院瀋陽應用生態研究所