一種發光底物及應用和含該發光底物的檢測試劑盒的製作方法

2023-09-21 00:12:00 3

一種發光底物及應用和含該發光底物的檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種發光底物及應用和含該發光底物的檢測試劑盒，旨在提供一種高靈敏度，高穩定性的發光底物及其檢測試劑盒，其技術要點是，該發光底物由A、B液組成，所述的A液包含下述組分：0.5～8mmol/L魯米諾、0.5～10mmol/L對碘苯酚、0.1mol/L?Tris-HCl緩衝液；所述的B液包含下述組分：1～10mmol/L過氧化脲、0.1mol/L?Tris-HCl緩衝液；該試劑盒包括包被有單克隆抗體的微孔板、HRP標記的單克隆抗體、凍幹標準品、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學發光底物。
【專利說明】一種發光底物及應用和含該發光底物的檢測試劑盒
【技術領域】
[0001]本發明公開了一種發光底物，本發明還公開了該發光底物的應用以及含該發光底物的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]近十年來標記免疫分析技術的研究和應用發展迅速，已廣泛應用於生物醫學基礎理論研究及臨床疾病診斷各領域。用於檢測血清學指標的方法主要包括放射性同位素免疫分析、酶聯免疫吸附法和化學放光免疫分析。
[0003]目前，臨床領域應用最為廣泛的定量免疫檢測方法主要是化學發光免疫分析(CLIA)，是一種敏感微量免疫測定法，兼有放射免疫(RIA)高靈敏度和酶聯免疫(ELISA)易操作等優點，同時又克服了放射免疫和酶聯免疫各自的缺點，是臨床免疫檢測最理想的方
法之一。
[0004]化學發光免疫分析法根據標記物的不同可分為三大類，即化學發光免疫分析、化學發光酶免疫分析和電化學發光免疫分析。其中以辣根過氧化物酶(HRP)標記的化學發光酶免疫分析(Chemiluminescence Enzyme Immol/Lunoassay, CLEIA)是以 HRP 標記生物活性物質(如酶標記的抗原或抗體)進行免疫反應，免疫反應複合物上的酶再作用於發光底物，激發化學發光底物產生光信號，利用發光信號測定儀進行發光測定。HRP有許多發光底物，但最常用的發光底物是魯米諾及其衍生物。在CLEIA中，使用HRP酶標抗體進行免疫反應後，在鹼性條件下，HRP和氧化劑(Η202)作用於發光底物魯米諾使其發生化學反應進而發光，利用光信號測定儀可以測量這種光信號。但是這種傳統的化學發光體系(HRP-H202-luminol)存在發光強。C低、不易測量等缺點。後來，研究發現在發光系統中加入增強發光劑，如含有取代基的酚類化合物(如4-(3-噻吩基)酚類化合物)、萘酚、取代的溴酸化合物、乙醯苯胺類化合物等，可以大大增強發光信號，並在較長的時間內保持穩定，便於重複測量，從而提高分析靈敏度和準確性。
[0005]原發性肝癌，尤其是肝細胞癌(Hepatocellular Carcinoma),作為世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是世界上各種實體腫瘤中預後效果較差的惡性腫瘤之一，並具有與B肝、肝硬化等密切聯繫的疾病特點，尤其近年其患病率在我國呈逐年上升趨勢。因此，肝癌的早期預警技術研究對於預防肝癌、預測肝癌的發病趨勢具有非常重要的研究價值和社會意義。目前臨床上廣泛應用的肝癌診斷標誌物AFP，但是對於早期肝癌的診斷，其敏感性、特異性均不理想。因此在臨床上希望獲得比甲胎蛋白特異性和靈敏度更高的新血清學指標，或者能夠與AFP進行互補的指標。其中高爾基體蛋白73 (GolgiProtein73，GP73)GP73是近年研究發現的最有可能成為更好的肝癌診斷尤其是早期肝癌診斷的血清標誌物。對於早期肝癌(Tl:單個結節,直徑<2cm及T2:單個結節,直徑位於2cm?5cm之間或者小於三個結節，每個直徑<3cm)的診斷，GP73的敏感性顯著優於AFP，而且AFP水平低於20 μ g/L的HCC患者中，多達57%的人群GP73水平顯著升高，這表明HCC患者GP73水平顯著升高，因此對於早期肝癌的診斷，GP73優於AFP。
【發明內容】

[0006]針對上述問題，本發明的目的在於提供一種高靈敏度、高穩定性的化學發光底物，並且提供了該發光底物的用途以及含有該發光底物的試劑盒，該試劑盒使用方便，靈敏度聞。
[0007]為解決上述技術問題，本發明提供的前一技術方案是這樣的:該發光底物由A、B液組成，所述的A液包含下述組分:0.5?8mmol/L魯米諾、0.5?10mmol/L對碘苯酹、0.lmol/L Tris-HCl緩衝液；所述的B液包含下述組分:1?10mmol/L過氧化脲、0.lmol/LTris-HCl緩衝液。
[0008]更優的,上述的發光底物,所述的A液包含下述組分:2.5mmol/L魯米諾、3.0mmol/L對碘苯酹、0.lmol/L Tris-HCl ;所述的B液包含下述組分:1.3mmol/L過氧化、0.lmol/LTris-HCl0
[0009]進一步的，上述的發光底物，所述的Tris-HCll緩衝液的pH值是8.5。
[0010]進一步的，上述的發光底物，所述的Tris-HCl緩衝液包括下述質量百分比的組分:0.05 ?0.3%BSA、0.01 ?0.05%Tween_20、0.01 ?0.1%proclin300,用 HCl 調節 pH 至
8.5。
[0011]本發明的另外一個技術方案是該發光底物作為製備ELISA定量檢測試劑盒的應用。
[0012]本發明的最後一個技術方案是含有該發光底物的試劑盒，所述的試劑盒包括包被有單克隆抗體的微孔板、HRP標記的單克隆抗體、凍幹標準品、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學發光底物。
[0013]進一步的，上述的試劑盒，所述的單克隆抗體為GP73特異性單克隆抗體5F10 ;所述的HRP標記的單克隆抗體為GP73單克隆抗體5B12*HRP。
[0014]11、進一步的，上述的試劑盒，所述的樣品稀釋液為pH7.4的含1%BSA、5%胎牛血清、0.l%Proclin300的0.01mol/L Tris-HCl緩衝液；所述的濃縮洗滌液為含0.05%Tween-20的PBST濃縮洗滌液。
[0015]與現有現有技術相比，本發明提供的技術方案具有如下優點:
[0016]1、本發明提供的發光底物，光信號強，靈敏度高，穩定性好，並且成本低；
[0017]2、本發明提供的試劑盒，利用該底物進行化學發光ELISA定量檢測GP73蛋白含量，大大提高了檢測GP73的靈敏度和特異性，可用於監測肝癌的早期診斷、肝硬化以及慢性肝炎的發展程度，為肝癌的預防、診斷以及治療提供了更有力的支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1是GP73化學發光定量檢測試劑盒靈敏性研究曲線圖；
[0019]圖2是實施例1中的化學發光底物與市場上同類化學發光底物對比分析示意圖；
[0020]圖3本發明提供的試劑盒的臨床樣品研究示意圖。
【具體實施方式】
[0021]下面結合【具體實施方式】，對本發明的權利要求做進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制，任何人在本發明權利要求範圍內所做的有限次的修改，仍在本發明的權利要求保護範圍內。
[0022]實施例1化學發光底物液的配製
[0023]底物配方如下:
[0024]配方1:
[0025]發光劑溶液A液:魯米諾2.5mmol/L、對碘苯酚3.0mmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0026]氧化劑溶液B液:過氧化脲1.3mmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0027]配方2:
[0028]發光劑溶液A液:魯米諾0.5mmol/L、對碘苯酚5.0mmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0029]氧化劑溶液B液:過氧化脲lmmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0030]配方3:
[0031]發光劑溶液A液:魯米諾8mmol/L、對碘苯酚10mmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0032]氧化劑溶液B液:過氧化脲10mmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0033]配方4:
[0034]發光劑溶液A液:魯米諾5mmol/L、對碘苯酚0.3mmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0035]氧化劑溶液B液:過氧化脲5mmol/L、pH8.5的Tris-HCl緩衝液；
[0036]配方I中Tris-HCl緩衝液、A液和B液的配置方法為:
[0037]緩衝液的配製:取Trisl2.1g,牛血清白蛋白1.0g, Tween-200.5ml,Proclin-3001.0ml，用800ml雙蒸水溶解，用濃鹽酸調節溶液的pH至8.5，用雙蒸水定容至1000ml,即為 0.lmol/LTris-HCl 緩衝液，含有 0.1%BSA、0.05%Tween_20、0.05%Proclin300,ρΗ8.5ο
[0038]發光劑溶液A液的配製:分別稱取魯米諾0.4429g，對碘苯酚0.6600g，其中魯米諾先用0.1M的氫氧化鈉溶解，對碘苯酚用二甲基甲醯胺(DMF)溶解，然後將上述兩種溶液用Tris-HCl緩衝液定容至1000ml，0.22um濾膜過濾，4°C避光保存。
[0039]氧化劑溶液B液的配製:稱取過氧化脲0.1200g，用Tris-HCl緩衝液溶解，並定容至1000ml，0.22um濾膜過濾，4°C避光保存。
[0040]配方2至4中的Tris-HCl緩衝液、A液和B液的製備方法與配方I中的Tris-HCl緩衝液、A液和B液製備方法類似，只需根據具體物質量濃度調節各個組分的用量。
[0041]實施例2
[0042]本發明提供的試劑盒包括包被有單克隆抗體的微孔板、HRP標記的單克隆抗體、凍幹標準品、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和實施例1中任意一種配方的化學發光底物。
[0043]下面以GP73化學發光定量檢測試劑盒為例，具有說明該檢測試劑盒的製備方法，也可以同樣應用於其它蛋白的檢測。
[0044]1、固相包被板的製備
[0045]a)包被:GP73單克隆抗體5F10以2ug/ml濃度包被微孔板，IOOul/孔，4°C包被18h ；
[0046]b)封閉:洗板2遍，拍幹，加入封閉液200ul/孔，37°C 1.5h。
[0047]c)封袋:棄封閉液，拍幹，在37°C培養箱進行乾燥lh，立即進行真空封袋。
[0048]2、標準品的製備:真核表達純化的GP73蛋白，用樣品稀釋液(具體為何種物質)倍比稀釋至濃度為 31.25ng/ml、15.6ng/ml、7.8ng/ml、3.9ng/ml、l.95ng/ml、0.98ng/ml、0ng/ml，經0.22um濾膜過濾，每種濃度的標準品分裝500ul/管，後經冷凍乾燥得到凍幹標準品。
[0049]3、酶標抗體的製備:GP73單克隆抗體5B12經改良的過碘酸鈉法-硼氫化鈉法標記辣根過氧化物酶HRP，即在低pH(pH4.4)下HRP經0.lmol/L的NaIO4氧化形成醛化酶，醒化酶與抗體分子5B12的氨基相連形成的斯夫氏臉,可進一步用4mg/ml的NaBH4還原得到穩定的酶標記抗體。得到的5B12*HRP用抗體稀釋液即pH7.4的含1%BSA、5%胎牛血清、
0.l%Proclin300 的 0.01mol/L Tris-HCl 緩衝液按 1/5000 稀釋，經 0.22um 濾膜過濾，分裝12ml/ 管。
[0050]4、配製濃縮洗滌液:配製20 X的含0.05%Tween-20的PBST濃縮洗滌液。
[0051]5、配製化學發光底物液:分別配製發光劑溶液A液以及氧化劑溶液B液，經
0.22um濾膜過濾，後分裝6ml/管，避光保存。
[0052]6、組裝為成品試劑盒，置於2_8°C保存。
[0053]實施例3本發明試劑盒的使用方法
[0054]以實施例2製備的GP73化學發光定量檢測試劑盒的具體操作如下:
[0055]1、試劑、樣本製備
[0056]a)試劑盒從4°C取出，室溫平衡放置20?30min ；
[0057]b)凍幹標準品每管加入500ul純水進行充分溶解；
[0058]c)濃縮洗滌液用純水以1/20稀釋成I X的洗滌液。
[0059]d)使用前將待測樣本置於室溫平衡20_30min，輕輕搖動混勻，若樣本出現沉澱物，應離心除去沉澱後使用，檢測所用標本應符合試劑盒的檢測範圍，若濃度過高，可用樣品稀釋液稀釋後再行檢測。
[0060]2、操作步驟
[0061]a)取出包被板，分別加入標準品以及待測樣品，IOOul/孔，37°C孵育50min ；
[0062]b)包被板拍幹，加入酶標二抗5B12*HRP，IOOul/孔，37°C孵育30min ；
[0063]c)洗板5遍，加入等體積混勻配製好的化學發光底物，IOOul/孔，Imin內進行Luminescence 讀值檢測；
[0064]d)以各標準品的發光值和相應濃度繪製標準曲線，得出發光值與濃度的關係方程式，將待測標本的發光值代入公式計算GP73蛋白含量。
[0065]實施例4GP73化學發光定量檢測試劑盒的靈敏性研究
[0066]使用實施例2製備的試劑盒，按實施例3所述步驟進行檢測，其結果如表I和圖1所示。可以看出本發明試劑盒繪製的標準曲線線性關係良好，檢測範圍在0.98?31.25ng/ml ο
[0067]表I
【權利要求】
1.一種發光底物，其特徵在於，由A、B液組成，所述的A液包含下述組分:0.5~Smmol/L魯米諾、0.5~10mmol/L對碘苯酹、0.lmol/L Tris-HCl緩衝液；所述的B液包含下述組分:1 ~10mmol/L 過氧化脲、0.lmol/L Tris-HCl 緩衝液。
2.根據權利要求1所述的發光底物，其特徵在於，所述的A液包含下述組分:2.5mmol/L魯米諾、3.0mmol/L對碘苯酹、0.lmol/L Tris-HCl ;所述的B液包含下述組分:1.3mmol/L過氧化脲、0.lmol/L Tris-HCl。
3.根據權利要求1或2所述的發光底物，其特徵在於，所述的Tris-HCl的pH值是8.5。
4.根據權利要求1或2所述的發光底物，其特徵在於，所述Tris-HCl緩衝液包括下述質量百分比的組分:0.05 ~0.3%BSA、0.01 ~0.05%Tween_20、0.01 ~0.1%proclin300，用HCl調節pH至8.5。
5.權利要求1所述的發光底物作為製備ELISA定量檢測試劑盒的應用。
6.一種含權利要求1所述的發光底物的試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒包括包被有單克隆抗體的微孔板、HRP標記的單克隆抗體、凍幹標準品、樣品稀釋液、濃縮洗滌液和化學發光底物。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述的單克隆抗體為GP73特異性單克隆抗體5F10。
8.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述的HRP標記的單克隆抗體為GP73單克隆抗體5B12*HRP。
9.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述的樣品稀釋液為pH7.4的含1%BSA、5% 胎牛血清、0.`l%Proclin300 的 0.01mol/L Tris-HCl 緩衝液。
10.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述的濃縮洗滌液為含`0.05%Tween-20的PBST濃縮洗滌液。
【文檔編號】G01N33/53GK103604918SQ201310625446
【公開日】2014年2月26日 申請日期:2013年11月28日 優先權日:2013年11月28日
【發明者】彭濤, 龍飛, 蘇文瀚, 肖靜, 殷仙麗, 盧然如 申請人:中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院, 佛山市燁泰科技有限公司