一種具有抗瘤活性的il-24多肽及其應用的製作方法

2023-09-20 16:04:05

專利名稱：一種具有抗瘤活性的il-24多肽及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於腫瘤生物治療技術領域，具體涉及一種具有抗瘤活性的IL-24多肽及其應用。
背景技術：
美國哥倫比亞大學Fisher PB教授實驗室1995年用重組人IFN-P和密執毒素 (mezerein, MEZ)處理人黑素瘤細胞(H0-1)後，通過消減雜交鑑別出mda-7/IL_24。它的分布具有高度局限性，僅分布在免疫系統和特定細胞(如黑色素細胞、痣、早期黑色素瘤細胞、平滑肌細胞、皮膚成纖維細胞、皮膚傷口邊緣和基底類成纖維細胞樣細胞)，在50多種腫瘤細胞中未檢測到MDA-7/IL-24蛋白的表達。近十七年的研究表明，mda-7/IL_24是抗腫瘤的「明星」分子。首先，能夠在體內和體外抑制多種癌細胞和腫瘤生長，選擇性誘導腫瘤細胞凋亡，而對正常細胞無明顯毒副作用，因而認為mda-7/IL-24是一種新的腫瘤抑制基因。其次，mda-7/IL_24與其他的腫瘤抑制基因不同，它對腫瘤細胞的生長抑制作用不依賴於腫瘤細胞中P53、p21、Rb和其他腫瘤抑制基因的表達與否，它能特異性地殺死MCF7和HeLa，而p53對這兩種細胞無法發揮殺死作用，它是具有廣譜抗瘤活性的腫瘤抑制基因。同時，mda-7/IL-24具有免疫調節能力，它能刺激外周血單核細胞PBMC產生IL-6、TNF P、IFN y，但對人PBMC無刺激增殖作用。正在用於基因療法的臨床試驗的p53、plO、Rb等抑癌基因，均不具有通過刺激免疫應答來殺傷腫瘤細胞的特性，mda-7/IL-24很可能是第一個既抑制腫瘤生長又刺激免疫系統的基因。最後， mda-7和其他藥物(表皮生長因子受體EGFR抑制劑gef itinib、Her2的單抗Trastuzumab/ Herceptin>Tamoxifen>Taxotere和Adriamycin)的聯合使用可產生疊加的抗瘤效果,可提高對二者單獨作用都不敏感的腫瘤細胞的藥物敏感性，在臨床上給這類腫瘤患者帶來新的治療希望。因此，對mda-7/IL-24基因的研究具有非常重要的理論和臨床意義。腫瘤手術、放療和化療是腫瘤治療的常用方法，化療的基本著眼點是藉助於化療藥物來殺傷腫瘤細胞，化療效果好與差的關鍵問題是提高化療藥物的有效性和特異性，降低其毒副作用。同時，在生物技術藥物中蛋白藥物是新藥開發的重要發展方向之一，蛋白質藥物可分為多肽和基因工程藥物、單克隆抗體和基因工程抗體、重組疫苗；與以往的小分子藥物相比，蛋白質藥物具有高活性、特異性強、低毒性、生物功能明確、有利於臨床應用的特點。由於其成本低、成功率高、安全可靠，已成為醫藥產品中的重要組成部分。腺病毒作為基因轉移工具相對於其他病毒載體更有優勢，如腺病毒顆粒比較穩定、操作簡單、可感染分裂細胞和非分裂細胞、外源基因表達水平較高。然而，腺病毒的靶向性問題、腺病毒的清除、生物安全性等缺陷限制了它的發展。相比較於腺病毒載體，以基因工程蛋白藥物的形式直接給藥就更為安全。抗腫瘤小分子多肽可針對腫瘤細胞生長、發展的不同階段，特異性殺傷、抑制腫瘤細胞。它們的分子量小、活性高，對多藥耐藥的腫瘤細胞系也具有良好的抑制活性；同時，小分子多肽可用多種方式給藥，不易引起免疫反應；相對於重組蛋白質類大分子藥物，結構易於改造，且人工化學合成的生產成本較低，這些都預示著小分子抗腫瘤肽在臨床的應用前景良好。美國學者發現了一條六個胺基酸殘基組成的小肽，它在體內能顯著抑制肺、胃及在大腸腺癌的生長，為治療這類死亡率很高的惡性腫瘤開闢了一條新路。瑞士科學家發現另外一個小肽(8個胺基酸殘基)，它能進入腫瘤細胞，激活抗癌基因P53，誘導腫瘤細胞的凋亡。將多肽與生物可降解的高分子可溶性化合物通過一定化學手段結合成複合物，可賦予多肽類藥物一些新的優良性能，如免疫原性降低或消失、不良反應減少；半衰期延長；專屬性強；物理、化學及生物穩定性增強。通常選用的高分子化合物有右旋糖酐、清蛋白、聚乙二醇(PEG)等，其中以PEG最為常用。通過對原來的多肽類藥物進行化學修飾不失為一種有效的提高穩定方法，已成為多肽類藥物研發的一個途徑。

發明內容
本發明的目的在於提供一種具有抗瘤活性的IL-24多肽。本發明的目的還在於提供上述具有抗瘤活性的IL-24多肽在製備抗腫瘤藥物中的用途。所述多肽的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO 1所示。所述IL-24多肽為人工合成。上述具有抗瘤活性的IL-24多肽在製備抗腫瘤藥物中的用途。所述腫瘤為黑色素瘤、食管癌或肺癌。本發明的有益效果本發明利用分子模建的方法設計多肽並人工合成，通過體外增殖實驗表明此多肽能有效抑制黑色素瘤和食管癌增殖，為開發出有效的治療腫瘤的新藥奠定了基礎。


圖I為檢索獲得的人IL-24序列彳目息。圖2為hIL-24 (TARGET)與IL_19(PDB註冊號lnlf)序列相似性分析。圖3為利用同源模建、力學優化技術獲得的hIL-24胞外區空間結構。圖4為利用K-S規則，基於模擬獲得的hIL-24空間結構預測的可能的二級結構模式。圖5為基於R-圖分析模擬獲得的hIL-24空間構型圖。圖6為IL-24溶劑可及性分析圖。圖7為IL-24表觀靜電分布情況圖。圖8為基於Binding Site預測模塊分析圖。圖9為IL-24多肽Ml的檢測，用HPLC方法檢測純度(左圖)，用質譜MS方法檢測分子量(右圖)。圖10為用免疫螢光細胞染色方法檢測腫瘤細胞(A375、Eca-109和A549)和正常的人胚肺細胞01EL)中IL-24R(IL-20R1、IL-20R2和IL-22R)的表達情況。圖11為MTT方法檢測IL-24多肽Ml對腫瘤細胞(A375、Eca_109和A549)和正常人胚肺細胞ffiL體外增殖能力的影響。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明做進一步說明。實施例I IL24多肽的分子模擬設計I、IL-24空間結構的理論模擬通過http://www. ebi. ac. uk檢索蛋白質資料庫，獲得IL-24序列信息如圖I所示。從圖I可以看出，人IL-24分子由206個胺基酸組成，其中I 51為信號肽，52 206 為胞外成熟鏈。85、99、126 為 N-糖基化位點。藉助 http://www. ncbi. nlm. nih. gov/ BlastP對蛋白質結構資料庫PDB進行相似性檢索，獲得與人IL-24序列相似性最高(相似性分數26. 8%)的蛋白質為細胞因子超家族成員——人IL-19，PDB註冊號為Inlf (Chang， C.，Magracheva, E.，Kozlov, S.，Fong, S.，Tobin, G.，Kotenko，S.，Wlodawer, A.，Zdanov， A. (2003) J. Biol. Chem. 278 :3308-3313)，序列相似性比較結果見圖2。利用計算機輔助同源模建技術，藉助InsightII2005程序包中的Homology模塊搭建hIL_24三維結構。依次選擇CVFF、Charmm力場,經最陸下降(收斂判據0. 02Kcal/mol,收斂步長200000步)、共軛梯度(收斂判據0. OlKcal/mol，收斂步長250000步)對獲得的hIL_24空間構象進行力學優化，獲得的穩定構象如圖3所示。從圖3可以看出，HIL-24具有細胞因子超家族成員的結構信息，由四條長的反平行螺旋結構(圖4 :螺旋A 13-28 ;螺旋8 48-69 ;螺旋(77-97 ； 螺旋D :110-149)通過無規捲曲連接而成。基於K-S規則確定的二級結構模式如圖4所示。 利用獲得的hIL-24空間結構，通過R-圖對其進行結構合理性評估，如圖5所示，從圖5可看出，獲得的hIL-24空間構象是合理的，提示選擇的模擬方法、構象優化力場及方法是適當的。2、基於IL-24空間結構的理化性質及表觀特徵分析蛋白分子的空間結構及其表觀性徵決定其生物學功能。藉助理論模擬獲得的 hIL-24空間結構，遵循溶劑可及性原理對IL-24分子的溶劑可及性進行分析，圖6給出了 IL-24溶劑可及性情況，藍色代表完全暴露在溶液中的胺基酸殘基，綠色部分代表埋藏在蛋白分子內部的殘基。從圖6可以看出，完全暴露在溶劑中的片段為LoopAB(29-50)、 LOOpCD(100-110)，可能構成IL-24潛在的功能位點。利用Delphi程序對獲得的IL-24表觀靜電分布進行分析，如圖7所示，圖中藍色代表正電區，紅色代表負電區，白色代表中性區。從圖7可以看出，LoopAB的N-端、LoopO)的C-端帶有較強的負電，LoopAB的C-端、 LoopCD的N-端帶有較強的正電，可能成為潛在的作用位點。3、IL-24空間結構的潛在活性位點的預測用模擬獲得的合理的IL-24空間結構，並結合預測的IL-24表觀理化性質(溶劑可及性、表觀靜電性質)，基於結合位點預測方法，合理定義球心，並預測其最可能的活性位置，如圖8所示，圖中的黃色球為定義的核心位置，綠色點為可能的活性位點。從圖7可以看出，IL-24可能的活性位置中，由於E、F位點由螺旋中的殘基組成，一般不能成為活性位點。其餘A、B、C、D位點均為LoopAB、LoopCD中的殘基，LoopAB的N-端、C-端以及LoopCD 的N-端成為活性位點的趨勢最強。根據前面總結的結果，設計多肽Ml如下22-51胺基酸，VKDTMQAQDNITSARLLQQEVL QNVSDAES(EQ ID NO :1)。實施例2、IL24多肽的化學合成
利用化學合成的方法合成多肽M1，並用高壓液相色譜(HPLC)分析多肽的純度，通過質譜(MS)檢測多肽的分子量。多肽Ml的HPLC純度為98. 46%,MS分子量為333. 34，與理論值3332. 68接近，見圖9。實施例3、細胞模型中IL-24受體的檢測利用免疫螢光細胞染色對所用細胞模型黑色素瘤A375細胞、食管癌Eca_109細胞、肺癌細胞A549和正常人胚肺HEL細胞中表達的IL-24受體(IL-24R)進行檢測。具體步驟如下將細胞以5000細胞/孔的量鋪入96孔板；37°C孵箱中培養24小時後，吸去上清，用緩衝液PBS洗細胞兩次，每次五分鐘，加入4%甲醛溶液，室溫固定10分鐘；吸去固定液，用PBS清洗五次，加入0. 5%的NP40溶液(用PBS緩衝液配製)室溫作用10分鐘，在細胞膜上打孔；吸去打孔液，PBS洗五次後，加入I %牛血清蛋白溶液(用PBS配製)室溫封閉30分鐘；吸去封閉液，加入用封閉液I : 10稀釋的IL-24R的抗體，加入的一抗分別為IL-20R1 (美國 R&D 公司，MABl 1762)，IL_20R2(美國 R&D 公司，AF1788)和 IL-22R(美國R&D公司，MAB2770)，用PBS代替一抗的處理作為陰性對照，4°C過夜；吸去一抗，PBS洗五次後，加入用封閉液I : 200稀釋的突光素TRITC標記的二抗(北京中杉金橋公司)，室溫避光作用I小時；吸去二抗，PBS洗五次後，加入DAPI溶液室溫避光染核15分鐘；PBS洗兩次後，在螢光顯微鏡下觀察和記錄結果。從圖10可知，A375、Eca-109和HEL表達三種 IL-24R(IL-20R1、IL-20R2 和 IL-22R)，而 A549 僅表達 IL-20R2, IL-20R1 和 IL-22R 的表達水平極低。實施例4、IL24多肽在體外對腫瘤細胞殺傷能力檢測用MTT法檢測細胞經IL24多肽Ml處理後的存活率Cancer Research, 2006, 66(24) :11869-11877，具體步驟如下將黑色素瘤A375細胞、食管癌Eca-109細胞、肺癌 A549細胞和正常人胚肺細胞HEL以2000細胞/孔的量鋪入96孔板，培養24細胞小時後分別加入不同濃度的多肽M1，作用4天後，每孔加入20 ill的MTT(5mg/ml)，37°C培養4小時後，吸去液體，加入150 u I的DMSO溶解沉澱，測定492nm處吸光度。所有的實驗重複三次，結果表示為平均值土SE。用SPSS軟體對數據進行雙側t分布檢驗的統計學比較分析， P < 0. 05為差異顯著，p < 0. 01為差異極其顯著。同時，為了進一步確定A375細胞增殖受到抑制是IL24多肽Ml的作用，分別將商品化的IL24抗體(免疫原為重組表達全長IL24 蛋白，有美國R&D公司單克隆抗體MAB1965和多克隆抗體AF1965兩種)和IL24R(IL20R1、 IL20R2和IL22R)的抗體與Ml —起加到A375細胞培養液中，選取三個Ml終濃度I、2、5 y g/ ml，抗體終濃度均為100ng/ml。其中，細胞存活率=處理樣品/未處理樣品。結果表明M1對兩種腫瘤細胞A375和Eca的增殖具有顯著的抑制作用，並且這種抑制作用可以被IL-24的抗體(多抗AF1965和單抗MAB1965)和IL-24R的抗體(IL-20R1、 IL-20R2和IL-22R)所中和。其中，多肽Ml在0. 5 y g/ml時對黑色素瘤A375細胞體外增殖能力有抑制作用，1-200 ii g/ml時抑制作用極其顯著(p < 0.01，表示為**，下同)，抑制率最高為27%，見圖Ila ;分別加入終濃度為100ng/ml的IL-24和IL-24R的抗體後，多肽的抑制作用被明顯中和，見圖lib。多肽Ml在g/ml時對食管癌Eca-109細胞體外增殖能力有抑制作用，IOu g/ml時抑制作用明顯(p < 0.05，表示為*，下同)，20-200 ii g/ml時抑制作用極其顯著(P< 0.01)，抑制率最高為21%，見圖Ilc ;同樣，這種抑制作用可被IL-24 和IL-24R抗體中和，結果見圖lid。多肽Ml在0. 5-100 ii g/ml對正常的人胚肺細胞HEL體外增殖活力無影響(圖lie)，同樣，多肽Ml對只表達IL-20R2的肺癌細胞A549的體外增殖能力影響很小(圖Ilf)。多肽Ml對腫瘤細胞A375和Eca-109的增殖有明顯的抑制作用， 而對正常的人胚肺細胞HEL和IL-24R表達水平較低的肺癌細胞A549影響很小，具有腫瘤選擇性。
權利要求
1.一種具有抗瘤活性的IL-24多肽，其特徵在於，所述多肽的胺基酸序列如序列表中 SEQ ID NO 1 所示。
2.根據權利要求I所述一種具有抗瘤活性的IL-24多肽，其特徵在於，所述IL-24多肽為人工合成。
3.權利要求I所述具有抗瘤活性的IL-24多肽在製備抗腫瘤藥物中的用途。
4.根據權利要求I所述具有抗瘤活性的IL-24多肽在製備抗腫瘤藥物中的用途，其特徵在於，所述腫瘤為黑色素瘤、食管癌或肺癌。
全文摘要
本發明公開了屬於腫瘤生物治療技術領域的一種具有抗瘤活性的IL-24多肽及其應用。該多肽的胺基酸序列如序列表中SEQ ID NO1所示。本發明利用分子模建的方法設計多肽並人工合成，通過體外增殖實驗表明此多肽能有效抑制黑色素瘤和食管癌增殖，為開發出有效的治療腫瘤的新藥奠定了基礎。
文檔編號A61P35/00GK102603887SQ201210102549
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月9日 優先權日2012年4月9日
發明者曹宇, 江紅, 王麗娜, 鄭曉飛, 金幫明, 陳曉琳, 馬群風 申請人:北京交通大學