可利用甲烷的微桿菌及其應用的製作方法

2023-09-20 10:02:35 2

專利名稱：可利用甲烷的微桿菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物領域，具體的說涉及一種可利用甲烷的微桿菌及其應用。
背景技術：
甲烷氧化菌是一種特殊的、以甲烷為唯一碳源和能源的甲基營養型微生物，分布 範圍很廣，在酸、鹼、鹽、高溫、低溫、貧瘠等很多環境下都發現甲烷氧化菌存在。其特殊的代 謝過程和代謝產物對全球環境具有重大影響，已經引起廣泛的關注。甲烷氧化菌不僅在全 球甲烷消耗中起重要作用，而且在碳、氮、氧循環中也發揮著重要作用。甲烷氧化菌是一種革蘭氏陰性菌，嚴格寡營養型。自1906年首次分離出 甲烷氧化菌以來，至今已經發現的甲烷氧化菌共有8個屬，主要包括甲基單胞菌屬 (Methylomonas)、甲基細菌屬(Methylobacter)、甲基球菌屬(Methylococcus)、甲基孢囊 菌屬(Methylocytis)、甲基彎曲菌屬(Methylosinus)、甲基微菌屬(Methylomicrobium) > Methylocaldum和Methylospera。根據代謝途徑、膜結構、主要磷脂脂肪酸成分等系列特 徵，可將甲烷氧化菌分為I型、II型和X型三大類型。甲烷氧化菌對甲烷氧化途徑有兩條， 一條是通過由乙醛酸到絲氨酸的途徑，另一條是甲醛結合在磷酸核糖上生成6-磷酸阿洛 酮糖的途徑。這些菌可以利用任何一條途徑來進行同化，總反應式CH4 — CH3OH — HCHO — HCOOH — CO2甲烷氧化菌的特徵酶是催化第一步反應的甲烷單加氧酶 (methanemonooxygenase,ΜΜ0)，MMO能斷裂非常穩定的C-H鍵，將分子氧中的一個氧原子插 入C-H中，另一個氧原子則生成水。它有兩種不同的類型顆粒狀或膜結合甲烷單加氧酶 (particulatemethane monooxygenase, pMMO)禾口可溶性甲燒單力口氧Bl (soluble methane monooxygenase, sMMO)。甲烷氧化菌研究速度過快導致了目前國內外研究報導中對該類細菌的稱謂存 在著不統一和歧義。以文獻報導為依據，對甲烷氧化菌進行全面介紹最早可追溯到1958 年，Leadbetter總結了自1906年首次發現甲烷氧化菌以來的研究成果，文章之所以提及 甲烷利用細菌而不是甲烷氧化菌，主要是因為當時研究條件以及研究深度和廣度的局限， 並不能給出這一類菌的共同特徵。在伯傑細菌手冊第八版(1984)中，將這一類菌歸屬於 了甲基單胞菌科，並定義這一類菌僅利用單碳有機化合物作為碳源，屬於革蘭氏陰性菌。 1996年，Hanson對甲燒氧化菌的稱謂進行了統一，即Methane-oxidation bacteria和 Methane-utilizingbacteria 者β^Τ禾爾為 methanotrophs。在伯傑細菌手冊關於甲基單胞菌科的描述中發現了另一個重要的信息，「許多細 菌是能利用多碳化合物以及單碳化合物，而不是專依靠甲烷或甲醇作為碳源和能源」。與 傳統意義上只以甲烷為唯一碳源和能源的甲烷氧化菌相區別，此類細菌稱之為兼性營養甲 烷氧化菌(facultative methanotrophs)。經典生物學研究在培養基優化中很少關注以甲 烷為碳源，目前，已有一些文獻報導了非甲烷氧化菌可以消耗甲烷。Wolf早在1979年就 發現了可以利用甲烷的酵母菌，目前有許多甲烷利用酵母被分離和純化，其中包括Pichiapastoris, Hansensulapolymorpha, Candida spp.，and Trichsporon spp.。兼性營養甲烷氧化菌可以利用其它碳源，因此更易實現擴大培養。生活垃圾在漫 長的降解過程中富含了豐富的微生物，前期研究表明礦化垃圾具有很好的降解甲烷能力， 從生活垃圾填埋場中提取兼性營養甲烷氧化菌有望在生活垃圾填埋場等人為源甲烷減排 的工程化方面取得新的突破，並為甲烷氧化在溫室氣體方面的工程應用提供新的平臺。

發明內容
本發明針對現有技術中甲烷生物無法工程化方面存在的不足之處，提供一種可以 高效利用甲烷的微桿菌，其保藏號為CCTCC NO :M2010099，其16SrDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。本發明所述的可利用甲烷的微桿菌，其菌落直徑Imm左右，淡黃色，半透明，突起， 邊緣光滑；革蘭氏染色陰性；最佳生長溫度為25 40°C，pH為6. 5 7. 5。本發明所述的可利用甲烷的微桿菌可用於製備甲烷生物吸收劑、垃圾處理劑或生 物催化劑。本發明的微桿菌DH(保藏號為CCTCC NO :M2010099，保藏單位為中國典型培養物 保藏中心-武漢大學保藏中心)，從生活垃圾填埋場礦化垃圾中分離得到的。該菌可高效利 用甲烷。菌株DNA的測序委託大連寶生物公司完成，微桿菌DH 16S rDNA鹼基測定的長度 為1397bp (SEQ ID NO 1),鹼基序列在GenBank核酸序列資料庫進行比較發現與微桿菌屬 (Microbacterium sp.)的3個菌株的同源性在99%以上。通過對該菌株進行的一系列生 理生化以及工藝優化試驗表明，本發明提供的可利用甲烷的微桿菌(MicrcAacterium sp.) DH(保藏號為CCTCC NO :M2010099)，可有效解決人為源甲烷的減排，主要優點如下(1)微桿菌(MicrcAacterium sp.)DH的發現克服了甲烷氧化菌菌體密度低，菌體 難於擴大培養等應用困難。(2)用微桿菌(MicrcAacterium sp.)DH的完整細胞作為生物催化劑，液體培養菌 體密度(560nm下菌液吸光度)可達到1. 1以上，比傳統甲烷氧化菌液體培養密度高出約 50% ；脫離環境體系後仍可維持較高的甲烷氧化活性；適用於高濃度甲烷氧化，血清瓶中濃 度為40% (ν/ν)的甲烷可完全降解。(3)該菌利用甲烷的半飽和常數Ks為7. 097mmol/L，遠低於目前報導的66mmol/L。 半飽和常數Ks越低說明菌體與底物的親和性越高，因此該菌對甲烷有較高的親和性。(4)微桿菌(MicrcAacterium sp. ) DH擴大培養所需的培養基簡單，成本低。特別 適用於生活垃圾填埋場、水稻田等甲烷人為源，可以廣泛推廣。為讓本發明的上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 並配合附圖，作詳細說明如下。


圖1是微桿菌(MicrcAacterium sp. )DH菌株切膠回收目的片段的DNA電泳圖，M DL2000DNAMarker ；1 :DH_PCR 產物；+ 正對照；-負對照；圖2是微桿菌(MicrcAacterium sp. )DH菌株的電鏡掃描照片；圖3表示微桿菌(MicrcAacterium sp. )DH菌株以甲烷為碳源的生長曲線；
圖4是不同碳源培養的微桿菌(MicrcAacterium sp. ) DH菌株對甲烷降解效果圖；圖5是不同碳源培養的微桿菌(MicrcAacterium sp.)DH菌株代謝過程二氧化碳 生產效果圖。
具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步的描述，但本發明的實施方式不限於此。1.實驗材料NMS 培養基的組成如下(g/L) =KH2PO4L Og · Λ Na2HPO4 · 12Η20 2. 9g · Λ MgSO4 ·7Η20 0. 32g ·ΙΛ (NH4) 2S043. Og · Γ1，微量元素溶液 10ml，蒸餾水 990ml，pH 6. 8。微量 元素溶液組成如下(mg/L) =ZnSO4 ·7Η20 0. 287 ；MnSO4 ·7Η200· 223 ；H3BO3O. 062 ；Na2M0O4 ·2Η20 0. 048 ；COCl2 · 6Η20 0. 048 ；KI 0. 083 ；CaCl2 · 2Η20 3. 5。垃圾顆粒選自生活垃圾填埋場礦化垃圾，本實施例選取上海老港垃圾填埋場(上 海市南匯區老港東部)已填埋10年的垃圾，取4mm篩下和2mm篩上垃圾顆粒，在甲烷和空 氣混合氣中密閉馴化2周以實現菌株的復壯。2.菌種富集與優化實驗1)富集培養稱取礦化垃圾Ig放入IOOml匪S培養基中，置於30°C、160轉/min 搖床振蕩2h。取菌懸液2ml作為種子接入分裝了 20ml匪S培養基的IOOml血清瓶中，加蓋 橡膠塞密封；用20ml甲烷氣置換瓶內20ml空氣，然後在30°C、160轉/min條件下振蕩培養一周。2)純菌分離用已冷卻的無菌蒸餾水對菌液進行10倍系列稀釋，製成稀釋度為 IO-1 UO-2的稀釋液。採用傾注法進行NMS培養基培養。將平板倒置於真空乾燥器中，並向幹 燥器中通入一定量的甲烷，然後用保鮮膜封口。將乾燥器置於生化培養箱中，30°C培養4 5天。將長勢好的菌種進行多次傳代，純化。3)優化實驗利用純菌株製備一定濃度的菌懸液，加入到裝有一定量匪S培養基 的血清瓶中；用甲烷置換瓶內空氣，之後具塞密封。在30°C、160轉/min條件下振蕩培養。 間隔一段時間檢測菌液濃度以及生物氣濃度。隨著甲烷的消耗，需定期補充一定體積的氮 氣，以消除瓶中負壓。3.菌種鑑定實驗使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit (Code No. D310) 進行PCR擴增目的片段。取5μ1進行3%瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa Agarose GelDNAPurification Kit Ver. 2. 0 (Code No. DV805A)切膠回收目的片段進行DNA測序。DNA 的測序委託大連寶生物公司完成。Wkq Forward,Seq Reverse、Seqhternal為引物進行 DNA測序。4.檢測方法菌液的OD值採用UV2000分光光度計檢測，波長為560nm。活細胞濃度採用平板 菌落計數法確定。菌體乾重通過一定體積的菌液在80°C下烘乾至恆重，用精密電子天平稱 量。每個實驗最少做2組平行試驗，確保RSD小於5%。甲烷的檢測採用氣相色譜(安捷倫6890N)。色譜條件⑶X不鏽鋼柱(IOmX 2mm)， 進樣口溫度、柱溫以及檢測器(TCD)溫度分別為80、50、120°C，氫氣為載氣，流速為25ml/min,進樣量 0. 5ml。實施例1微桿菌Microbacterium sp. DH的純化與鑑定該菌屬革蘭氏陰性，平鋪在整個培養皿中，表面光滑，呈現一層黃色油脂狀，有的 上面有淡黃色小菌落，菌落直徑Imm左右，半透明，突起，邊緣光滑；顏色有淡黃、黃色和桔 黃色，根據培養基及培養條件顏色有所不同。細胞電鏡掃描照片見圖2。細胞為短杆狀，中 間向內凹陷，似圓盆形，外徑0. 6 0. 7um,內徑0. 2 0. 4um，可產生有螢光的擴散性黃色 素。菌株的主要生理生化特性見表1。表1微桿菌Microbacterium sp. DH的理化特性
權利要求
1.一種可利用甲烷的微桿菌，其特徵在於，其保藏號為CCTCC NO :M2010099o
2.根據權利要求1所述的可利用甲烷的微桿菌，其特徵在於，其16SrDNA序列如SEQ ID NO 1 所示。
3.根據權利要求1或2所述的可利用甲烷的微桿菌，其特徵在於，菌落直徑Imm左右， 淡黃色，半透明，突起，邊緣光滑；革蘭氏染色陰性。
4.權利要求1所述的可利用甲烷的微桿菌在製備甲烷生物吸收劑中的應用。
5.權利要求1所述的可利用甲烷的微桿菌在垃圾處理中的應用。
6.權利要求1所述的可利用甲烷的微桿菌在製備生物催化劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種可利用甲烷的微桿菌及其應用。該微桿菌的保藏號為CCTCC NOM2010099。其可用於製備甲烷生物吸收劑、垃圾處理劑、生物催化劑。該微桿菌克服了甲烷氧化菌菌體密度低，菌體難於擴大培養等應用困難，對甲烷有較高的親和性。特別適用於生活垃圾填埋場、水稻田等甲烷人為源，可以廣泛推廣。
文檔編號C12R1/01GK102071160SQ20101026010
公開日2011年5月25日 申請日期2010年8月23日 優先權日2010年8月23日
發明者全學軍, 張麗傑, 趙天濤, 趙由才, 鄧鬱平 申請人:重慶理工大學