pGreenMax1真核表達載體及其製備方法

2023-09-20 09:58:50 4

專利名稱：pGreen Max1 真核表達載體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種分子生物技術領域的載體及其製備方法，特別涉及的是一種 pGreen Maxl真核表達載體及其製備方法。
背景技術：
真核表達載體主要用於在細胞內大量表達某些特定的蛋白，目前已有的真核表達載體主要有(l)pCMVp-NEO-BAN載體，該載體在大多數真核細胞中都可以高水平穩定地表達外源目的基因，並可以利用G418進行篩選。Q)pEGFPi^^JnU.S.Patent Nos. 5625048 issued on April 29，1997。pEGFP 載體的特點是可以表達綠螢光蛋白，通過固定波長的光波激發可以發出綠螢光，該載體可以表達一個蛋白，使之與綠螢光形成融含蛋白，用於確定外源基因在細胞中的定位，同時， 該載體可以用G418來篩選。上述載體都有不足之處，pCMVp-NEO-BAN載體可以很好的表達外援蛋白，但篩選克隆和鑑定蛋白的表達量比較困難，不利於篩選。PEGFP載體可以比較簡單的用於篩選和檢測蛋白的表達量，但是由於要與綠螢光蛋白融合形成融合蛋白，對目的蛋白構象、後續加工和分布會有影響。pGreenMax 1載體很好的解決了這幾個問題。它可以通過G418先進行初步的篩選克隆，然後可以根據細胞綠螢光的表達量來判斷穩定細胞株的目的蛋白的表達量，並且綠螢光蛋白和目的蛋白不是形成融合蛋白，而是分別形成兩個蛋白，對於目的蛋白構象和後續加工完全沒有影響。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術中存在的不足，提供一種pGreen Maxl真核表達載體及其製備方法，本發明可在哺乳動物細胞內高效表達蛋白或抗體，實現高產細胞株篩選提供穩定篩選標記。本發明是通過以下技術方案實現的本發明涉及的pGreen Maxl真核表達載體，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達載體重組獲得序列1，序列1共計7976bp，其中在第1769bp-2415bp之間插入了含有647bp的 Mex片段，在第3120bp-4^8bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。本發明涉及的上述pGreen Max 1真核表達載體的製備方法，包括設計引物從質粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，並將PCR產物經過SmaI位點定向插入到表達載體中，並經過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構建重組的pGreen Max真核表達載體。所述的pGreen Max 1真核表達載體的製備方法，包括如下步驟A、設計引物根據Mex序列設計引物，上遊引物加入RiieI位點，引物序列如下Mex FGATATCGTTTAAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGAT
Mex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以帶有Mex的質粒為模板，進行PCR擴增模板1 μ 1，上下遊引物10 μ M各1 μ 1，2. 5mM的dNTP底物4 μ 1，10倍緩衝液5 μ 1，pfu聚合酶1 μ 1，雙蒸水37 μ 1 ；95°C變性2分子；然後94°C變性30秒、55_65°C退火30秒、72°C延伸50秒，進行 30-40個循環；最後72°C延伸7-10分鐘；C、擴增產物純化PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離後，可見一條約647bp的擴增條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；D、pMex真核載體的構建D-1、酶切將載體用SmaI酶進行酶切，酶切時在反應體系中加入10倍緩衝液 2 μ 1, SmaI 1 μ 1，載體5 μ 1，無離子水12 μ 1，37°C水浴4個小時，酶切後的載體片段經瓊脂糖凝膠電泳分離後切膠回收；D-2、連接回收的Mex的片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應；D-3、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨苄黴素 100 μ 1/ml的LB培養基上37°C培養12-16小時；D-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆將菌落放大培養，純化提取質粒；D-5、利用SpeI進行酶切鑑定和測序，證實得到序列1的pMex真核表達質粒；E、得到IRES-EGFP序列在質粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，並經1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離後，可見一條約1300bp的條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction KitDNA純化試劑盒進行純化；F、pGreen Max 1真核表達載體的構建F-1、酶切將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切時在反應體系中加入10倍緩衝液 2 μ 1，BamHIly 1, NotIy 1, pMex載體5 μ 1，無離子水12 μ 1，37°C水浴4個小時，酶切後的載體片段經瓊脂糖凝膠電泳分離後切膠回收；F-2、連接回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應；F-3、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨苄黴素 100 μ 1/ml的LB培養基上37°C培養12-16小時；F-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆將菌落放大培養，純化提取質粒；F-5、利用HindIII進行酶切鑑定和測序，證實得到序列1的pMex真核表達質粒。步驟C中所述的PCR產物，其純化方法步驟如下①從瓊脂糖凝膠中將PCR產物DNA條帶切下，轉入離心管中，加入2倍體積的結合緩衝液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；②將離心管中溶解的凝膠溶液轉移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉/分鐘離心2分鐘；③向DNA吸附柱中加入700 μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液， 再加入500 μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液後，13000轉/分鐘離心2
分鐘，室溫放置5分鐘；④將DNA吸附柱加入一個新的離心管中，加入65°C預熱的洗脫緩衝液70 μ 1， 13000轉/分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產物DNA片段。步驟D-2中所述的連接，其連接方法如下在反應體系中加入回收的PCR產物DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1，去離子水7 μ 1，16°C反應10h。步驟F-2所述的連接方法是在反應體系中加入回收的DNA片段8 μ 1和載體片段 2 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應10h。步驟D-3所述的轉化大腸桿菌，其轉化大腸桿菌方法步驟如下①取連接產物IOul加到50ul的感受態細胞中，輕輕搖勻，冰浴30min.②42°C熱激90s，快速轉到冰浴2_;3min，注意不要搖動管。③向管中加入500ul 的 LB 培養基，150rmp，37°C，45min.④將菌液全部塗到LB平板上，含100ug/ml Amp.⑤將平板正置直至液體全部吸收。⑥倒置平板，於37°C培養12_16h.步驟D-4中所述的篩選重組真核表達載體陽性克隆，其篩選重組真核表達載體陽性克隆方法步驟如下①挑取轉化後的單菌落，接種到2ml含有氨苄青黴素(100μ g/ml)的LB培養基中，37°C，150rpm，搖床培養 12 16hr ；②取1-1. 5ml培養物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然後再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩餘菌液4°C保存；③將細胞沉澱漩渦震蕩打散後，重懸於100 μ 1冰預冷的鹼裂解液I中，漩渦震蕩， 使細菌懸浮均勻；④組菌重懸液中加入200 μ 1鹼裂解液II，上下翻轉離心管5次，使菌體充分裂解， 直至形成透亮的溶液，置於冰上(< 5min)；⑤加入150 μ 1冰預冷的鹼裂解液III，上下翻轉離心管8次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，並將離心管置於冰上1 :3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉移至另一個離心管中；⑥加400 μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm 離心2min，取上清於新離心管中；⑦用2 2. 5體積的乙醇(850 μ 1)室溫沉澱核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉；⑧加Iml左右70%乙醇於沉澱中，顛倒離心管數次，洗滌管壁與沉澱，如沉澱偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉澱漂浮，用槍頭將其置於離心管底部)；⑨打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發，直至離心管內沒有可見的液體存在；⑩加50 μ 1 TE緩衝液(含20 μ g/ml RNase Α)於離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻，貯存於_20°C。步驟D-5中所述的酶切鑑定和測序，其酶切鑑定和測序方法如下在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，限制性內切酶SpeI Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應池；經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離後鑑定pMex的目的條帶，SpeI酶切後可切出約1. 3kb和5. 3kb的兩個片段，與預期相符，表明目的片段已正確的插入載體中；步驟F-5中的酶切鑑定和測序，其酶切鑑定和測序方法如下在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，限制性內切酶HindIII Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應池；經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離後鑑定pGreen Max 1的目的條帶，HindIII酶切後可切出約4. 9kb,2. 9kb和230bp的三個片段，與預期相符，表明目的片段已正確的插入載體中。本發明應用的是EFl α啟動子，是人體內高表達蛋白的啟動子，可以避免外源啟動子對細胞的不良影響。同時該載體可以利用綠螢光的發光來表徵蛋白在細胞中的表達， 便於細胞株的篩選。可在高產哺乳動物細胞株的篩選提供蛋白表達及篩選的標記，為蛋白高效表達提供了很好的載體，也為細胞株的篩選提供一種新的方法和便利。


圖1是本發明的PCR的電泳照片；其中可以看到500bp到750bp之間有一個明顯的條帶，條帶大小與預期的647bp 大致相等，與預期相符，表明Mex序列PCR成功。圖2是本發明的pMex質粒的酶切鑑定的電泳圖片；其中經過SpeI酶切後，可以切出1.31Λ和5. 31Λ兩個條帶，與預期相符，表明Mex 片段已正確的插入到載體當中。圖3是pMex和IRES-EGFP的酶切電泳照片；其中經過BamHI和NotI酶切，載體大小為6. 6kb, IRES-EGFP序列為1. 3kb,與預
期大小相符。圖4是pGreen Max 1質粒酶切照片；其中，經過HindIII酶切，可以切出三個條帶，分別是4. 9kb、2. 9kb和230bp的條帶，與預期條帶相符，表明IRES-EGFP序列已經正確插入到pMex載體當中。圖5是轉染了蛋白A重組真核表達載體的細胞其中，轉染以後，細胞中可以表達綠螢光蛋白，可以用於細胞株的篩選。圖6是轉染了蛋白A重組真核表達載體的細胞的上清免疫螢光的照片圖7為抗體B蛋白電泳照片。其中，轉染以後，在細胞的上清中可以檢測到蛋白A的表達。表明載體構建成功並可以應用。
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的擔載蛋白的組織工程纖維支架及其製備和體外釋放實驗實施作詳細說明以下實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和過程，但本發明的保護範圍不限於下述的實施例。以下實施例中載體及基因來源說明特異引物由上海生工合成；載體構建中使用的限制性內切酶BamIII、NotI、pfu酶和T4連接酶均!^ermentas公司產品(生工生物工程 (上海)有限公司，021-37772180)；載體構建中使用的DNA純化試劑盒為索萊寶公司(上海索寶生物科技有限公司，上海市徐匯區欽江路)產品，按說明書進行；載體轉染(PEI為sigma公司產品)及分泌表達檢測試劑均為市售試劑。未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1pGreen Maxl真核表達載體構建方法A、設計引物根據Mex序列設計引物，上遊引物加入RiieI位點，引物序列如下Mex FGATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGATMex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以帶有Mex的質粒為模板，進行PCR擴增模板1 μ 1，上下遊引物10 μ M各1 μ 1， 2. 5mM的dNTP底物4 μ 1，10倍緩衝液5 μ 1，pfu聚合酶1 μ 1，雙蒸水37 μ 1 ；95°C變性2分子；然後94°C變性30秒、55-65°C退火30秒、72°C延伸50秒，進行30-40個循環；最後72°C 延伸7-10分鐘；C、擴展產物純化PCR產物經瓊脂糖電泳分離後，可見一條約647bp的擴增條帶，將目的條帶切下，用公司瓊脂糖凝膠純化試劑盒進行純化，方法是C-I、從瓊脂糖凝膠中將PCR產物DNA條帶切下，轉入離心管中，加入2倍體積的結合緩衝液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；C-2、將離心管中溶解的凝膠溶液轉移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉/分鐘離心2分鐘；C-3、向DNA吸附柱中加入700 μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液，再加入500 μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液後，13000轉/分鐘離心 2分鐘，室溫放置5分鐘；C-4、將DNA吸附柱加入一個新的離心管中，加入65°C預熱的洗脫緩衝液70 μ 1， 13000轉/分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產物DNA片段。如圖1所示，可以看到500bp到750bp之間有一個明顯的條帶，條帶大小與預期的 647bp大致相等，與預期相符，表明Mex序列PCR成功。D、pMex真核表達載體的構建D-1、酶切將載體用SmaI酶切，酶切的片段和載體經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離後切膠回收的方法是在反應體系中加入10倍緩衝液2 μ 1，SmaI 1 μ 1，載體5 μ 1，無離子水 12 μ 1，37°C水浴4個小時。D-2、連接回收的Mex片段和載體用T4連接美俄進行體外連接反應方法是在反應體系中加入回收的PCR產物DNA片段8μ 1和載體片段2μ 1，10倍緩衝液2μ 1，T4DNA連接酶1 μ 1，去離子水7 μ 1，16°C反應10h。D-3、轉化大腸桿菌將連接產物轉化入大腸桿菌感受態細胞中，在含有氨苄青黴素100μ 1/ml的LB培養基上37°C培養12-16小時，方法是a、取連接產物IOul加到50ul的感受態細胞中，輕輕搖勻，冰浴30min.b、42°C熱激90s，快速轉到冰浴2_;3min，注意不要搖動管。c、向管中加入 500ul 的 LB 培養基，150rmp，37°C，45min.
d、將菌液全部塗到LB平板上，含100ug/ml Amp.e、將平板正置直至液體全部吸收。f、倒置平板，於37°C培養12_16h.D-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆將菌落放大培養，純化提取質粒，方法是a.挑取轉化後的單菌落，接種到2ml含有氨苄青黴素(100 μ g/ml)的LB培養基中，37°C，150rpm，搖床培養 12 16hr。b.取l_1.5ml培養物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然後再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩餘菌液4°C保存。c.將細胞沉澱漩渦震蕩打散後，重懸於ΙΟΟμ 1冰預冷的鹼裂解液I中，漩渦震蕩， 使細菌懸浮均勻。d.細菌重懸液中加入200 μ 1鹼裂解液II，上下翻轉離心管5次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置於冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰預冷的鹼裂解液III，上下翻轉離心管8次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，並將離心管置於冰上1 3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉移至另一個離心管中。f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm 離心2min，取上清於新離心管中。g.用2 2. 5體積的乙醇(850 μ 1)室溫沉澱核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。h.加Iml左右70%乙醇於沉澱中，顛倒離心管數次，洗滌管壁與沉澱，如沉澱偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉澱漂浮，用槍頭將其置於離心管底部)。i.打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發，直至離心管內沒有可見的液體存在。j.加50 μ 1 TE緩衝液(含2 μ g/ml RNaseA)於離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存於_20°C。D-5、酶切鑑定和測序，證實得到的序列是真核表達質粒，方法是在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，限制性內切酶SpeI 1μ 1，去離子水13μ 1，37°C反應；如圖2所示，經過SpeI酶切後，可以切出1. 31Λ和5. 31Λ兩個條帶，與預期相符， 表明Mex片段已正確的插入到載體當中；E、得到 IRES-EGFP 序列在質粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，並經1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離後，可見一條約1300bp的條帶，將目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化如圖3所示，經過BamHI和NotI酶切，載體大小為6. 61Λ，IRES-EGFP序列為1. 3kb, 與預期大小相符。
F、pGreen Max真核表達載體的構建F-1、酶切將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切後的載體片段經瓊脂糖凝膠電泳分離後切膠回收。方法是在反應體系中加入10倍緩衝液2 μ 1，BamHI 1 μ l,NotI μ 1， pMex載體5μ 1，無離子水12μ 1，37°C水浴4個小時。F-2、連接回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應，方法是 在反應體系中加入回收的DNA片段8μ 1和載體片段2μ 1，10倍緩衝液2μ 1，T4DNA連接酶 1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應IOh0F-3、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨苄黴素 100 μ 1/ml的LB培養基上37°C培養12-16小時；F-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆將菌落放大培養，純化提取質粒；F-5、利用HindIII進行酶切鑑定和測序，證實得到序列1的pMex真核表達質粒。 方法是在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，限制性內切酶HindIII 1 μ 1，去離子水13 μ 1，37°C反應濁；如圖4所示，用瓊脂糖凝膠電泳分離後鑑定pGreen Max 1的目的條帶，經過 HindIII酶切，可以切出三個條帶，分別是4. 9kb,2. 9kb和230bp的條帶，與預期條帶相符， 表明IRES-EGFP序列已經正確插入到pMex載體當中。進行重組真核表達載體的測序，測序結果顯示該重組真核表達載體的序列1大小為，在與Mex、IRES-EGFP序列完全一致，說明成功構建了命名為pGreen Max 1真核表達載體，如序列1所示。實施例2真核表達載體的表達蛋白A、重組真核表達載體的獲得以蛋白A和蛋白B為例來進行說明。A-I、得到含有蛋白A和抗體B的重組載體通過PCR等技術獲得蛋白A和抗體B的序列，利用T4DNA連接酶的體外連接，得到含有蛋白A和抗體B的重組載體。A-2、重組表達載體的提取與純化用於轉染的pGreen Max 1重組蛋白A和pGreen Max 1重組抗體B的質粒用質粒小量抽提的方法進行提取與純化，具體操作步驟如下a.挑取轉化後的單菌落，接種到2ml含有氨苄青黴素(100μ g/ml)的LB培養基中，37°C，150rpm，搖床培養 12 16hr。b.取l_1.5ml培養物倒入1. 5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然後再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩餘菌液4°C保存。c.將細胞沉澱漩渦震蕩打散後，重懸於100μ 1冰預冷的鹼裂解液I中，漩渦震蕩， 使細菌懸浮均勻。d.細菌重懸液中加入200 μ 1鹼裂解液II，上下翻轉離心管5次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置於冰上(< 5min)。e.加入150 μ 1冰預冷的鹼裂解液III，上下翻轉離心管8次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，並將離心管置於冰上1 3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400 μ 1的上清轉移至另一個離心管中。f.加400μ 1酚氯仿(V V=I 1)，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm 離心2min，取上清於新離心管中。g.用2 2. 5體積的乙醇(850 μ 1)室溫沉澱核酸，混合均勻，室溫靜置2min。 13000rpm離心5min。小心的把上清倒掉；然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉。h.加Iml左右70%乙醇於沉澱中，顛倒離心管數次，洗滌管壁與沉澱，如沉澱偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出(若沉澱漂浮，用槍頭將其置於離心管底部)。i.打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發，直至離心管內沒有可見的液體存在。j.加50 μ 1 TE緩衝液(含2 μ g/ml RNaseA)於離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻。貯存於_20°C。B、蛋白A重組真核表達載體和抗體B重組真核表達載體在細胞中的分泌表達轉染腺病毒ElA基因的人腎上皮細胞系四31~細胞培養與含有10% FCS(胎牛血清)的DMEM完全培養液中，轉染前將細胞均勻的鋪在IOcm培養皿中，具體步驟按照PEI介導的細胞轉染實驗進行1、分別將DNA和PEI加入無抗生素、無血清的DMEM培養液Iml中混勻，然後將兩液混合成轉染液，室溫放置10-20分鐘；2、吸棄培養皿中的培養液，用無抗生素無血清的DMEM培養液輕輕洗兩次，加入 3ml無抗生素無血清的DMEM培養液；3、按蛋白A重組表達載體IOyg/皿，將轉染液逐滴加入培養皿中，置於5% 二氧化碳、37°C培養箱中培養4-6小時後，置換無血清培養基繼續培養M-48小時後，手機細胞培養上清；4、取轉染上清，用濃度為10%的聚丙烯醯胺凝膠進行電泳，通過免疫印記 (Western Blot)檢測蛋白A和抗體B的分泌表達情況。如圖5所示，轉染以後，細胞中可以表達綠螢光蛋白，可以用於細胞株的篩選。如圖6所示，轉染以後，在細胞的上清中可以檢測到蛋白A的表達。表明載體構建成功並可以應用。如圖7所示，蛋白為抗體B的蛋白。蛋白大小為19kD左右。通過圖片可以很好的看出細胞上清中含有該抗體並且可以很好的檢測出該蛋白，表明該載體可以應用。上述實施例pGreen Max 1真核表達載體作為在真核細胞中獲取目的蛋白或抗體的應用，用於製備大量所需目的蛋白以進行臨床前研究，並為高產哺乳動物細胞株的篩選提供蛋白表達及篩選的標記，為蛋白高效表達提供了很好的載體，也為細胞株的篩選提供一種新的方法和便利。
權利要求
1.一種pGreen Maxl真核表達載體，其特徵在於，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達載體重組獲得序列1，序列1共計7976bp，其中在第1769bp-2415bp之閥插入了含有647bp 的Mex片段，在第3120bp-4^8bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。
2.一種根據權利要求1所述的pGreen Maxl真核表達載體的製備方法，其特徵在於， 包括設計引物從質粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，並將PCR產物經過SmaI位點定向插入到表達載體中，並經過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構建重組的 pGreen Max真核表達載體。
3.根據權利要求2所述的pGreenMaxl真核表達載體的製備方法，其特徵是，包括如下步驟A、設計引物根據Mex序列設計引物，上遊引物加入RiieI位點，引物序列如下 Mex F :GATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGATMex R TGAGGCCTGAGTTCAGACCGGTB、目的片段的克隆以帶有Mex的質粒為模板，進行PCR擴增模板Iy1，上下遊引物 ΙΟμΜ各1μ 1，2. 5mM的dNTP底物4μ 1，10倍緩衝液5μ l，pfu聚合酶1μ 1，雙蒸水37μ 1 ； 95°C變性2分子；然後94°C變性30秒、55_65°C退火30秒、72°C延伸50秒，進行30-40個循環；最後72°C延伸7-10分鐘；C、擴增產物純化PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離後，將一條約647bp的擴增目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；D、pMex真核載體的構建D-1、酶切將載體用SmaI酶進行酶切，酶切時在反應體系中加入10倍緩衝液2 μ 1， SmaI 1μ 1，載體5μ 1，無離子水12μ 1，37°C水浴4個小時，酶切後的載體片段經瓊脂糖凝膠電泳分離後切膠回收；D-2、連接回收的Mex的片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應； D-3、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨苄黴素 100 μ 1/ml的LB培養基上37°C培養12-16小時；D-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆將菌落放大培養，純化提取質粒； D-5、利用SpeI進行酶切鑑定和測序，證實得到序列1的pMex真核表達質粒；E、得到IRES-EGFP序列在質粒中利用BamHI和NotI雙酶切得到IRES-EGFP序列，並經1 %的瓊脂糖凝膠電泳分離後，將一條約1300bp的目的條帶切下，用Gel Extraction Kit DNA純化試劑盒進行純化；F、pGreenMax 1真核表達載體的構建F-1、酶切將載體用BamHI和NotI雙酶切，酶切時在反應體系中加入10倍緩衝液 2 μ 1，BamHIly 1, NotIy 1, pMex載體5 μ 1，無離子水12 μ 1，37°C水浴4個小時，酶切後的載體片段經瓊脂糖凝膠電泳分離後切膠回收；F-2、連接回收的IRES-EGFP片段和載體用T4連接酶進行體外連接反應； F-3、轉化大腸桿菌將連接的產物轉入大腸桿菌感受態細胞中，在含氨苄黴素 100 μ 1/ml的LB培養基上37°C培養12-16小時；F-4、篩選重組真核表達載體的陽性克隆將菌落放大培養，純化提取質粒； F-5、利用HindIII進行酶切鑑定和測序，證實得到序列1的pMex真核表達質粒。
4.根據權利要求3所述的pGreenMaxl真核表達載體的製備方法，其特徵是，步驟C中所述的PCR產物，其純化方法步驟如下①從瓊脂糖凝膠中將PCR產物DNA條帶切下，轉入離心管中，加入2倍體積的結合緩衝液，55°C下溫浴7分鐘使得凝膠溶解；②將離心管中溶解的凝膠溶液轉移到試劑盒自帶的DNA吸附柱中，13000轉/分鐘離心 2分鐘；③向DNA吸附柱中加入700μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液，再加入500 μ 1漂洗液，13000轉/分鐘離心2分鐘；棄去漂洗液後，13000轉/分鐘離心2分鐘，室溫放置5分鐘；④將DNA吸附柱加入一個新的離心管中，加入65°C預熱的洗脫緩衝液70μ 1，13000轉 /分鐘離心2分鐘，離心管底的溶液即為回收的PCR產物DNA片段。
5.根據權利要求3所述的pGreenMaxl真核表達載體的製備方法，其特徵是，步驟D-2 中所述的連接，其連接方法如下在反應體系中加入回收的PCR產物DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應10h。步驟F_2 所述的連接方法是在反應體系中加入回收的DNA片段8 μ 1和載體片段2 μ 1，10倍緩衝液 2 μ 1，T4DNA連接酶1μ 1，去離子水7μ 1，16°C反應10h。
6.根據權利要求3所述的pGreenMaxl真核表達載體的製備方法，其特徵是，步驟D-3 所述的轉化大腸桿菌，其轉化大腸桿菌方法步驟如下①取連接產物IOul加到50ul的感受態細胞中，輕輕搖勻，冰浴30min.；②42°C熱激90s，快速轉到冰浴2-aiiin，注意不要搖動管；③向管中加入500ul的LB培養基，150rmp，37°C，45min.；④將菌液全部塗到LB平板上，含100ug/mlAmp.；⑤將平板正置直至液體全部吸收；⑥倒置平板，於37°C培養12-16h.。
7.根據權利要求3所述的pGreenMaxl真核表達載體的製備方法，其特徵是，步驟D-4 中所述的篩選重組真核表達載體陽性克隆，其篩選重組真核表達載體陽性克隆方法步驟如下①挑取轉化後的單菌落，接種到2ml含有氨苄青黴素(100yg/ml)的LB培養基中， 37°C，150rpm，搖床培養 12 IMir ；②取1-1.5ml培養物倒入1.5ml離心管中，4°C，13000rpm離心30s，棄上清，然後再短暫離心，用槍頭將離心管底部少量殘液吸出棄掉。剩餘菌液4°C保存；③將細胞沉澱漩渦震蕩打散後，重懸於100μ 1冰預冷的鹼裂解液I中，漩渦震蕩，使細菌懸浮均勻；④細菌重懸液中加入200μ 1鹼裂解液II，上下翻轉離心管5次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液，置於冰上< 5min ；⑤加入150μ 1冰預冷的鹼裂解液III，上下翻轉離心管8次，使溶液III在粘稠的細菌裂解物中分散均勻，並將離心管置於冰上1 :3min，4°C，13000rpm離心5min，將 400μ 1 的上清轉移至另一個離心管中；⑥加400μ1體積比為1 1的酚氯仿，震蕩充分混合有機相和水相，13000rpm離心2min，取上清於新離心管中；⑦用2 2.5體積的乙醇850 μ 1室溫沉澱核酸，混合均勻，室溫靜置anin。13000rpm 離心5min。小心的把上清倒掉；然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出棄掉；⑧加Iml左右70%乙醇於沉澱中，顛倒離心管數次，洗滌管壁與沉澱，如沉澱偏離管底需13000rpm離心lmin。小心的把上清倒掉，然後再短暫離心，用槍頭把離心管底部少量殘液小心的吸出，若沉澱漂浮，用槍頭將其置於離心管底部；⑨打開離心管，室溫靜置3 5min，使乙醇充分揮發，直至離心管內沒有可見的液體存在；⑩加含20μ g/ml RNase A的50 μ 1 TE緩衝液於離心管中，靜置5min，溫和震蕩混勻， 貯存於-20°C。
8.根據權利要求3所述的pGreenMaxl真核表達載體的製備方法，其特徵是，步驟D-5 中所述的酶切鑑定和測序，其酶切鑑定和測序方法如下在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，限制性內切酶 SpeI Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應池；經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離後鑑定pMex的目的條帶，SpeI酶切後可切出約1. 3kb和5. 3kb的兩個片段，表明目的片段已正確的插入載體中。
9.根據權利要求3所述的pGreenMaxl真核表達載體的製備方法，其特徵是，步驟F-5 中的酶切鑑定和測序，其酶切鑑定和測序方法如下在反應體系中加入提取的重組真核表達載體5 μ 1，10倍緩衝液2 μ 1，限制性內切酶 HindIII Iy 1，去離子水13μ 1，37°C反應濁；經1 %瓊脂糖凝膠電泳分離後鑑定pGreen Maxl的目的條帶，HindIII酶切後可切出約4. 9kb,2. 9kb和230bp的三個片段，表明目的片段已正確的插入載體中。
10.一種根據權利要求1所述的pGreen Maxl真核表達載體的應用，其特徵在於， PGreen Maxl真核表達載體作為在真核細胞中獲取目的蛋白或抗體的應用，並為高產哺乳動物細胞株的篩選提供蛋白表達及篩選的標記。
全文摘要
本發明涉及一種分子生物技術領域的pGreen Max1真核表達載體及其製備方法。由Mex、IRES-EGFP片段和真核表達載體重組獲得序列1，序列1共計7976bp，其中在第1769bp-2415bp之間插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之間插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列；製備方法包括設計引物從質粒中通過PCR的方法克隆得到Mex，並將PCR產物經過SmaI位點定向插入到表達載體中，並經過BamHI和NotI雙酶切將IRES-EGFP插入到載體中，構建重組的pGreenMax真核表達載體。本發明載體作為在真核細胞中獲取目的蛋白或抗體的應用，並為高產哺乳動物細胞株的篩選提供蛋白表達及篩選的標記。
文檔編號C12N15/85GK102242143SQ20111009937
公開日2011年11月16日 申請日期2011年4月20日 優先權日2011年4月20日
發明者徐維果, 李大偉, 武正華, 金龍 申請人:上海交通大學