轉基因大豆子葉rna和dna的同步抽提方法
2023-09-20 09:43:00 1
專利名稱：轉基因大豆子葉rna和dna的同步抽提方法
技術領域：
本發明涉及轉基因大豆子葉的RNA和DNA的同步分離純化，具體說是使用不同蛋白變性劑和氯化鋰(LiCl)同步抽提轉基因大豆子葉RNA和DNA的方法。
背景技術：
大豆是極重要的一種經濟作物，富含優質蛋白、不飽和脂肪酸、鈣質和保健因子。 除了直接食用外，大豆還可以製成豆腐、豆油、醬油、豆瓣醬、大豆蛋白和磷脂等加工品。隨著食用油和植物蛋白需求量的不斷增加和大豆應用領域的不斷擴大，大豆栽培和加工已逐步成為重要的支柱產業。隨著大豆產業的發展，在分子生物學領域開展大豆品質、產量及功能性食品的研發等相關研究顯得尤為重要。核酸抽提是上述研究的必要且重要的一步，因為核酸質量對後續的反轉錄、PCR、限制性內切酶酶切、Northern雜交、文庫構建等諸多實驗都有顯著影響。在核酸抽提上已有一些相關的技術報導，例如在DNA抽提技術上有CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)法、SDS (十二烷基磺酸鈉)-蛋白酶K法、LiCl法等，在RNA抽提技術上有CTAB法、異硫氰酸胍法以及改進的TRIZOL法等。不同生物或不同組織的細胞組分和次級代謝產物不盡相同，因此不同材料需要不同的核酸抽提方法。目前尚無轉基因大豆子葉 RNA和DNA同步抽提方法的報導。通常轉基因大豆的分子檢測是以葉片為材料，分別獨立抽提轉基因大豆葉片的 RNA和DNA，需要較多樣品、試劑和工序，而同步抽提RNA和DNA既能節約材料又能節約時間。以子葉代替葉片做核酸分析還能提早對轉基因大豆是否獲得外源基因以及外源基因是否表達進行檢測。所以有必要研發適合轉基因大豆子葉RNA和DNA同步抽提的方法。
發明內容
本發明的目的在於提供一種適用於轉基因大豆子葉RNA和DNA同時抽提的方法， 實驗簡便、省時、省料，實驗結果理想。獲得的高純度的核酸可以用於PCR、RT-PCR、N0rthern 雜交、限制性內切酶酶切、文庫構建等後續實驗。經過多次實驗探索，得出符合此目的的實驗方法，各種方法及其具體步驟如下
(1)使用含蛋白變性劑(如SDS、異硫氰酸胍或CTAB中的一種或多種試劑)的偏鹼性 (pH範圍7. 0 8. 5)裂解液裂解樣品；
(2)加入等體積的Tris飽和苯酚/氯仿(體積比=1 1)，混勻，離心後取上清；
(3)加入等體積氯仿，混勻，離心後取上清；
(4)加入LiCl(終濃度為1 3mol/L)，離心後RNA沉澱在管底；
(5)轉移第(4)步的上清至新管，加入乙醇(終濃度為65% 70%(體積比))，離心後得到DNA沉澱；
(6)DNA沉澱經漂洗後，溶於含RNase A水中；[7]RNA溶液中加入DNase I處理，然後常規苯酚/氯仿抽提，乙醇沉澱，沉澱經漂洗後， 於適量RNase-free水中溶解，此步為可選做步驟。
具體實施例方式方案一 SDS裂解與LiCl選擇沉澱
(1)IOOmg 新鮮樣品液氮研磨，加入 ImLSDS 裂解液(0. lmol/LTris-Cl (ρΗ8· 0),0. 5mol/ LNaCl，0. 05mol/L EDTA, 1. 5% (w/v) SDS)，室溫放置 IOmin ；
(2)加入等體積的Tris飽和酚(PH8.0)與氯仿混合液(體積比=1 1)混勻， 12000rpm離心5min後取上清；
(3)加入等體積的氯仿並混勻，12000rpm離心5min後取上清；
(4)加入1/4 體積 IOmol/L LiCl，靜置 30min, 12000rpm 離心 IOmin 後 RNA 沉澱在管
底；
(5)轉移第(4)步的上清至新管，加入2倍體積的無水乙醇，12000rpm離心5min後得到DNA沉澱；
(6)RNA和DNA沉澱分別用75%乙醇漂洗，室溫乾燥；
(7)RNA沉澱溶於適量RNase-free水，_70°C保存，備用；
(8)DNA沉澱溶於含RNaseA水中，37°C溫浴30min，-20°C保存，備用；
(9)經1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA，電泳條帶清晰完整，無明顯拖帶，點樣孔無明顯殘留；通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的沈0/230 = 2. 0 2. 4，26(^280 =1. 8 2. 0，RNA 的 260/230 = 2. 0 2. 5，260/280 = 1. 9 2. 0。方案二 異硫氰酸胍裂解與LiCl選擇沉澱
(1)IOOmg新鮮樣品液氮研磨，加入ImL異硫氰酸胍裂解液(0. lmol/L Tris-Cl (pH8. 0),0. 5mol/L NaCl，0. 05mol/L EDTA，lmol/L 異硫氰酸胍)，室溫放置 IOmin ；
(2)加入等體積的Tris飽和酚(PH8.0)與氯仿混合液(體積比=1 1)混勻， 12000rpm離心5min後取上清；
(3)加入等體積的氯仿並混勻，12000rpm離心5min後取上清；
(4)加入1/4 體積 IOmol/L LiCl，靜置 30min, 12000rpm 離心 IOmin 後 RNA 沉澱在管
底；
(5)轉移第(4)步的上清至新管，加入2倍體積的無水乙醇，12000rpm離心5min後得到DNA沉澱；
(6)RNA和DNA沉澱分別用75%乙醇漂洗，室溫乾燥；
(7)RNA沉澱溶於適量RNase-free水，_70°C保存，備用；
(8)DNA沉澱溶於含RNaseA水中，37°C溫浴30min，-20°C保存，備用；
(9)經1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA，電泳條帶清晰完整，無明顯拖帶，點樣孔無明顯殘留；通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的沈0/230 = 2. 0 2. 4，26(^280 =1. 8 2. 0，RNA 的 260/230 = 2. 0 2. 5，260/280 = 1. 9 2. 0。方案三CTAB裂解與LiCl選擇沉澱
(I)IOOmg 新鮮樣品液氮研磨，加入 ImL CTAB 裂解液(0. lmol/L Tris-Cl (pH8. 0)， 1. 4mol/LNaCl，0. 05mol/L EDTA, 2% (w/v) CTAB)，室溫放置 IOmin ；(2)加入等體積的Tris飽和酚(PH8.0)與氯仿混合液(體積比=1 1)混勻， 12000rpm離心5min後取上清；
(3)加入等體積的氯仿並混勻，12000rpm離心5min後取上清；
(4)加入1/4 體積 IOmol/L LiCl，靜置 30min, 12000rpm 離心 IOmin 後 RNA 沉澱在管
底；
(5)轉移第(4)步的上清至新管，加入2倍體積的無水乙醇，12000rpm離心5min後得到DNA沉澱；
(6)RNA和DNA沉澱分別用75%乙醇漂洗，室溫乾燥；
(7)RNA沉澱溶於適量RNase-free水，加入DNase I處理；
(8)常規苯酚/氯仿抽提，取上清；加入0.1倍體積2mol/LNaCl和2倍體積的無水乙醇，12000rpm離心IOmin後獲得RNA沉澱；
(9)RNA沉澱用75%乙醇漂洗，室溫乾燥，適量RNase-free水溶解沉澱，_70°C保存，備
用；
(10)DNA直接溶於含RNaseA水中，37°C溫浴30min，-20°C保存，備用；
(11)經1.0%非變性瓊脂糖電泳檢測RNA和DNA，電泳條帶清晰完整，無明顯拖帶，點樣孔無明顯殘留；通過Bio-red核酸蛋白定量儀測得DNA的沈0/230 = 2. 0 2. 4，26(^280 =1. 8 2. 0，RNA 的 260/230 = 2. 0 2. 5，260/280 = 1. 85 2. 0。
權利要求
1.大豆子葉總RNA和DNA同步抽提試劑中主要包括蛋白變性劑、環境PH緩衝劑、DNase 活性抑制劑。
2.根據權利要求1所述的核酸抽提試劑，其特徵在於蛋白變性劑分別為SDS(十二烷基磺酸鈉)、異硫氰酸胍或CTAB (十六烷基三乙基溴化銨)，各成分在各方案中的用量依次為 1 2% (w/v)、0· 5 1. 5mol/L、l 2% (w/v)。
3.根據權利要求1所述的核酸抽提試劑，其特徵在於環境PH緩衝劑為Tris-Cl，防止核酸被破壞，其PH值為7. 0 8. 5，濃度為0. 05 0. 2mol/L。
4.根據權利要求1所述的核酸抽提試劑，其特徵在於DNase活性抑制劑為EDTA，可螯合Mg2+或Mn2+離子，其濃度為0. 01 0. lmol/L0
5.使用權利1所述的抽提試劑來同步抽提大豆子葉總RNA和DNA的方法，其抽提步驟為使用含蛋白變性劑(如SDS、異硫氰酸胍或CTAB中的一種或多種試劑)的偏鹼性(pH範圍7.0 8. 5)裂解液裂解樣品；加入等體積的Tris飽和苯酚/氯仿(體積比=1 1)， 混勻，離心後取上清；加入等體積的氯仿，混勻，離心後取上清；加入LiCl (終濃度為1 3mol/L)，離心後RNA沉澱在管底；繼續加入乙醇(終濃度為65% 70% (體積比))，離心後得到DNA沉澱；DNA沉澱經漂洗後，溶於含RNase A水中；向RNA溶液中加入DNase I處理，然後常規苯酚/氯仿抽提，乙醇沉澱，沉澱經漂洗後，於適量RNase-free水中溶解，此步為可選做步驟。
全文摘要
在核酸抽提上已有一些相關的技術報導，但目前尚無轉基因大豆子葉RNA和DNA同步抽提方法的報導。本發明使用偏鹼性CTAB、SDS或異硫氰酸胍裂解液裂解子葉，常規苯酚/氯仿抽提，用LiCl選擇性沉澱RNA，用乙醇繼續沉澱DNA，沉澱的RNA和DNA分別用DNase I和RNase A處理，最後得到高質量的核酸。同步抽提既能節約樣品、試劑、又能節約時間。對子葉做核酸分析能夠在大豆剛出苗時對經過轉化的大豆進行分子檢測，提早確定是否將外源基因導入大豆以及外源基因是否表達。
文檔編號C12N15/10GK102250884SQ20111018425
公開日2011年11月23日 申請日期2011年6月28日 優先權日2011年6月28日
發明者周向紅, 易樂飛, 王萍 申請人:淮海工學院