一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法

2023-09-20 17:17:25 2

一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法，該方法包括以下步驟：製作布基微流控晶片；將化學發光底液滴加到晶片檢測區，然後在2～8℃下避光晾乾儲存；在晶片進樣區滴加樣品溶液，若樣品中含有H2O2，則化學發光反應被觸發，經CCD數字成像設備採集獲得發光圖像，並通過Matlab和Image J軟體對圖像進行處理。本發明方法的化學發光體系具有穩定性好、檢測靈敏度高、動態範圍寬等優點，能直接或者間接測定過氧化氫，這在環境監測、食品安全檢測、生物化學、臨床疾病診斷等領域有極其重要的研究意義。
【專利說明】一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法

【技術領域】
[0001]本發明屬於微流控分析領域，具體涉及一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法。

【背景技術】
[0002]過氧化氫是生物體系中的一種重要物質，它嚴重影響細胞新陳代謝，在許多酶促反應、蛋白積聚和抗原-抗體識別過程中也伴隨著過氧化氫的產生和消耗。食品加工過程中，經常有一些不法商家用廉價的工業過氧化氫殺菌和漂白食品，使賣相變得更好，但人體攝入工業過氧化氫會導致多方面的危害，會使人體抵抗力下降，誘發基因突變，引起腸胃、心肺等部位多種疾病的發生。目前，國家已明令禁止在食品加工中使用工業過氧化氫。因此，採用化學發光體系定量測定過氧化氫，在環境監測、食品安全檢測、生物化學、臨床疾病診斷等領域有極其重要的研究意義。
[0003]1990年，Manz和Widmer等人首次提出微流控全分析系統(Miniaturized TotalAnalysia Systems, μ TAS)概念以來,基於微流控晶片的生化分析技術得到了非常快速的發展，已從理論層次開始真正走向實際應用層面。
[0004]與傳統實驗室生化分析技術相比，微流控晶片技術具備一些明顯的優勢:裝置體積小、分析效率高、樣品和試劑消耗量少，尤其適合家庭或者現場檢測。微流控晶片是μ TAS的核心，其研究主要包括晶片的材料選擇、加工方法、表面修飾，功能集成等。
[0005]當前，全球經濟發展嚴重不平衡，微流控晶片的價格直接成為其能否被廣泛接受應用的關鍵。因此，為了降低晶片成本，尋找一種廉價晶片加工材料已成為從事微流控晶片科研工作者的主要研究內容之一。目前，微流控晶片的加工材料主要有矽片、石英、玻璃、陶瓷以及塑料等。但是，基於這些材料的晶片造價普遍高、加工工藝複雜，因此它們廣泛應用仍然受到一定程度的限制。
[0006]基於棉纖維的親水性，2009年，Shen研究組提出以廉價棉線作為襯底材料來加工微流控裝置(ACS Appl.Mater.1nterfaces, 2010, 2,1 - 6)。
[0007]採用疏水線和親水線，Bhandari等人通過紡織編織技術來構建具有一定疏水、親水圖案的布基微流控免疫分析晶片(Lab on a Chip，2011，11，2493-2499)。
[0008]採用類似的編織技術，Breedveld研究小組將親水棉線和疏水棉線編織在一起以構建兩性分子微流體控制的布基裝置(ACS Appl.Mater.1ntrefaces，2011，3，3796-3803)。
[0009]最近，Nilghaz等人提出一種臘轉印技術來加工布基微流控分析晶片(Lab on aChip, 2012，12，209-218)。
[0010]棉材料屬於有機纖維，是現實生活中最常見的服裝加工底料、植物栽種提取、處理工藝過程簡單快速、適合大批量生產，比傳統的玻璃、矽微流控晶片性價比高。因此，基於棉布材料的微流控晶片在分析化學、環境監測、生物醫學等領域也許會表現出極大的應用潛力。
[0011]到目前為止，幾乎所有的線基或者布基微流控裝置都採用比色檢測方法，極少數也採用了電化學或者顏色變化長度等檢測方法。然而，化學發光檢測和布基微流控技術相結合的傳感方法還沒有報導過。


【發明內容】

[0012]本發明的目的在於提供一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法，該方法將化學發光與布基微流控技術相結合，開發出了一種成本低廉、實用性廣的布基微流控化學發光檢測方法，實現了對肉製品中H2O2的檢測。
[0013]本發明的目的通過下述技術方案實現:
[0014]一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法，包括以下步驟:
[0015](I)製作布基微流控晶片
[0016]設計進樣區、檢測區和微流控通道的圖案，然後製成含有該圖案的網紗網板；將布片置於網紗網板下方，並在網紗網板上塗蠟；將布與網紗網板一起加熱5-10秒(帶有布的一面朝向熱源)；將布從網紗網板上取下並冷卻至室溫，得到布基微流控晶片；
[0017]所述的設計圖案是用軟體Adobe Illustrate CS5設計；
[0018]所採用的布片是燈芯絨全棉布，這種布料親水性能較好，無需親水性預處理便可直接用於晶片加工；
[0019](2)化學發光底液預先固定於晶片檢測區
[0020]將魯米諾(Lum1l)溶液、辣根過氧化物酶(HRP)溶液、對碘苯酚(PIP)溶液按體積比1:1:1混合，得到化學發光底液；在檢測前，將化學發光底液滴加到晶片檢測區，然後在2?8°C下避光晾乾儲存；
[0021]所述魯米諾溶液的濃度優選3X10_3mOl/L，辣根過氧化物酶溶液的濃度優選0.8mg/mL ；
[0022]所採用的化學發光底液能在_20°C下較長時間保存完好，並可直接使用，這一定程度上解決了傳統化學發光底液由A液和B液組成並分開保存的缺點。此外，採用的化學發光底液容易配製、操作簡單。
[0023](3)進樣檢測
[0024]將樣品碾碎，用pH值為10的TE緩衝液侵泡lOmin，靜置後所得上清液為樣品溶液；在晶片進樣區滴加樣品溶液，若樣品中含有H2O2,則化學發光反應被觸發，經CCD數字成像設備採集獲得發光圖像，並通過Matlab和Image J軟體對圖像進行處理；本發明的布基微流控化學發光成像傳感裝置的組成示意圖如圖1所示；
[0025]所述的CXD數字成像設備是廣州市明美科技有限公司產品，型號為MC15。
[0026]本發明相對於現有技術具有如下的優點及效果:
[0027]1、本發明方法與傳統的、廣泛使用的流動注射化學發光相比，無需採用任何價格昂貴的注射泵來驅動液體流動。本方法僅通過布材料的線中和線間纖維空隙的毛細力來驅動液體流動。
[0028]2、本發明方法所使用的布材料不僅價格低廉，而且親水性好，因此無需親水預處理便可直接進行晶片加工，從而進行樣品分析。
[0029]3、本發明方法所需晶片加工不需要複雜的大型設備，僅需要布材料、蠟筆、網板以及加熱板。布材料和蠟都很廉價，蠟是一般文具店都能購買到的蠟筆。
[0030]4、本發明方法中，可直接使用化學發光底液預處理布基微流控晶片的檢測區，這樣的晶片可批量儲存，顯著提高樣品分析效率。
[0031]5、本發明的方法中，樣品從進樣區經布通道流到檢測區的時間約3s，化學發光被觸發後整個反應過程持續約25s，因此完成樣品成像傳感分析僅需30s左右，因此從進樣到檢測的分析速度極快。本發明方法適用於食品中殘留H2O2的定量分析。
[0032]6、本發明所描述的方法操作流程簡單，不需要專業人員操作。
[0033]7、本發明的方法減少了對環境的汙染，樣品分析完成後布晶片可通過燃燒的方法處理掉。
[0034]8、本發明方法的化學發光體系具有穩定性好、檢測靈敏度高、動態範圍寬等優點，能直接或者間接測定過氧化氫，這在環境監測、食品安全檢測、生物化學、臨床疾病診斷等領域有極其重要的研究意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035]圖1是本發明的布基微流控化學發光成像傳感裝置的組成示意圖。
[0036]圖2是布基微流控晶片親水區域的圖案。
[0037]圖3是布基微流控晶片的實物圖。
[0038]圖4是布基微流控晶片的通道尺寸與吸液特性的測試結果圖。
[0039]圖5是樣品溶液pH值與發光強度的關係圖。
[0040]圖6是Lum1l濃度與發光強度的關係圖。
[0041]圖7是HRP濃度與發光強度的關係圖。
[0042]圖8是純H2O2樣品中H2O2濃度與發光強度的關係圖。
[0043]圖9是雞爪樣品中H2O2濃度與發光強度的關係圖。

【具體實施方式】
[0044]下面結合實施例及附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。
[0045]實施例
[0046]—種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法，包括以下步驟:
[0047](I)製作布基微流控晶片
[0048]a)化學發光晶片圖案設計
[0049]晶片圖案採用進樣區(4_X4mm)和檢測區(直徑8_)分開，並通過微通道(寬度:3mm、4mm、5mm ;長度:5mm、10mm、15mm)連接(如圖2所示)。這樣的化學發光晶片圖案設計的優勢包括:(I)利用布纖維的毛細力驅動流體流動來實現流動注射化學發光；(2)進樣區和檢測區分開，一方面便於檢測區處理，另一方面便於進樣，能實現無汙染自動進樣；
(3)利用溶液從進樣區流到檢測區的時間間隔來靈活地實現布基微流控化學發光CCD圖像米集。
[0050]b)布基微流控晶片的製作過程
[0051]1、採用Adobe Illustrate CS5軟體設計如圖2所示的圖案,基於這些圖案製作出相對應的300目網紗網板；
[0052]2、將一個網板壓在合適尺寸的全棉燈芯絨布上(兩者緊貼)，用綠色蠟筆在網板上塗蠟，並用平滑碾磨勺均勻用力碾磨；
[0053]3、將附著有棉布的網板置於加熱板加熱(85°C加熱5s)，帶棉布的一面朝向加熱板；
[0054]4、加熱完成後，從網板上取下布，室溫冷卻，製成的布基微流控晶片包括親水區域(進樣區、微通道以及檢測區)和疏水區域(如圖3所示)。
[0055]c)不同通道尺寸的布基微流控晶片吸液性能測試
[0056]在上述不同尺寸微通道的晶片進樣區滴加30 μ I胭脂紅溶液，通過電子秒表記錄胭脂紅溶液從進樣區出口流到檢測區入口所需要的時間，每個實驗重複5次做統計，其測試結果如圖4所示。微通道長度一定時，通道越寬，溶液流過它所需要的時間就越短；寬度一定時，通道越短，溶液流過它所需要的時間也就越短。
[0057]基於試劑消耗量以及手動操作CCD採集圖像所需的時間，本發明方法優選通道長度為1mm,寬度為3mm的布晶片作生化檢測。
[0058](2)化學發光底液預先固定於晶片檢測區
[0059]將一定濃度的Lum1l、HRP、PIP按體積比1:1:1混合，將5 μ I配製好的化學發光底液直接用移液槍均勻滴加到布晶片上的圓形檢測區，然後2-8°C避光晾乾儲存。
[0060]檢測區預固定化學發光底液的布基微流控晶片可直接用於樣品檢測，大大降低了分析時間，顯著提高了分析效率。
[0061](3)對影響布基微流控化學發光的若干重要因素(樣品pH值、化學發光底液濃度)的優選
[0062]a)優選樣品溶液pH值
[0063]1、化學發光底液成分:Lum1l 濃度為 3X 10_3mol/L，PIP 濃度為 4X 10_4mol/L，HRP濃度為0.8mg/mL,三者以體積比1:1:1混合。
[0064]2、設置若干實驗組:用 TE 緩衝液(pH值為 8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,10.5,11.0)來稀釋30% H2O2，使其濃度成為5X10_3mol/L，然後取25 μ I加入晶片進樣區。
[0065]3、關閉暗箱門，操作(XD相機進行化學發光圖像採集，通過Matlab、Image J、Origin軟體對採集的圖像進行分析，測試結果如圖5所示。
[0066]從實驗結果可以看出:當緩衝液pH值為10,布基微流控化學發光強度最大，pH值超過10時，發光強度隨PH值增大而下降。
[0067]b)優選底液中Lum1l濃度
[0068]1、設置若干實驗組:化學發光底液中Lum1l的濃度設置為幾個不同值(1.5X l(T3mol/L、2X l(T3mol/L、2.5 X l(T3mol/L、3 X l(T3mol/L、3.5X l(T3mol/L、4X l(T3mol/L)，PIP 濃度為 4X l(T4mol/L，HRP 濃度為 0.8mg/mL，三者以體積比 1:1:1 混合。
[0069]2、用TE緩衝液(pH 10.0)配製H2O2濃度為5 X 10_3mol/L，然後取其25 μ I加入晶片進樣區。
[0070]3、關閉暗箱門，操作(XD相機進行化學發光圖像採集，通過Matlab、Image J、Origin軟體對採集的圖像進行分析，測試結果如圖6所示。
[0071]從實驗結果可以看出:Lum1l濃度為3X 10_3mol/L時布基微流控化學發光強度最大，其濃度超過3X l(T3mol/L時，隨著濃度增大,發光強度反而減小。
[0072]c)優選底液中HRP濃度
[0073]1、設置若干實驗組:化學發光底液中HRP濃度設置為幾個不同值(0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL、0.8mg/mL、0.9mg/mL、l.0mg/mL), Lum1l 濃度為 3 X 10 3mol/L, PIP 濃度為4X10_4mOl/L，三者以體積比1:1:1混合。
[0074]2、用TE緩衝液(pH 10.0)配製H2O2濃度為5 X 10_3mol/L，然後取其25 μ I加入晶片進樣區。
[0075]3、關閉暗箱門，操作(XD相機進行化學發光圖像採集，通過Matlab、Image J、Origin軟體對採集的圖像進行分析，測試結果如圖7所示。
[0076]從實驗結果可以看出:在一定範圍內，隨著酶濃度增加，化學發光強度幾乎成線性增加；當其濃度超過0.8mg/mL，化學發光強度趨於穩定。考慮到酶用量很大程度影響著檢測成本，本發明方法底液中酶濃度優選為0.8mg/mL。
[0077]綜合(a)，(b)及(C)優選過程，本發明方法中優選的反應試劑濃度為=Lum1l濃度為3X 10_3mol/L，HRP濃度為0.8mg/mL，三者以體積比1:1:1混合，_20°C避光保存。另夕卜，用pH 10.0的TE緩衝液稀釋配製H2O2溶液。
[0078](4)布基微流控晶片定量檢測純H2O2樣品和3% (V/V)H2O2浸泡過的雞爪樣品
[0079]a)純H2O2樣品檢測
[0080]1、用 pH 10.0TE 緩衝液將 30% H2O2 稀釋成不同濃度(0.5mmol/L、lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L、4mmol/L、5mmol/L),以此作為待測樣品。
[0081]2、取不同濃度的25 μ L待測樣品添加到晶片的進樣區中。
[0082]3、關閉暗箱門，操作CXD相機進行化學發光圖像採集，通過Matlab、Image J、Origin軟體對採集的圖像進行分析，結果見圖8。
[0083]根據圖8所示H2O2的校正曲線和未加樣品時的空白值加上其相對偏差三倍作為發光強度值，算出本發明方法對過氧化氫的檢測限為0.46mmol/L。
[0084]結合圖4晶片吸液性能測試結果可知:當使用的布晶片通道長為1mm,寬為3mm時，樣品從進樣區經布通道流到檢測區的時間約3s，化學發光被觸發後整個反應過程持續約25s，因此完成樣品成像傳感分析僅需30s左右，具有較高的分析速度。
[0085]從圖8可以看出，本發明的方法可以實現H2O2定量檢測，且具有較好的線性。
[0086]b)3% (V/V)H2O2浸泡過的模擬雞爪樣品檢測
[0087]1、未經任何處理的新鮮雞爪採用超純水清洗晾乾,然後取其少量並用3% H2O2來侵泡，記錄侵泡時間(本發明中取侵泡時間分別為6、12、18、24、30、32h)。
[0088]2、取侵泡不同時間的雞爪，清水衝洗數秒，稱取5g樣品攪碎。
[0089]3、用50mL pH值為10的TE緩衝液侵泡攪碎過的樣品lOmin，浸泡過程中保持充分震蕩。靜置一段時間後，直接取其上層清液作為待測溶液，並取其25 μ L加入到進樣區。
[0090]4、關閉暗箱門，操作(XD相機進行化學發光圖像採集，通過Matlab、Image J、Origin軟體對採集的圖像進行分析，結果如圖9所示。
[0091]圖9根據侵泡不同時間模擬樣品的發光強度值，並結合圖8的H2O2的校正曲線可以估算出不同侵泡時間樣品中對應H2O2的濃度。本實施例發現侵泡超過24h後，隨著侵泡時間增加，發光強度趨於不變，說明樣品中H2O2含量趨於飽和。
[0092]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法，其特徵在於包括以下步驟: (1)製作布基微流控晶片 設計進樣區、檢測區和微流控通道的圖案，然後製成含有該圖案的網紗網板；將布片置於網紗網板下方，並在網紗網板上塗蠟；將布與網紗網板一起加熱5-10秒；將布從網紗網板上取下並冷卻至室溫，得到布基微流控晶片； 所採用的布片是燈芯絨全棉布； (2)化學發光底液預先固定於晶片檢測區 將魯米諾溶液、辣根過氧化物酶溶液、對碘苯酚溶液按體積比1:1:1混合，得到化學發光底液；在檢測前，將化學發光底液滴加到晶片檢測區，然後在2?8°C下避光晾乾儲存；所述魯米諾溶液的濃度為3X 10_3mOl/L，辣根過氧化物酶溶液的濃度為0.8mg/mL ； (3)進樣檢測 將樣品碾碎，用PH值為10的TE緩衝液侵泡lOmin，靜置後所得上清液為樣品溶液；在晶片進樣區滴加樣品溶液，若樣品中含有H2O2，則化學發光反應被觸發，經CCD數字成像設備採集獲得發光圖像，並通過Matlab和Image J軟體對圖像進行處理。
2.根據權利要求1所述的檢測過氧化氫的底物預固定布基微流控化學發光方法，其特徵在於:所述的設計圖案是用軟體Adobe Illustrate CS5設計。
【文檔編號】G01N21/76GK104359898SQ201410719841
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月1日 優先權日:2014年12月1日
【發明者】章春筍, 管文榮 申請人:華南師範大學