小麥4b染色體粒重qgw4b-caps分子標記及其應用的製作方法

2023-09-20 06:45:45 1

小麥4b染色體粒重qgw4b-caps分子標記及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種小麥4B染色體粒重QGW4B-CAPS分子標記及其應用，粒重控制基因位點QGW4B-17位於小麥4B染色體短臂31.3～36.3cM處，處於小麥4B染色體分子標記Ex_c101685_705和分子標記RAC875_c27536_611之間；本發明還公開了根據根據粒重控制基因位點QGW4B-17開發的粒重QGW4B-CAPS分子標記。本發明所述分子標記QGW4B-CAPS可以有目的的選擇含有該基因特徵鹼基序列的大粒資源，並將這些大粒資源用於高產小麥育種或分子設計聚合雜交育種，以及應用該標記進行分子標記輔助選擇育種，以更快速、準確進行高產小麥品種的選育。
【專利說明】小麥4B染色體粒重QGW4B-CAPS分子標記及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種小麥4B染色體粒重QGW4B-CAPS分子標記及其應用，屬於生物技 術領域。

【背景技術】
[0002] 小麥是世界三大糧食作物之一，是我國北方人口的主要口糧。隨著我國人均耕地 土地和淡水資源的減少，糧食供應安全問題日益凸顯。千粒重是小麥產量構成三要素之一， 提高小麥粒重是培育高產小麥的重要途徑。
[0003] 粒重由主基因和微效基因共同控制的數量性狀，基因數目多且效應較低，易受環 境影響。在傳統育種中需要大規模的田間選擇，工作量大，效率低。小麥是異源六倍體，與 粒重有關的基因鑑定較少，缺乏分子標記輔助選擇的有效標記。
[0004] 目前小麥粒重分子標記輔助選擇存在的主要問題是：絕大多數QTLs不是功能性 標記，多數發表的QTLs位點都沒有經過育種過程或品種進行有效性驗證；QTLs實用性差， 單一遺傳群體定位的基因位點，準確度差，而且由於置信區間大，QTLs過多或存在假陽性 QTLs，降低了分子輔助選擇的實際效率，甚至沒法有效應用到小麥育種中。
[0005] 實效性分子標記能夠避免由於高比率的重組交換而產生的選擇錯誤，在群體的目 標基因檢測時更加有效；直接反映目標性狀的表現，可以準確的檢測、跟蹤目標基因，且其 遺傳效應值具有普適性，且可靠性高，對人工育種群體和自然群體均有效。在利用回交轉育 高千粒重性狀時，實效性標記的開發有助於推動分子標記輔助選擇的應用，而且有利於在 種質資源中發掘有利基因。
[0006] 作為第三代分子標記的 SNP (Single Nucleotide Polymorphism, SNP)，標記是一 種基於多態性SNP和PCR為基礎的分子標記技術。本發明是以RIL群體為材料，在SNPs全 基因組掃瞄的基礎上，利用連鎖分析方法，提高了 QTL檢測的效應和定位精度，開發了實效 性CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence)分子標記，研製粒重分子輔助育種體 系，可以程序化應用於育種實踐。


【發明內容】

[0007] 本發明針對現有技術的不足，提供一種小麥4B染色體粒重基因分子標記 QGW4B-CAPS及其應用。
[0008] 小麥4B染色體控制粒重基因位點QGW4B-17,粒重控制基因位點QGW4B-17位於小 麥4B染色體短臂31. 3?36. 3cM處，處於小麥4B染色體分子標記Ex_cl01685_705和分子 標記 RAC875_c27536_611 之間。
[0009] 根據上述小麥4B染色體控制粒重基因位點QGW4B-17左偵彳SNP開發的 QGW4B-CAPS1分子標記，該分子標記上遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下遊引物核 苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0010] 上述根據小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的QGW4B-CAPS1分子標記在 分子輔助育種中的應用。
[0011] 上述應用，步驟如下：
[0012] (1)提取待鑑定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；
[0013] (2)以步驟（1)製得的基因組DNA為模板，利用上述QGW4B-CAPS1分子標記作為特 異引物對基因組DNA中進行PCR擴增，製得PCR擴增產物；
[0014] (3)用限制性內切酶Alul酶切步驟（2)製得的PCR擴增產物，得酶切產物；
[0015] (4)對步驟（3)製得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產物電泳圖譜顯 示被測樣品在439bp和177bp有條帶時，則該被檢測樣品為含有粒重控制位點QGW4B-17的 品種；當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品在722bp有條帶時，則該被檢測樣品為不含有粒重 控制位點QGW4B-17的品種。
[0016] 根據本發明優選的，所述的步驟（2)中PCR擴增體系為20 μ L，具體如下：
[0017] 2XEs Taq MasterMixlOy L(購自北京康為世紀生物科技有限公司）， QGW4B-CAPS1分子標記的上遊引物0. 8 μ L，QGW4B-CAPS1分子標記的下遊引物0. 8 μ L，模板 3 μ L，無菌 Η205· 4 μ L。
[0018] 根據本發明優選的，所述的步驟（2)中PCR擴增程序如下：
[0019] 94°C預變性 5min ;94°C變性 40s，59°C退火 45s，72°C延伸 50s，35 個循環；72°C延 伸 lOmin。
[0020] 根據本發明優選的，所述的步驟（3)中酶切體系為10 μ L，具體如下：
[0021] 限制性內切酶 AluIO. 3 μ L，PCR 擴增產物 3 μ L，10ΧΝΕ bufferO. 7 μ L， ddH206 μ L ；
[0022] 酶切條件為：37°C水浴lh，然後65°C滅活5min。
[0023] 根據上述小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17右側SNP開發的QGW4B-CAPS2分 子標記，上遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 /_J、1 ο
[0024] 上述應用，步驟如下：
[0025] (1)提取待鑑定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；
[0026] (2)以步驟⑴製得的基因組DNA為模板，利用上述QGW4B-CAPS2分子標記作為特 異引物對基因組DNA進行PCR擴增，製得PCR擴增產物；
[0027] (3)用限制性內切酶Apall酶切步驟⑵製得的PCR擴增產物，得酶切產物；
[0028] (4)對步驟（3)製得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產物電泳圖譜顯 示被測樣品有415bp和323bp條帶時，則該被檢測樣品為不含有粒重控制位點QGW4B-17的 品種；當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品在738bp有條帶時，則該被檢測樣品含有粒重控制 位點QGW4B-17的品種。
[0029] 根據本發明優選的，所述的步驟（2)中PCR擴增體系為20 μ L如下：
[0030] 2XEs Taq MasterMixlO yL(購自北京康為世紀生物科技有限公司）， QGW4B-CAPS2分子標記的上遊引物0. 8 μ L，QGW4B-CAPS2分子標記的下遊引物0. 8 μ L，模板 DNA3 μ L，無菌 Η205· 4 μ L。
[0031] 根據本發明優選的，所述的步驟（2)中PCR擴增程序如下：
[0032] 94°C預變性 5min ;94°C變性 40s，59°C退火 45s，72°C延伸 50s，35 個循環；72°C延 伸 lOmin。
[0033] 根據本發明優選的，所述的步驟（3)中酶切體系為10 μ L，具體如下：
[0034] 限制性內切酶 Apal 10. 3 μ L，PCR 擴增產物 3 μ L，10XNE bufferO. 7 μ L， ddH206 μ L ；
[0035] 酶切條件為：37°C水浴lh，然後65°C滅活5min。
[0036] 上述提取待鑑定樣品的基因組DNA的方法也採用本領域常規的改良的CTAB法提 取葉片中的DNA。
[0037] 有益效果
[0038] 本發明根據小麥4B染色體粒重主效QTLs位點SNP開發的特異CAPS分子標記 QGW4B-CAPS，該標記可以有目的的選擇含有該基因特徵鹼基序列的大粒資源，並將這些大 粒資源用於高產小麥育種或分子設計聚合雜交育種，以及應用該標記進行分子標記輔助選 擇育種，以更快速、準確進行高產小麥品種的選育。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 圖1為小麥千粒重基因在染色體4B染色體上的作圖區間；
[0040] 圖中：右側是分子標記的名稱，左側數字是標記之間的遺傳距離，單位是cM。
[0041] 圖2為大小粒親本及衍生品系利用QGW4B-CAPS1分子標記進行PCR擴增，擴增產 物酶切前後的電泳條帶圖；
[0042] 圖中：1、Marker ;2、大粒親本01-35酶切前；3、大粒親本01-35酶切後；4、小粒株 系C60酶切前；5、大粒株系C98酶切前；6大粒株系C98酶切後；7小粒株系C60酶切後；8 小粒親本藁城9411酶切前；9小粒親本藁城9411酶切後。
[0043] 圖3為大小粒品種及育種高代品系用QGW4B-CAPS1分子標記進行PCR擴增，擴增 產物酶切前後的電泳條帶圖；
[0044] 圖中：1-5為大粒品種魯原205,臨麥2,淄麥12,濰麥8號，豫農949酶切前；6-10 為大粒品種魯原205,臨麥2,淄麥12,濰麥8號，豫農949酶切後；11-15為小粒品種躍進5 號，碧瑪6號，西農979,師溧02,藁城8901酶切前；16-20為小粒品種躍進5號，碧瑪6號， 西農979,師溧02,藁城8901酶切後。
[0045] 圖4為大小粒親本及衍生品系用QGW4B-CAPS2分子標記進行PCR擴增，擴增產物 酶切前後的電泳條帶圖；
[0046] 圖中：01-35X藁城9411F9:10RIL群體大小粒株系酶切前後電泳圖；1-5RIL群 體大粒 C25, C47, C53, C76, C98 酶切前，6-10 大粒株系 C25, C47, C53, C76, C98 酶切後； 11-15RIL 群體小粒株系 C27, C36, C44, C60, C114 酶切前，16-20 小粒株系 C27, C36, C44， C60，C114酶切後；
[0047] 圖5為大小粒品種及育種高代品系用QGW4B-CAPS2分子標記進行PCR擴增，擴增 產物酶切前、後的電泳條帶圖；
[0048] 圖中：1-5大粒品種魯原205,臨麥2,淄麥12,濰麥8號，豫農949酶切前；6-10大 粒品種魯原205,臨麥2,淄麥12,濰麥8號，豫農949酶切後；11-15小粒品種躍進5號，碧 瑪6號，西農979,師溧02,藁城8901酶切前；16-20小粒品種躍進5號，碧瑪6號，西農979， 師溧02,藁城8901酶切後；21-25為5個淄麥12 X師溧02育種後代F5大粒品系酶切前； 26-30為5個淄麥12 X師溧02育種後代F5大粒品系酶切後；31-35為5個淄麥12 X師溧 02育種後代F5小粒品系酶切前；36-40為5個淄麥12 X師溧02育種後代F5小粒品系酶 切後。

【具體實施方式】
[0049] 下面結合實施例對本發明的技術方案做進一步闡述，但本發明所保護範圍不限於 此。
[0050] 實施例1
[0051] 小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17,粒重控制位點QGW4B-17位於小麥4B染 色體短臂31. 3?36. 3cM處，處於小麥4B染色體分子標記Ex_cl01685_705和分子標記 RAC875_c27536_611 之間。
[0052] 遺傳圖譜構建和QTL定位實驗室構建的RIL群體為材料：該RIL群體以普通小麥 品系山農01-35為母本，藁城9411為父本進行雜交，獲得F1代，經一粒傳法自交9代，得到 含173個家系的RIL(F 9:1Q)群體。
[0053] 母本山農01-35是山東農業大學育成的大粒、中筋、成穗率較低的小麥品系，普通 市售產品；
[0054] 父本藁城9411是河北省藁城農科所育成的小粒、分櫱成穗率較高的強筋小麥品 系，普通市售產品。
[0055] 分子標記的檢測
[0056] 提取親本及後代群體的DNA，取待鑑定樣品的基因組DNA的方法採用本領域常規 的改良的CTAB法提取葉片中的DNA。
[0057] DArT標記的檢測及序列信息由澳大利亞Triticarte Pty. Ltd (http://www. triticarte. com, au)完成。
[0058] SNP標記由美國加利弗尼亞大學戴維斯分校植物科學系生物技術檢測中心利用 Illumina SNP Genotyping技術測試平臺，使用微珠晶片技術（BeadArray)進行檢測。其多 態性分析使用genomestudio軟體進行分析。
[0059] SSR標記利用兩親本進行多態性篩選，將多態性引物用於RIL群體的檢測，SSR引 物的序列等信息通過參考文獻和 GrainGene2. 0 (http: //wheat, pw. usda. gov/GG2/index, shtml)獲得。
[0060] 圖譜構建及QTL數據分析
[0061] 用MAPMAKER/EXP3. Ob軟體]和Mapchart2. 1構建分子標記的連鎖圖。用基於混 合線性模型的QTL network2. 0軟體對2008年-2010年泰安點和2010宿州4個環境下粒 重的表型值和其平均值分別單獨進行QTL定位，並利用4個環境的粒重的表型值共同進行 多環境的QTL分析。獲得了多個環境下穩定表達的主效QTL位點，該位點定名為QGW4B-17。 在染色體上的具體位置如圖1所示。
[0062] 根據上述結果，設計分子標記如下：
[0063] 根據小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的QGW4B-CAPS1分子標記，上遊 引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下遊引物核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0064] 根據小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的QGW4B-CAPS2分子標記，上遊 引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0065] 實施例2
[0066] 實施例1所述的根據小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的分子標記在分 子輔助育種中的應用，即為將與小麥千粒重主效QTL緊密連鎖的分子標記用於檢測小麥品 種或品系的方法，該方法它包括以下步驟：
[0067] 1.分子標記在華大基因等生物技術公司合成，序列如下：
[0068] QGW4B-CAPS1 :上遊引物：5，-TAATAGGCTTGAAAAGTTCTTAC-3，，SEQ ID NO. 1
[0069] 下遊引物：5，-CGAATAGACTTCAGGGGCA-3，；SEQ ID NO. 2
[0070] QGW4B-CAPS2 :上遊引物：5，-CCCGGTTTTATGAACGATGAGTGG-3，；SEQ ID NO. 3
[0071] 下遊引物：5，-GCGTGACAATTGCCACAGATCTA-3。SEQ ID NO. 4
[0072] 2.提取檢測材料 DNA :參照 Triticarte Pty. Ltd(http://www. triticarte. com. au)中提供的植物DNA提取方法，用0. 8wt%瓊脂糖電泳檢測DNA質量和濃度，其詳細方法 如下：
[0073] (1)取0· 3-0. 5g葉片入5mL離心管，液氮速凍後研成粉末。
[0074] (2)加入1600 μ L已預熱至65°C的緩衝液，多次倒置混勻，水浴0· 5-lh，（其間輕 搖幾次以充分混勻）。
[0075] (3)降溫等待10分鐘，加 10-15 μ L RNase (10mg/mL) 37°C水浴30鍾（其間輕搖幾 次以充分混勻，約1次/l〇min)。
[0076] (4)取出離心管，加入等體積160(^1^，41：苯酚（1^8-平衡酚） ：氯仿：異戊醇 (25 :24 :1)抽提，輕輕混勻10min(可水平放置在搖床上），4°C冰箱靜置5min，然後8000rpm 離心10min。
[0077] (5)取上清液於另一管，約1300yL，加入等體積冷氯仿（4°C冰箱放置），輕搖 10min混勻（可水平放置在搖床上），8000rpm離心10min。
[0078] (6)取上清液於另一管（約1000 μ L)加100 μ L3M NaAC(醋酸鈉），加入1000 μ L 的冷異丙醇（或2倍體積的冷乙醇），充分混勻後於-20°C冰箱靜置20min。
[0079] (7)用槍頭挑出絮狀的DNA，用70%乙醇清洗2-3次，稍離心5分鐘，去掉乙醇，氣 幹後（無乙醇氣味即可），溶於200 μ LI XTE溶液中，輕輕混勻，-20°C儲存。
[0080] (8)用微量可見/紫外分光光度計NanoDrop2000,測定DNA濃度，稀釋DNA濃度為 200ng/ μ L做為工作液。
[0081] 附錄：溶液配製：
[0082] (a) 3M NaAc (pH5. 2)
[0083] 600mL H20中加408. 24g NaAc-3H20,（或者246. 24g無水醋酸鈉）溶解後用冰醋 酸（冰乙酸）調pH值至5· 2,定容至1L，滅菌，備用。
[0084] (b) 1 X TE 溶液
[0085] 800mL H20 中加 1. 211g Tris、0. 3723g Na2EDTA-2H20,用 HC1 調 pH 值至 8. 0,定容 至1L，滅菌，備用。
[0086] (c)RNA酶（RNase):(若商業化配置好的lmL處理好的分裝RNA酶，可以直接使 用）。
[0087] 將固體RNA酶溶於0· 01M NaAc，使酶濃度為10mg/mL，加熱至100°C處理15 - 20min，慢慢冷卻至室溫，然後加入0. 1倍體積1M Tris-HCl (pH7. 4)，分裝後於-20°C冰箱 保存。
[0088] ⑷緩衝液：按照如下配方配製後，定容至1L。
[0089]

【權利要求】
1. 小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17,粒重控制基因位點QGW4B-17位於小麥4B 染色體短臂31. 3?36. 3cM處，處於小麥4B染色體分子標記Ex_cl01685_705和分子標記 RAC875_c27536_611 之間。
2. 根據權利要求1所述小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的QGW4B-CAPS1分 子標記，上遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，下遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、1 ο
3. 權利要求2所述根據小麥4Β染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的QGW4B-CAPS1分 子標記在分子輔助育種中的應用。
4. 如權利要求3所述的應用，其特徵在於，步驟如下： (1) 提取待鑑定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液； (2) 以步驟（1)製得的基因組DNA為模板，利用上述QGW4B-CAPS1分子標記作為特異引 物對基因組DNA中進行PCR擴增，製得PCR擴增產物； (3) 用限制性內切酶Alul酶切步驟（2)製得的PCR擴增產物，得酶切產物； (4) 對步驟（3)製得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產物電泳圖譜顯示 被測樣品在439bp和177bp有條帶時，則該被檢測樣品為含有粒重控制位點QGW4B-17的品 種；當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品在722bp有條帶時，則該被檢測樣品為不含有粒重控 制位點QGW4B-17的品種。
5. 如權利要求4所述的應用，其特徵在於，所述的步驟（2)中PCR擴增體系為20 μ L， 具體如下： 2XEs Taq MasterMixlO μ L，QGW4B-CAPS1 分子標記的上遊引物 0· 8 μ L，QGW4B-CAPS1 分子標記的下遊引物〇. 8 μ L,模板3 μ L,無菌Η205. 4 μ L ; 所述的步驟（2)中PCR擴增程序如下： 94°〇預變性5!1^11;941：變性4〇8,591：退火458,721：延伸5〇8,35個循環；721：延伸 10min〇 所述的步驟（3)中酶切體系為10 μ L，具體如下： 限制性內切酶 AluIO. 3 μ L，PCR 擴增產物 3 μ L，10ΧΝΕ bufferO. 7 μ L，ddH206 μ L ; 酶切條件為：37°C水浴lh，然後65°C滅活5min。
6. 根據權利要求1所述小麥4B染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的QGW4B-CAPS2分 子標記，上遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示，下遊引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 /_J、1 ο
7. 權利要求6所述根據小麥4Β染色體粒重控制位點QGW4B-17開發的QGW4B-CAPS2分 子標記在分子輔助育種中的應用。
8. 如權利要求7所述的應用，其特徵在於，步驟如下： (1) 提取待鑑定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液； (2) 以步驟（1)製得的基因組DNA為模板，利用上述QGW4B-CAPS2分子標記作為特異引 物對基因組DNA進行PCR擴增，製得PCR擴增產物； (3) 用限制性內切酶Apall酶切步驟（2)製得的PCR擴增產物，得酶切產物； (4) 對步驟（3)製得的酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，當PCR產物電泳圖譜顯示 被測樣品有415bp和323bp條帶時，則該被檢測樣品為不含有粒重控制位點QGW4B-17的品 種；當PCR產物電泳圖譜顯示被測樣品在738bp有條帶時，則該被檢測樣品為含有粒重控制 位點QGW4B-17的品種。
9.如權利要求8所述的應用，其特徵在於，所述的步驟（2)中PCR擴增體系為20 μ L如 下： 2XEs Taq MasterMixlO μ L，QGW4B-CAPS2 分子標記的上遊引物 0· 8 μ L，QGW4B-CAPS2 分子標記的下遊引物〇. 8 μ L,模板3 μ L,無菌Η205. 4 μ L ; 所述的步驟（2)中PCR擴增程序如下： 94°〇預變性5!1^11;941：變性4〇8,591：退火458,721：延伸5〇8,35個循環；721：延伸 10min〇 所述的步驟（3)中酶切體系為10 μ L，具體如下： 限制性內切酶 Apal Πλ 3 μ L，PCR 擴增產物 3 μ L，10ΧΝΕ bufferO. 7 μ L，ddH206 μ L ; 酶切條件為：37°C水浴lh，然後65°C滅活5min。
【文檔編號】C12Q1/68GK104087580SQ201410329392
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2014年7月10日 優先權日:2014年7月10日
【發明者】陳建省, 田紀春, 李青芳, 劉凱, 陳廣鳳, 谷植群 申請人:山東農業大學