一種豬偽狂犬病病毒變異株prv-zj01及應用的製作方法

2023-09-19 04:50:10

一種豬偽狂犬病病毒變異株prv-zj01及應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及豬偽狂犬病毒【技術領域】，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異株PRV-ZJ01，其保藏號為CGMCCNo.8170。所述的豬偽狂犬病病毒變異株PRV-ZJ01在製備疫苗中的應用。採用PRV-ZJ01株病毒液製成水溶性滅活疫苗，與Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗進行豬體免疫保護試驗，結果表明，ZJ01毒株滅活疫苗安全性較好，免疫保護效率明顯高於Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗免疫組，Bartha-K61、Bucharest和HB-98株活疫苗對ZJ01超強毒株不能提供完全保護。ZJ01滅活疫苗對PRV變異株和傳統毒株均有較好免疫保護作用。PRV-ZJ01株106.0TCID50/mL滴鼻感染85日齡非免疫豬，可致全部發病和死亡。證明該病毒株毒力明顯增強，抗原性發生變異，滅活後具有較好免疫原性，可用於該病疫苗和診斷方法研究與開發。
【專利說明】—種豬偽狂犬病病毒變異株PRV-ZJ01及應用
[0001]【技術領域】
本發明涉及豬偽狂犬病毒【技術領域】，特別涉及一種豬偽狂犬病毒變異株PRV-ZJ01，還涉及豬偽狂犬病毒變異株PRV-ZJOl的應用。
[0002]【背景技術】
偽狂犬病毒(PRV)屬於皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科成員，可引起新生仔豬中樞神經系統紊亂，生長豬呼吸道症狀，並能導致妊娠母豬流產、死胎與弱仔。美國與部分歐洲國家已宣布消滅和根除該病。我國廣泛使用該病基因缺失弱毒疫苗有效控制並逐步淨化。但是，自2011年底起，我國很多該病免疫豬場相繼出現仔豬嘔吐和神經症狀、生長豬出現呼吸道症狀，死亡率明顯增高，妊娠母豬出現流產、死胎、弱仔等，造成嚴重經濟損失，但對流行毒株的致病性和抗原性均不清楚。
[0003]
【發明內容】

為了解決以上現有技術中存在的疫情不能得到有效控制的問題，本發明提供了一種豬偽狂犬病毒變異株PRV-ZJOI。
[0004]本發明還提供了所述豬偽狂犬病毒變異株PRV-ZJOl在製備免疫疫苗的應用。
[0005]本發明是通過以下步驟得到的:
一種豬偽狂犬病病毒變異株PRV-ZJOl，其保藏號為CGMCC N0.8170。採用IO6 qTCID5q滴鼻感染85日齡健康豬，非免疫豬全部發病和死亡。
[0006]所述的豬偽狂犬病病毒變異株PRV-ZJOl在製備疫苗中的應用。
[0007]優選所述疫苗為水溶性滅活疫苗。
[0008]疫苗的製備過程為:取PRV-ZJOl病毒液滅活，加入卡波姆佐劑混合均勻即得。病毒液中病毒含量為107_°TCID5(l/mL。
[0009]疫苗中病毒抗原含量大於106_°TCID5(l/mL。
[0010]本研究採集我國某發病豬群患病仔豬腦組織病料，無菌處理後接種BHK21細胞，盲傳2代，培養2~3天出現明顯細胞病變，病毒空斑純化3次後連續傳代15次，均出現相同病變，病毒TCID5tl為10_7_ 5/mL, PCR鑑定為PRV，命名為PRV-ZJOl毒株。病毒gE和gB基因序列測定結果顯示其與其他已公布的毒株序列同源性分別為97.1%~99.6%和98.1%~99.5%，其gE基因推導的胺基酸序列在第54和448位發生D-1和V-1突變，第496位插入D。採用10頭24日齡仔豬進行人工感染髮病試驗，結果顯示，該分離株可引起PRV典型臨床症狀和病理變化，100%死亡。採用24頭85日齡健康育肥豬滴鼻接種IO2 tlTCID5tl ^lO6 0 TCID50PRV-ZJOI株病毒液，結果為，攻毒組豬均出現發熱，精神沉鬱，嘔吐，咳嗽，呼吸困難和神經症狀等典型症狀，106_° TCID5tl病毒感染組豬在攻毒後7天內全部死亡，病毒LD5tl為IO313TCID5(l/mL。該毒株與50份Bartha_K61、Bucharest、HB-98疫苗毒株血清及其抗血清交叉中和試驗，結果顯示，該分離毒株抗原發生明顯變異，變異係數R值為0.378、.448，首次證明PRV-ZJOl毒株為PRV超強毒抗原變異毒株，屬於血清2亞型超強毒株。
[0011]本發明的有益效果:採用PRV-ZJOl株病毒液(106_°TCID5(l/mL)製成水包油型滅活疫苗，與Bartha-K61活疫苗進行豬體免疫保護試驗，結果表明，ZJOl毒株滅活疫苗安全性較好，免疫保護效率明顯高於Bartha-K61活疫苗免疫組，Bartha-K61活疫苗對ZJOl超強毒株不能提供完全保護。證明該病毒株具有較好免疫原性，可用於該病疫苗和診斷方法研究與開發。
[0012]菌株保藏信息
保藏時間:2013年9月18日，
保藏單位:中國微生物菌株保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，
保藏編號:CGMCC N0.8170，
保藏單位地址:中國科學院微生物研究所，北京市朝陽區北辰西路I號院3號，
分類命名:豬偽狂犬病毒。
[0013]【專利附圖】

【附圖說明】 圖1.PRV-ZJOl的分離與PCR鑑定，其中A為病毒感染BHK-21細胞形成的細胞病變；B為病毒感染BHK21細胞形成的空斑；C為分離病毒株PCR檢測(1-4泳道為Fl，F5，FlO與F15代次病毒，第5泳道為細胞對照)。
[0014]圖2.24日齡仔豬攻毒後不同時間仔豬死亡統計結果；
圖3上兩行圖片為24日齡仔豬攻毒後死亡豬肉眼病變觀察結果，下兩行為24日齡仔豬攻毒後死亡豬病理組織學觀察結果，其中，a為肝臟；b為腦；c為肺臟；d為脾臟；e為腎臟；f為淋巴結；
圖4為24日齡仔豬攻毒後2周不同組織中PRV核酸定量檢測結果；
圖5為85日齡豬攻毒後不同時間豬死亡統計結果；
圖6上兩行為攻毒後死亡豬肉眼病變觀察結果；下兩行為攻毒後死亡豬病理組織學觀察結果,其中a為肝臟；b為腦；c為肺臟；d為脾臟；e為腎臟；f為淋巴結；
圖7為85日齡豬攻毒後2周不同組織中PRV核酸定量檢測結果。
【具體實施方式】
[0015]下面結合具體實施例對本發明進行進一步說明:
實施例1
1.病毒分離與PCR鑑定
將採集的發病豬的腦組織剪碎混漿處理(組織與滅菌PBS重量體積比為1:10)，12000rpm離心10 min取上清經0.22 μ m濾器過濾用於病毒的分離。將ImL過濾的病料上清接種剛長滿單層的BHK-21細胞，37°C孵育Ih後棄去培養瓶中液體並加入2% DMEM於含5%CO2的37°C細胞培養箱中培養，每天觀察細胞是否出現病變。待70%細胞出現病變後，反覆凍融3次，接種BHK21細胞。病毒空斑純化3次，採用PRV PCR方法擴增gE基因，反應體系:1U AccuPrime? pfx DNA Polymerase 與2.5uL 10XAccuPrime? pfx Mix (Invitrogen),上下遊引物各10 pmol, DNA模板IOOng,滅菌雙蒸水補足50 μ L。PCR反應條件:951^預變性5 min ;95°C變性45s，62°C退火45s，68°C延伸3 min，上述3步驟進行35個循環；68°C後延伸7 min。PCR產物經1%瓊脂糖電泳分析。
[0016]結果為:病料組織無菌處理後接種長滿單層的BHK-21細胞，20h後出現特徵性細胞病變，表現為細胞變圓，折光性變強，形成形態各異的合胞體(圖1A)，並可以形成空斑(圖1B)。病毒經3次空斑純化，連繼傳代15次，病毒TCID5tl為107 5/1111^0?檢測？1，？5，？10與F15代細胞毒，均擴增出目的條帶188bp(圖1C)，證明該分離株屬於PRV，毒株命名為ZJ01。
[0017]株基因序列測定與分析
採用PCR方法擴增gE與gB基因，反應體系同上。PCR產物經1%瓊脂糖電泳分析，回收目的片段，克隆至載體pEASYTM-Blunt Zero (TransGen)，進行基因測序分析。結果為:新分離毒株的這兩個基因與其他已公布的PRV毒株序列同源性分別為97.1%~99.6%和98.1%~99.5%。基因進化樹分析圖中，新分離株位於一個相對獨立的分支中。gE基因推導的胺基酸序列比對發現，新分離株與大多數毒株相比，在54與448位發生了 54位(D-1)與448 (V-1)突變，在第496位插入D。
[0018]日齡仔豬致病性試驗
選擇PRV陰性的24日齡仔豬10頭，隨機分成兩組，每組5頭，第I組每頭豬滴鼻接種IO6 0 TCID50 PRV-ZJOl株病毒液(F5)，對照組滴鼻接種等量細胞營養液作為對照。隔離飼養，自由採食。每天觀察實驗豬發病症狀(如精神萎靡，食欲不振，發熱，神經症狀，呼吸道症狀與死亡等)，對死亡豬系統解剖後採集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結與腦組織冷凍保存，並將上述組織於4%多聚甲醛固定，製備組織切片，進行組織病理學檢查，同時用螢光定量PCR方法檢測各組中PRV核酸含量。見圖2-4。
[0019]結果為:(I)仔豬攻毒後2天即出現發熱(>41°C)，精神沉鬱、嘔吐、咳嗽、呼吸困難和神經症狀等臨床表現，所有 攻毒組仔豬在5天內全部死亡，而對照組全部健活，見圖2。
(2)肉眼病變為:脾臟與肝臟表面出現白色壞色點，腦組織水腫，肺臟紋理增強，腎臟表面有出血點，淋巴結腫大出血。(3)組織病變為:肝細胞變性壞死，脾細胞壞死，肺臟間質性肺炎、上皮細胞壞死，腎臟出血，淋巴結壞死、出血，非化膿性腦炎(「衛星現象」，「噬神經元現象」且在高倍鏡下可見病毒包涵體)。見圖3，。(4)PRV DNA載量均在肺臟中最多，其次是腦組織，見圖4。
[0020]日齡育肥豬致病性試驗
選擇PRV陰性的24頭85日齡健康豬，隨機分成6組，每組4頭，其中第1-5組為攻毒組，每頭豬分別滴鼻接種IO2 0TCID50~106_° TCID50 PRV-ZJOl株病毒液，第6組為對照組，滴鼻接種等量細胞營養液。自由採食，隔離飼養，觀察2周，記錄發病症狀與死亡情況，按Reed-Muench法計算LD5tl。同時，取死亡豬和試驗結束時豬，進行剖檢，觀察肉眼病變，並取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、淋巴結與腦組織冷凍保存，並將上述組織於4%多聚甲醛固定，製備組織切片，進行組織病理學檢查。同時，用螢光定量PCR方法檢測各組中PRV核酸含量。見圖5-7.結果為:攻毒組實驗豬均出現發熱(> 41°C )，精神沉鬱，咳嗽，呼吸困難，神經症狀與死亡等臨床表現，IO6 ci TCID5tl病毒組在攻毒後7天內全部死亡，對照組全部健活。見圖5。病毒對85日齡豬LD5tl為IO313 TCID5(l/mL。肉眼病變與24日齡攻毒仔豬相似，主要為:脾臟邊緣出血，肝臟表面出現局灶性壞死，腎臟、淋巴結、肺臟與腦組織。組織病變為:肝細胞變性壞死，脾臟出血，肺臟間質性肺炎，腎臟出血，淋巴結壞死，非化膿性腦炎(「袖套現象」)。見圖6.PRV DNA載量均在肺臟中最多，其次是腦組織。見圖7。
[0021]病毒血清交叉中和試驗
選擇PRV陰性的30日齡健康豬50頭，隨機分成5組，每組10頭，第I組肌肉注射IO20TCID50 PRV-ZJOl株病毒液，第2-5組按說明書分別接種4種PRV疫苗，即Bartha_K61清偽靈(LT 1205476，輝瑞)、Bartha-K61 (LT 20120602，武漢中博)、Bucharest 撲偽佳(LTA289184，輝瑞)、HB-98株(LT 121041，武漢科前)。免疫後4_5周採集血液，分離血清，抗血清56°C水浴30min滅活處理，用於病毒血清交叉中和試驗。血清倍比稀釋後分別與100TCID50原免疫病毒和ZJOl毒株混合，37°C孵育lh，每個血清稀釋度設置4個重複。接種96孔板BHK-21細胞單層，100 μ L/孔，置5% CO2細胞培養箱37°C培養4d，於顯微鏡下觀察細胞病變CPE，記錄病變孔數目。按照Reed-Muench法計算中和抗體效價。運用SPSS 16.0軟體進行統計分析。並採用以下公式計算R值。結果見表1，
【權利要求】
1.一種豬偽狂犬病病毒變異株PRV-ZJOl，其保藏號為CGMCC N0.8170。
2.—種權利要求1所述的豬偽狂犬病病毒變異株PRV-ZJOl在製備疫苗中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述疫苗為水溶性滅活疫苗。
4.根據權利要求2或3所述的應用，其特徵在於疫苗的製備過程為:取含有PRV-ZJOl病毒的病毒液，滅活，加入佐劑混合均勻即得。
5.根據權利要求4所述的應用，其特徵在於病毒液中病毒含量為107_°TCID5(l/mL。
6.根據權利要求2-5中任一項所述的應用，其特徵在於疫苗中病毒抗原含量大於106°TCID5(l/mL。
7.根據權利要求4-6中任一項所述的應用，其特徵在於所述病毒液與佐劑的重量比為4:1。
8.根據權利要求4`-6中任一項所述的應用，其特徵在於所述佐劑為卡波姆。
【文檔編號】C12N7/00GK103627678SQ201310701688
【公開日】2014年3月12日 申請日期:2013年12月19日 優先權日:2013年12月19日
【發明者】姜平, 顧真慶, 白娟 申請人:姜平