實驗動物長爪沙鼠遺傳質量檢測方法及其應用的製作方法

2023-09-18 12:33:50

實驗動物長爪沙鼠遺傳質量檢測方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明以群體遺傳學理論為依據，通過種間轉移擴增法從小鼠微衛星位點中篩選出長爪沙鼠微衛星位點，然後經過分級篩選、優化組合，最終優選出了適於長爪沙鼠遺傳檢測的微衛星位點，建立了適用於長爪沙鼠遺傳檢測的方法。本發明還採用篩選出的微衛星位點對國內的長爪沙鼠群體進行了群體內遺傳變異和群體間遺傳差異分析。
【專利說明】實驗動物長爪沙鼠遺傳質量檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及實驗動物遺傳質量檢測方法及其應用，具體為實驗動物長爪沙鼠遺傳質量檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002]長爪沙鼠(Meriones unguiculatus)屬於卩齒齒目、沙鼠屬(Gerbillus)動物，又名黃耗子、砂耗子、長爪沙土鼠、蒙古沙鼠(Mongolian gerbil)等，是源自我國的實驗用動物。由於長爪沙鼠許多特殊的生物學特性，在許多方面可作為生物學和醫學研究的動物模型，並極具發展潛力，具有重要開發價值，是當今實驗動物科學發展最為迅速的領域之一。目前長爪沙鼠已在腦缺血、腦神經、寄生蟲病、微生物、生殖、內分泌、營養、代謝及藥理、腫瘤等研究中廣泛應用。
[0003]在我國，長爪沙鼠的實驗動物化始於1978年和1985年，由浙江省實驗動物中心和首都醫科大學分別從野外捕獲沙鼠進行馴化研究，成功的培育了兩個封閉群群體，並對其生物學特性、染色體組型等進行了研究，在長爪沙鼠實驗動物化研究方面奠定了較好的基礎。目前我國有四個較大的長爪沙鼠封閉群，分別分布在北京(首都醫科大學)、杭州(浙江省實驗動物中心)、大連(大連醫科大學)和廣州(廣州醫學院)，這些生產單位的長爪沙鼠在國內得到廣泛應用。在群體遺傳學方面，杜小燕等[1]從小鼠的微衛星位點擴增沙鼠基因組DNA獲得長爪沙鼠微衛星位點，並對首都醫科大學長爪沙鼠群體、野生長爪沙鼠群體和浙江長爪沙鼠群體進行了群體遺傳結構對比分析，表明首都醫科大學群體變異程度比以前要高，雖然低於兩個野生群體，但差異不是很大。丁賢明等[2]用17個微衛星DNA標記對Z:ZCLA長爪沙鼠封閉群、野生群和近交系進行遺傳多樣性分析，結果表明Z:ZCLA封閉群和野生群都表現為中度多態，Z:ZCLA封閉群較野生群稍低；3個長爪沙鼠近交系品系基本符合近交系的要求，微衛星標記技術適用於近交系長爪沙鼠的遺傳檢測。劉月環等M用已知的9個微衛星對浙江省沙鼠群 體進行了遺傳多樣性分析，結果表明該群體處於不平衡狀態。孫賀娟等[4]用篩選的28個生化基因位點對浙江省實驗動物中心群體和首都醫科大學群體進行了群體遺傳結構對比分析，表明兩群體內均未出現明顯的遺傳分化現象，但群體均偏離了哈迪-溫伯格平衡；而兩群體間並未出現明顯的遺傳分化。國外有關長爪沙鼠的群體遺傳方面的研究報導也比較少，Neumann K等[5]通過用克隆方法找到的9個微衛星位點對野生長爪沙鼠和人工飼養的長爪沙鼠進行了多態性分析，發現人工飼養群體的遺傳多態性較低。Yoshda等[6]比較了長爪沙鼠與人及大鼠編碼肝、胰及血白蛋白cDNA序列的差異。Shimizu等m通過乳酸脫氫酶和鹼性磷酸酶的電泳分析表明在毛色表型之間無遺傳多態性。Okumura等M用23個蛋白酶位點研究了日本培育及保種的4個品系(MGS/Sea、Mon/JmsGbs、KML和Hos)的生化基因位點及遺傳變異性，結果除在肝酸性磷酸酶(Acp2)位點有多態性外，其它位點均未見多態性，表明在日本實驗長爪沙鼠的群體內和群體間缺乏遺傳多樣性。
[0004]長期以來，人們一直注重研究長爪沙鼠的保種、生物學特性、遺傳結構和開發應用，而對長爪沙鼠的標準化，尤其是遺傳質量標準研究不夠。目前國家尚沒出臺長爪沙鼠遺傳質量的國家標準，各地方也沒有成熟的長爪沙鼠遺傳質量地方標準。因此，研究建立長爪沙鼠遺傳質量檢測方法和遺傳質量標準就顯得尤為迫切。
[0005]長爪沙鼠的遺傳質量對醫學生物學研究結果的準確性、重複性及科學性有重要影響，而遺傳質量監測是評價和保證實驗用長爪沙鼠質量不可或缺的措施。因此，在長爪沙鼠實驗動物化過程中遺傳檢測是極其重要的。遺傳檢測的目的是為了證實各品種品系應具有的遺傳特性，以及是否發生遺傳突變和遺傳汙染等，以確保被監測的樣品符合該品種品系的要求。由於品系特性易受許多因素的影響而發生變化，並可直接影響試驗結果的可靠性，使用遺傳汙染的動物所進行的實驗，往往導致錯誤的結論，因此對我國的長爪沙鼠群體進行遺傳檢測具有重要意義。遺傳檢測的方法較多，有生物化學標記基因檢測法、免疫學性狀標記基因檢測法、DNA多態性法等。其中微衛星DNA檢測法是DNA多態性法的一種，由於具有很多的優點，是近幾年來發展較快的一種檢測方法。
[0006]微衛星(Microsatellite)，又稱簡單序列重複(Simplesequence repeats，SSR)，是指以少數幾個核苷酸(一般為2~6個)為重複單位組成的簡單多次串聯重複序列[9]。在真核生物中大約每隔10-50kb就存在I個微衛星_，且它們廣泛存在於染色體幾乎所有區域[11]。微衛星標記按其核心單位的鹼基數可分為單、2、3、4、5、6核苷酸微衛星。人和動物的微衛星重複單位較為常見的是(TG)n和(CT)n[12];按微衛星自身結構，Webertl3]將微衛星分為完全、不完全和複合微衛星:完全型微衛星是由不中斷的重複單位串聯而成；不完全微衛星是指重複單位間有3個以下的非重複鹼基間隔，且兩間隔間重複單位連續重複數不低於3 ;複合微衛星是指由幾類串聯重複單位構成，中間有3個以下鹼基間隔，且重複單位連續重複數不低於5。微衛星標記由核心序列和兩側保守的側翼序列構成，保守的側翼序列使微衛星特異地定位於染色體某一區域，核心序列重複數的差異則形成微衛星的高度多態性。利用微衛星DNA側翼序列設計引物進行PCR擴增，由於重複次數的不同形成片段長度不同，經電泳分離，成像表現出不同的電泳帶型。
[0007]微衛星DNA具有豐富的多態性、遺傳連鎖不平衡現象、數量多分布均勻、易檢測、重複性好、省時，適於自動化分析和在相關物種之間具有保守性等特點而廣泛應用於生命科學的研究中。主要表現在以下幾個方面:(I)構建基因圖譜微衛星是一種共顯性標記，其遺傳分析過程相對簡化，不僅利於作圖群體間標記轉換[14]，而且也便於從遺傳圖譜向物理圖譜過渡[15]。(2)製作DNA指紋圖，微衛星最早應用之一就是製作DNA指紋圖來進行個體、品種(系)鑑定。(3)定位功能基因和數量性狀基因座(QTL)利用微衛星與某些功能基因或QTL間的連鎖關係，可將一些功能基因或QTL定位在染色體上或連鎖群中，這方面的研究在家畜(禽)中已有一些利用。(4)進行血緣鑑定和血緣控制，在育種中，系譜記錄是十分重要的，最早用於血型和血液蛋白多態性分析，但因多態性不夠豐富而讓位於DNA指紋技術。(5)用於群體遺傳多樣性、遺傳結構及起源的研究，Nei等_(1994)認為，用微衛星估計親緣關係較近的群體間的遺傳距離、繪製系統發育樹時，比其它的遺傳標記技術更精確和聞效。
[0008] 鑑於上述微衛星標記的優點，以及國內外鮮于報導的有關長爪沙鼠微衛星位點，在GenBank和EMBL等國際知名的大型生物學資料庫中目前還查不到長爪沙鼠的基因組相關的序列，能查到的微衛星位點僅有9個，且該9個位點在人工飼養群體中的多態性較差，因此目前長爪沙鼠可用的微衛星位點相當有限。

【發明內容】

[0009]本發明的目的是建立長爪沙鼠遺傳質量檢測方法，進而有助於長爪沙鼠遺傳質量標準的建立，從而規範長爪沙鼠的生產和應用。對長爪沙鼠的群體遺傳結構進行全面、客觀、公正的評價，查清長爪沙鼠的遺傳概貌、特點，為實現我國長爪沙鼠的實驗動物化和資源保存，為提出長爪沙鼠質量控制標準及相應技術規範奠定基礎。遺傳質量檢測技術和標準建立，也將進一步豐富和完善我國實驗動物質量標準體系，為我國制定動物源性生物技術藥物的質量控制標準和相關規範提供支撐。
[0010]為實現上述目的，本發明以群體遺傳學理論為依據，在匯集國內外文獻資料的基礎上，通過對長爪沙鼠微衛星位點進行篩選、組合與優化，建立了適用於封閉群長爪沙鼠遺傳檢測的方法，並運用篩選出的微衛星位點組合對國內幾個長爪沙鼠群體進行遺傳多樣性分析。
[0011]—方面,本發明參考相關文獻從GenBank中共挑選出536個小鼠微衛星位點，進行引物合成。首先摸索並進一步優化這些位點的PCR擴增條件；536個微衛星位點中經過條件優化後，獲得313個擴增條帶清晰明亮、少或無雜帶的位點，將這些位點克隆測序後獲得129個長爪沙鼠微衛星位點，以及微衛星位點大小。在多態性篩選方面，本實驗選用1.5%的瓊脂糖電泳篩選初步確定等位基因數目。匯集本實驗室篩選的129個長爪沙鼠微衛星位點和已經報導的7個長爪沙鼠微衛星位點，共計136個微衛星位點(DXMU39、DXMitl7、D19Mit21、D19Mitll、D19Mit9、D19Mit2、D19Mitl、D18Mit45、D18Mit49、D17Mitl3、D17Mit38、D17Mit42、D16Mit26、D16Mit7、D15Mit34、D15Mitl7、D14Mit6、D14Mit92、DllMit4、DllMit35、DllMit36、DllMit42、DllMitl28、DllMit263、D10Mit66、DlOMit86、D9Mit70、D9Mit55、D9Mit47、D9Mit6、D8Mitl84、D8Mit56、D8Mit35、D8Mit24、D7Mit26、D7Mit33、D7Mit46、D7Mit71、D7Mit227、D7Mit333、D7Ndsl、D6Mit5、D6Mit37、D6Mit52、D6Mit85、D6Mitl39、D5Mit9、D5Mit25、D5Mit34、D4Mitl、D4Mit5、D4Mit7、D3Mit258、D3Mitl30、D3Mit221、D3Mitll7、D3Mitl7、D2Mit76、D2Mit231、D2Mit425、D2Mit525、DlMit428、DlMit432、DlMitll9、DlMit65、D16Mitl70、D12Mitl35、D9Mit323、D9Mit253、D15Mit9、D16Mitl00、D17Mit27、D17Mitl94、DllMit242、D10Mit266、D8Mit46、D7Mitl45、D6Mit339、D4Mit54、D5Mit31、D13M8、D12Mit201、DllMitl63、D17Mitl23、D2Mit22、D2Mitl、D3Mit56、D3Mitl56、D4Mitl23、D6Mit9、D9Mitl20、D10Mit223、DllMitl20、DllMit65、D13Mit246、D14Mitl6、D15Mitl23、D15Mitl24、D17Mit36、DlMitll2、D2Mitl6.1、D3MitlO、D3Mit215、D5Mit367、D6Mit23、D7Mit39、D7Mit76、D8Mit83、D10Mit20、DllMit5、D8Mitl70、DlMit362、D3Mit268、D6Mitl02、D7Mitl90、D8Mitl70、D13Mitl、D13Mit3、D13Mitl71、D16Mitl21、D13Mit216、D15Mit267、D16Mitl08、D16Mitl32、D17Mitl43、D17Mitl94、D17Mit226、D6Mitl02 和 D10Mit90 ;AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941和AF200947)。根據位點的等位基因數、多態性和分布情況，從136個位點中選擇出多態性大於 3 的 39 個位點(AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D 16Mit7、D 16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30 、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl、D3Mitl7、D15Mitl7、DllMit42、D17Mitl3、D19Mit9、DllMit4、D4Mit5、D3Mit56、D15Mit267、D6Mit9、D7Mit39)。這些位點均勻分布在染色體上，等位基因數平均3.7個。本發明篩選出的微衛星位點信息含量高，分布廣泛，呈高度多態性，適合封閉群長爪沙鼠遺傳檢測。
[0012]另一方面，本發明利用篩選出的39個微衛星位點分析已知的封閉群長爪沙鼠群體-浙江封閉群長爪沙鼠群體(ZF)、首都醫科大學長爪沙鼠群體(CMU)和西北野生長爪沙鼠群體(NW)，利用短串聯重複(STR)掃描技術得到該3個群體在39個微衛星位點上的基因型，錄入數據，運用Popgene3.2軟體進行數據分析。利用觀察等位基因數、有效等位基因數、香隆指數、觀察雜合度、有效雜合度等指標分析該群體的群體內遺傳變異，分析時使用的位點數依次減少，最後找出能夠反映該長爪沙鼠群體遺傳結構的最少使用位點數量。結果顯示:運用28個微衛星位點對各群體的分析結果與39個微衛星位點的分析結果沒有顯著性差異P > 0.05，據此確定對封閉群做遺傳檢測所需要的最少微衛星位點數目是 28 個(AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D16Mit7、D16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl)。
[0013]第三方面，本發明採用篩選出的28個微衛星位點分析國內首都醫科大學長爪沙鼠群體(CMU)、西北野生長爪沙鼠群體(NW)、浙江封閉群長爪沙鼠群體(ZF)、大連醫科大學長爪沙鼠群體(DL)和廣州醫學院長爪沙鼠群體(GZ)，利用STR掃描技術得到該5個群體在28個微衛星位點上的基因型，錄入數據，運用Popgene3.2軟體，分別進行了群體內遺傳變異和群體間遺傳差異分析。群體內遺傳變異選用平均觀察等位基因數、平均有效雜合度、平均觀察雜合度、香隆指數4個分析指標。群體間遺傳差異採用奈氏標準遺傳距離(Nei’sstandard genetic distance, DS)、群體間遺傳分化係數Rst、分子方差分析(Analysisof Molecular Variance，AMQVA)。結果顯示五個群體的平均有效雜合度分別是0.6239、
0.6671,0.4185,0.4592,0.3972，表明首醫長爪沙鼠群體、西北野生長爪沙鼠群體兩個群體均具有較高的群內遺傳變異，而浙江封閉群長爪沙鼠群體、大連醫科大學長爪沙鼠群體和廣州醫學院長爪沙鼠群體三個群體的群內變異較低，五個群體的變異程度為廣州醫學院長爪沙鼠群體<浙江封閉群長爪沙鼠群體<大連醫科大學長爪沙鼠群體<首醫長爪沙鼠群體<西北野生長爪沙鼠群體。根據群體間遺傳分化係數Rst和奈氏標準遺傳距離得到的親緣關係鄰接樹可以看出廣州醫學院長爪沙鼠群體與其它群體的親緣關係較遠。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為長爪沙鼠基因組DNA0.8%瓊脂糖電泳圖， 1-10:為動物編號。
[0015]圖2為位點D11MU4測序結果圖。
[0016]圖3為12隻長爪沙鼠在AF200941座位瓊脂糖凝膠電泳圖，M為50bp Marker, 1-12為動物編號。
[0017]圖4為純合子波形，主波大小172bp。
[0018]圖5為雜合子波形，第一個主波大小171bp，第二個主波大小183bp。
[0019]圖6為浙江封閉群長爪沙鼠基因組DNA0.8%瓊脂糖電泳圖。[0020]圖7為AF200941位點在西北野生長爪沙鼠群體的擴增條帶圖片，M為50bpMarker, 1-20為動物編號。
[0021]圖8為AF200941位點在西北野生長爪沙鼠群體STR掃描結果帶圖片。
[0022]圖9為浙江封閉群長爪沙鼠基因組DNA0.8%瓊脂糖電泳圖。
[0023]圖10為D2MU22位點擴增條帶圖片，M為50bp Marker, 1-10為動物編號。
[0024]圖11為D17MU38位點擴增條帶圖片，M為50bp Marker, 1-12為動物編號。
[0025]圖12為D7MU71位點擴增條帶圖片，M為50bp Marker, 1-12為動物編號。
[0026]圖13為D2MU22位點STR掃描結果帶圖片。
[0027]圖14為D17MU38位點STR掃描結果帶圖片。
[0028]圖15為D7MU71位點STR掃描結果帶圖片。
[0029]圖16為基於奈氏標準遺傳距離Ds的五個品系長爪沙鼠的鄰接樹，Popl:CMU,pop2:NW, pop3:ZF, pop4:DL, pop5:GZ。
【具體實施方式】
[0030]實施例1
[0031]1.1 方法
[0032]長爪沙鼠微衛星位點篩選實驗採用首醫長爪沙鼠群體和浙江長爪沙鼠群體，首醫長爪沙鼠群體16隻、浙江長爪沙鼠群體64隻；採取腎組織，放入小無菌塑膠袋中，_20°C冰凍保存備用。
[0033]1.1.1長爪沙鼠基因組DNA提取與檢測
[0034](I)取長爪沙鼠腎組織約0.1g於勻漿器中，加入1.7ml EDTA-Na2 (pH = 8.0) (NaCl2.19g，EDTA-Na24.47g，用IOM NaOH調至pH = 8.0，加蒸餾水至500ml)溶液，勻漿磨碎。將勻漿好的組織液加入10% SDS 100 μ I至終濃度為0.5%，再加入20mg/ml蛋白酶KlO μ 1，充分混勻後，置於37°C水浴過夜。
[0035](2)加入等體積(2ml)的Tris-飽和酚，充分混勻後(避免劇烈振蕩)以12000r/min離心lOmin，含DNA的水相位於上層，含雜質的有機相位於下層。吸取上清液於另一個
試管中，重複2~3次。
[0036](3)向上清液中加入等體積的飽和酹/氯仿(2ml)充分混勻，12000r/min離心IOmin0吸取上清液於另一個試管中，加入等體積的氯仿(2ml)充分混勻，12000r/min離心IOmin0
[0037](4)吸取上清液於另一個試管中，加入飽和NaCl 200 μ I混勻,然後加入3~5ml冷的無水乙醇，混勻，可見絮狀沉澱物出現。稍加離心，可見DNA沉澱團，吸出無水乙醇，加入Iml 75%乙醇洗滌兩次，吸出乙醇，空氣中乾燥DNA樣品。
[0038](5)視沉澱塊大小加入 100 μ I ~200 μ I TE 緩衝液(0.5Μ Tris, 2ml, 0.5M EDTA，
0.2ml，加蒸餾水至100ml)，充分溶解DNA。核酸蛋白分析儀測樣品濃度、OD260, OD280以及兩者比值。DNA樣品-20 0C保存備用。
[0039]1.1.2微衛星引物的選擇
[0040]實驗選用536個小鼠微衛星位點，以及GenBank中Neumann k等[5]於2001年報導的長爪沙鼠的9個微衛星位點，引物序列參照相關數據(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/pubmed/)。所有引物由上海生工生物工程技術服務有限公司以及北京基諾博實生物技術有限公司合成。
[0041]1.1.3PCR反應以及瓊脂糖電泳檢測
[0042]使用首醫長爪沙鼠群體16個樣本基因組DNA作為微衛星位點篩選的PCR擴增模版，篩選出長爪沙鼠微衛星位點；使用浙江長爪沙鼠群體64個樣本基因組DNA作為微衛星位點優化篩選的PCR擴增模板，篩選多態性較好的長爪沙鼠微衛星位點。PCR反應體系為15μ 1，其中:10XBuffer 1.5μ 1，上下遊引物(lOOpmol/μ I)各 I μ l，4XdNTP IOOymol/L:1μ I, Taq 酶 IU:1 μ I，50_100ng 基因組 DNA:1 μ I，純水(ddH20):8.5μ1 ;其中，Mg2+的終濃度為1.5~3.0mM。擴增條件:94°C預變性5min，94°C變性30s，退火溫度(47~60°C )30s，72°C延伸30s，35個循環後72°C繼續延伸7min，擴增產物4°C保存。取擴增產物5μ I經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳140V，30min，成相拍照。
[0043]長爪沙鼠微衛星位點篩選PCR擴增分為兩步:第一步，對首都醫科大學長爪沙鼠群體進行PCR擴增，並將PCR產物做克隆測序，篩選出長爪沙鼠的微衛星位點，並確定最佳擴增條件。影響PCR擴增結果的主要因素是Mg2+濃度和退火溫度，固定其它因素，Mg2+濃度設為1.5禮、2.01111、2.51111和3.01111 4個梯度，退火溫度根據實驗室前期經驗溫度值從47°C~60°C設12個梯度。經瓊脂糖電泳後，對條帶清晰、只有一條或兩條，且條帶大小位於微衛星大小範圍內的位點進行克隆測序，測序結果符合微衛星定義的記錄這個優化的Mg2+濃度和退火溫度，並把該位點作為被選位點。第二步，將篩選出的129個長爪沙鼠微衛星位點和GenBank中的7個位點(見表1.1)共136個對浙江長爪沙鼠群體進行PCR擴增，篩選擴增效率高，多態性良好的適用於封閉群長爪沙鼠遺傳檢測的微衛星位點。將浙江長爪沙鼠群體64個基因組DNA 4個一組，隨機分為隨機16組混合DNA。選用6個多態性較好的位點篩選多態性好的基因組DNA，用長爪沙鼠微衛星位點對多態性好的基因組DNA進行PCR，PCR產物經瓊脂糖電泳後，根據瓊脂糖電泳結果，初步判斷該位點的多態性，把等位基因數達到3個的位點保留，淘汰等 位基因數量小於3的位點。
[0044]1.2.結果
[0045]1.2.1基因組DNA分析
[0046]兩個長爪沙鼠群體的基因組DNA (首醫長爪沙鼠群體16個，浙江長爪沙鼠群體64個，總計80個)，經0.8%瓊脂糖電泳檢測顯示完整性好；核酸蛋白分析儀檢測所有樣品的OD260/OD280值均在1.8~2.0之間。動物編號1-10號的基因組DNA的瓊脂糖電泳圖如圖1。
[0047]1.2.2長爪沙鼠微衛星位點的篩選
[0048]536個微衛星位點中擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測有清晰圖帶，且只有I條或2條，且擴增結果有較好重複性，測序結果符合微衛星位點特點的位點有129個，將序列測定的結果輸入Genbank資料庫。表1.1中列出了這些長爪沙鼠微衛星位點對應的小鼠微衛星位點名稱及Genbank註冊號。其中，完美型微衛星104個(80.62%)，不完美型微衛星25個(19.38% )0把這些位點作為被選位點。
[0049]表1.1 GenBank中的長爪沙鼠微衛星位點名稱、註冊號及對應的小鼠位點名稱
[0050]
【權利要求】
1.一種通過小鼠微衛星位點篩選長爪沙鼠微衛星位點的方法，包括: 獲得一個長爪沙鼠群體的長爪沙鼠基因組DNA樣品； 從GenBank中挑選小鼠微衛星位點，進行引物合成； 將所述長爪沙鼠基因組DNA作為微衛星位點篩選的PCR模板； 進行PCR擴增，並確定最佳擴增條件； 瓊脂糖電泳，篩選條帶清晰、無雜帶或少雜帶的微衛星大小範圍內的PCR擴增產物； 對篩選出的PCR產物進行克隆測序； 篩選出長爪沙鼠的微衛星位點。
2.根據權利要求1的方法，其中篩選出長爪沙鼠微衛星位點共129個，分別為DXMit39、DXMitl7、D19Mit21、D19Mitll、D19Mit9、D19Mit2、D19Mitl、D18Mit45、D18Mit49、D17Mitl3、D17Mit38、D17Mit42、D16Mit26、D16Mit7、D15Mit34、D15Mitl7、D14Mit6、D14Mit92、DllMit4、DllMit35、DllMit36、DllMit42、DllMitl28、DllMit263、DlOMit66、D10Mit86、D9Mit70、D9Mit55、D9Mit47、D9Mit6、D8Mitl84、D8Mit56、D8Mit35、D8Mit24、D7Mit26、D7Mit33、D7Mit46、D7Mit71、D7Mit227、D7Mit333、D7Nds 1、D6Mit5、D6Mit37、D6Mit52、D6Mit85、D6Mitl39、D5Mit9、D5Mit25、D5Mit34、D4Mitl、D4Mit5、D4Mit7、D3Mit258、D3Mitl30、D3Mit221、D3Mitll7、D3Mitl7、D2Mit76、D2Mit231、D2Mit425、D2Mit525、DlMit428、DlMit432、DlMitll9、DlMit65、D16Mitl70、D12Mitl35、D9Mit323、D9Mit253、D15Mit9、D16Mitl00、D17Mit27、D17Mitl94、DllMit242、D10Mit266、D8Mit46、D7Mitl45、D6Mit339、D4Mit54、D5Mit31、D13M8、D12Mit201、DllMitl63、D17Mitl23、D2Mit22、D2Mitl、D3Mit56、D3Mitl56、D4Mitl23、D6Mit9、D9Mitl20、D10Mit223、DllMitl20、DllMit65、D13Mit246、D14Mitl6、D15Mitl23、D15Mitl24、D17Mit36、DlMitll2、D2Mitl6.1、D3MitlO、D3Mit215、D5Mit367、D6Mit23、D7Mit39、D7Mit76、D8Mit83、D10Mit20、DllMit5、D8Mitl70、DlMit362、D3Mit268、D6Mitl02、D7Mitl90、D8Mitl70、D13Mitl、D13Mit3、D13Mitl71、D16Mitl21、D13Mit216、D15Mit267、D16Mitl08、D16Mitl32、D17Mitl43、D17Mitl94、D17Mit226、D6Mitl02、D10Mit90。
3.根據權利要求1所述的方法，其中，PCR反應的上下遊引物對分別為SEQID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和 SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 和 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11和 SEQ ID NO: 12、SEQ IDNO:13 和 SEQ ID NO: 14,SEQ ID N0:15 和 SEQ ID NO: 16、SEQ ID N0:17 和 SEQ ID NO: 18,SEQID NO:19 和 SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23 和 SEQID NO:24,SEQ ID N0:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO:28、SEQ ID N0:29 和 SEQID NO:30, SEQ ID NO:31 和 SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33 和 SEQID NO:34、SEQID NO:35和 SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:37和 SEQ ID NO:38,SEQ ID NO:39和 SEQ IDNO:40、SEQ IDN0:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44、SEQ ID N0:45 和 SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47 和 SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49 和 SEQID NO:50、SEQID NO:51 和 SEQ IDNO:52,SEQ ID NO:53 和 SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55 和 SEQ IDNO:56,SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59 和 SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61 和 SEQ ID NO:62、SEQ IDNO:63 和 SEQ ID NO:64,SEQ ID NO:65 和 SEQ ID NO:66、SEQID NO:67 和 SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69 和 SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71 和 SEQ IDNO:72, SEQ ID NO:73 和 SEQ ID
4.一種對長爪沙鼠群體進行遺傳檢測的方法，所述方法包括: 獲得長爪沙鼠基因組DNA樣品； 選用適合於長爪沙鼠群體遺傳檢測的微衛星位點的引物，以長爪沙鼠基因組DNA樣品為模板，進行PCR擴增； 瓊脂糖電泳檢測擴增產物； 短串聯重複掃描檢測； 利用統計學分析方法分析群體內的遺傳變異性、群體間的遺傳距離。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於，所述群體內遺傳變異選用的分析指標為平均觀察等位基因數、平均有效雜合度、平均觀察雜合度、香隆指數；所述群體間遺傳距離採用奈氏標準遺傳距離、群體間遺傳分化係數Rst、分子方差分析。
6.根據權利要求4或5所述的方法，其中選用39個微衛星位點，包括權利要求2中所篩選的 32 個位點:D16Mit7、D16Mit26、DlMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66、D13Mitl、D3Mitl7、D15Mitl7、DllMit42、D17Mitl3、D19Mit9、DllMit4、D4Mit5、D3Mit56、D15Mit267、D6Mit9 和 D7Mit39 ； 以及已知的 7 個位點:AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947。
7.根據權利要求6所述的方法，其中PCR反應的上下遊引物分別為SEQID NO:261和SEQ ID NO:262,SEQ ID NO:263 和 SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265 和 SEQ ID NO:266、SEQID NO:267 和 SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:269 和 SEQ ID NO:270、SEQ ID NO:271 和 SEQID NO:272, SEQ ID NO:273 和 SEQ ID NO:274、SEQ ID N0:27 和 SEQ ID NO: 28、SEQID NO:，25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO :223 和 SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:63 和 SEQ IDNO:64、SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85 和 SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:159 和 SEQID NO:160,SEQ ID NO:163 和 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO:169 和 SEQ ID NO: 170、SEQ IDNO:195 和 SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:75 和 SEQID NO:，76,SEQ ID NO:115和 SEQ ID N0:116、SEQ ID NO:107和 SEQ ID NO: 108,SEQ IDNO:13和SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:3 和 SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:63 和 SEQ ID NO:64、SEQ ID N0:49 和 SEQ IDNO:50、SEQID NO:233 和 SEQ ID NO: 234,SEQ ID NO:113和 SEQ ID NO: 114、SEQ IDNO:31 和 SEQ IDNO:32,SEQ ID NO:43 和 SEQ ID NO:44,SEQ ID N0:19 和 SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:9 和SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:37 和 SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:101 和 SEQID NO:102、SEQ IDNO:173 和 SEQ ID NO: 174、SEQ ID NO:243 和 SEQ ID NO:244、SEQ IDNO: 93 和 SEQ ID NO:，94、SEQ ID NO:211 和 SEQ ID NO:212。
8.根據權利要求6所述的方法，其中選用28個微衛星位點AF200942、AF200943、AF200944、AF200946、AF200945、AF200941、AF200947、D 16Mit7、D 16Mit26、D lMit362、D8Mitl84、D7Mit33、D6Mit37、D5Mit31、D12Mit201、D2Mit22、D15Mitl24、DllMit36、D7Mit71、D2Mit76、D3Mitl30、D19Mitl、DllMit35、D17Mit38、DXMitl7、D8Mit56、D10Mit66和 D13Mitl。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，PCR反應的上下遊引物分別為SEQIDNO:，261 和 SEQ ID NO:262、SEQ ID NO:263 和 SEQ ID NO:264、SEQ ID NO:265 和 SEQ IDNO:，266,SEQ ID NO:267 和 SEQ ID NO:268、SEQ ID NO:269 和 SEQ ID NO:270,SEQ IDNO:271和 SEQ ID NO:272,SEQ ID NO:273 和 SEQ ID NO:274、SEQ ID NO:27和 SEQ IDNO:28,SEQID NO:25 和 SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:223 和 SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:63 和 SEQ IDNO:64,SEQ ID NO:71 和 SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:85 和 SEQ ID NO:86、SEQID NO:159 和SEQ ID NO:160,SEQ ID NO:163 和 SEQ ID NO: 164,SEQ ID NO:169 和 SEQID NO: 170、SEQID NO:195 和 SEQ ID NO:196、SEQ ID NO:41 和 SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:75 和 SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:115 和 SEQ ID NO:116、SEQ ID NO:107 和 SEQ IDNO:108、SEQ ID NO:13 和 SEQ ID NO: 14,SEQ ID NO:39 和 SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:21 和 SEQ ID NO:22、SEQID NO:3 和 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:63 和 SEQ ID NO:64、SEQ IDNO:49 和 SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:233 和 SEQ ID NO:234。
10.根據權利要求4所述的方法的應用，用於進行長爪沙鼠群體內遺傳變異和群體間遺傳差異分析。
【文檔編號】C12Q1/68GK103484452SQ201210195672
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年6月14日 優先權日:2012年6月14日
【發明者】陳振文, 杜小燕, 路靜, 薩曉嬰, 賀爭鳴, 王超, 李長龍 申請人:首都醫科大學