有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及用途的製作方法

2023-09-18 20:31:00

專利名稱：有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及核酸技術領域，具體地說是涉及有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途。
背景技術：
惡性腫瘤是一種危害人類生命健康的主要疾病，但迄今為止對此仍然沒有有效的治療手段。長期以來科學家們一直在試圖研製可以有效治療惡性腫瘤的新藥。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能作為抗腫瘤藥物的活性成分的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)。為此，本發明採用以下技術方案它為雙鏈RNA分子並且其核苷酸序列與具有以下特徵的核苷酸序列(I)至少70％的同源度正義鏈和反義鏈的長度均為21個核苷酸，正義鏈和反義鏈各自的3』端為兩個連續的脫氧胸苷酸(TT)，兩條鏈除去3』端的TT以外的19個核苷酸上的鹼基互補形成雙鏈，正義鏈自5』端開始的19個核苷酸序列和序列表第1號序列中連續兩個鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸之後的19個核苷酸序列完全一致，每條鏈中的鹼基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數量與鹼基為胞嘧啶(C)的核苷酸數量之和佔除去3』端的TT以外的19個核苷酸數量的比例為大於25％小於75％(即G/C比例)。
上述小幹擾RNA分子(SiRNA)為人工合成，正義鏈和反義鏈各自的3』末端有兩個脫氧胸甘酸(TT)，其它19個核苷酸的鹼基可以是腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)；兩條鏈除去3』端的TT以外的19個核苷酸上的鹼基互補(A和U，C和G)形成雙鏈，但它們3』端的兩個TT卻以單鏈的形式存在。
當序列表中第1號核苷酸序列出現兩個以上連續的鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸時，上述「正義鏈自5』端開始的19個核苷酸序列和序列表中第1號核苷酸序列的連續兩個鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸之後的19個核苷酸序列完全一致」可以被理解為「正義鏈自5』端開始的19個核苷酸序列和序列表中第1號核苷酸序列的任意兩個連續的鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸之後的19個核苷酸序列完全一致。」人類PLK1(polo-like kinase 1)是一種新型的絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶並且和細胞周期密切相關。研究表明PLK1對於細胞周期尤其是腫瘤細胞的迅速分離和增殖是至關重要的，PLK1與細胞周期中的許多過程密切相關，例如Cdc2的激活、染色體的分離、中心粒的成熟、雙急紡錘體的形成等過程；研究也表明PLK在許多的人類惡性腫瘤(例如肺癌、乳腺癌、結腸癌等)的表達明顯增加，提示它在許多人類惡性腫瘤的發生發展中起重要作用。
本發明所提供的針對PLK1 mRNA分子的小幹擾RNA(SiRNA)，可以有效的剔除腫瘤細胞的PLK1 mRNA分子，進而使腫瘤細胞停止生長並發生凋亡，從而為治療惡性腫瘤找到了新型的分子。它的最大抑制濃度在幾個到幾十個納摩爾(nM)，這比抗反譯核酸的有效濃度要低10-100倍。
本發明提供的SiRNA分子以同時具有以下特徵為更佳1)、核苷酸序列(I)的正義鏈自5』端開始的第一個核苷酸是鹼基為鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)的核苷酸中的一種；也就是說當序列表第1號序列中出現兩個以上連續的鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸時，正義鏈自5』端開始的19個核苷酸序列和該兩個以上連續的鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸中的最後兩個核苷酸之後的19個核苷酸序列完全一致，」。
2)、上述SiRNA序列和已知的人類其他基因和表達片段無100％的同源性。下表列出了符合這些條件的部分核苷酸序列(I)SiRNA 序編號 列號正義鏈序列反義鏈序列MW*攻擊範圍#
P1 GAUUGUGCCU CAGAGACUUA2AAGUCUCUGTTGGCACAAUCTT14179.4306-326P2 AGCCCUGACU CUCAGGCUCA3GAGCCUGAGTTGUCAGGGCUTT14224.7499-519P3 AUUGUGCUUG ACUGGCAGCC4GCUGCCAGUTTAAGCACAAUTT14194.5539-559P4 UGAAGAUCUG UUUCACCUCC5GAGGUGAAATTAGAUCUUCATT14164.3617-637P5 AGAGCACAGU CACCUCGAAA6UUCGAGGUGTTCUGUGCUCUTT14194.5739-759P6 AAGAGACCUA AUCCGGAGGU7CCUCCGGAUTTAGGUCUCUUTT14194.5830-850P7 GGUUUUCGAU CUGGGAGCAA8UGCUCCCAGTTUCGAAAACCTT14194.51031-1051P8 GAGGAGGCUG CAGGAUCCUC9AGGAUCCUGTTAGCCUCCUCTT14224.71253-1273P9 GAUCACCCUC AUAUUUAAGG10 CUUAAAUAUTTAGGGUGAUCTT14149.21506-1526P10CGGCAGCGUG GUUGAUCUGC11 CAGAUCAACTTACGCUGCCGTT14224.71642-1662#攻擊範圍是指該核苷酸序列(I)在序列表第1號序列中的相對應位置。
對於以上所說的同源度的數值，以80％以上為更佳。本發明所說之同源度是指任何SiRNA，其核苷酸序列和本發明所說的核苷酸序列(I)的正義鏈或負義鏈序列，在相應位置上的核苷酸相同率。
本發明所提供的SiRNA還包括針對以上所提到的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)的序列的任何部份或全部經化學修飾後所形成的的小幹擾RNA分子。
所述化學修飾包括主要包括以下三類第一、對連接相鄰兩個核苷酸的磷酸二酯鍵的部份修飾或用其它任何化學鍵取代。典型的磷酸二酯鍵的部份修飾是將磷酸雙鍵上的氧置換成硫(硫化)或其它元素，或將磷酸單鍵上的氧變成氮(氮化)或其它元素和化學基團；對磷酸二酯鍵本身的全部取代，也包括對其本身或其部份以及和它相連的兩個核糖的部份或全部改變，典型的例證是將磷酸二酯鍵和兩個相鄰的核糖變成肽鍵，使得核酸變成肽核酸(peptide nucleicacid，PNA)；第二、對核甘中核糖的五元環進行改變或其側鏈上的化學基團作修飾。改變核糖環的典型例證如將五元的核糖環變成六環的Morpholino環；對核糖側鏈上的修飾主要是指將核糖2』位上OH變成其它元素(如滷素元素)，或用其它化學基團替代OH中的H(例如烷基)。第三、將核苷酸上的鹼基環作整體的改變或側鏈的修飾。
本發明所提供的小幹擾RNA(SiRNA)可以應用於製備治療人類惡性腫瘤、惡性腫瘤相關的疾病以及與PLK1表達增加相關的任何疾病的藥物中。
本發明還提供了一種較單獨使用上表所列小幹擾RNA(SiRNA)效果更好的混合物。它為與上表所列的P1號小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與上表所列的P4號小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與上表所列的P9號小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子中任意兩種以上任意配比的混合物。
就上述技術方案，它以以下進一步的技術方案為更佳它為與P1號小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與P4號小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與P9號小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子的任意比例的混合物，其中摩爾比為(20-80)∶(20-80)∶(20-80)時更好。
上述同源度以80％以上為佳。


圖1、上表所列的10種SiRNA對PLK1 mRNA水平的的作用。圖示50nM的10種SiRNA作用於SW480細胞72小時後對細胞中PLK1 mRNA水平的影響。對照組是指細胞在等同條件下用轉染試劑作處理。縱坐標表示PLK1 mRNA的相對表達量。圖中的每一個數據表示三個重複實驗的平均值。
圖2、不同的SiRNA對SW480細胞PLK1 mRNA水平作用的濃度效應。圖示不同濃度的P1、P4、P9以及三種SiRNA的混合物(每個SiRNA在混合SiRNA中的濃度均為總濃度的1/3)。圖中縱坐標表示PLK1 mRNA表達的抑制率(和對照組相比)，對照組是指細胞在等同條件下用轉染試劑作處理。圖中的每一個數據表示三個重複實驗的平均值。
圖3、不同SiRNA作用於腫瘤細胞72小時後對細胞數的影響。圖示為不同濃度的P1、P4、P9以及三種SiRNA的混合物(每個SiRNA在混合SiRNA中的濃度均為總濃度的1/3)。縱坐標代表細胞減少的相對百分數((1-處理組細胞數/對照組細胞數)×100％)。圖中的每一個數據表示三個重複實驗的平均值。
圖4、不同濃度的三種SiRNA作用於腫瘤細胞後對細胞存活率的影響。圖示不同濃度的P1、P4、P9以及三種SiRNA的混合物(每個SiRNA在混合SiRNA中的濃度均為總濃度的1/3)作用於SW480細胞72小時後細胞上存活率的影響。圖中的每一個數據表示三個重複實驗的平均值。
圖5、不同的SiRNA對不同的腫瘤細胞株PLK1 mRNA水平的敲除作用。圖示50nM的P1、P4、P9以及三種SiRNA的混合物(P1、P4、P9的摩爾濃度比為40∶20∶40)作用於人類乳腺癌細胞Bcap-37，人類胃癌細胞D6和人類肝癌細胞SMMU-7721 72小時後對這些細胞PLK1 mRNA表達的抑制效應。圖中縱坐標表示PLK1 mRNA表達的抑制率(和對照組相比)，對照組是指細胞在等同條件下用轉染試劑作處理。圖中的每一個數據表示三個重複實驗的平均值。
圖6、不同SiRNA作用於不同的腫瘤細胞株72小時後對細胞數的影響。圖示為50nM的P1、P4、P9以及三種SiRNA的混合物(P1、P4、P9的摩爾濃度比為40∶20∶40)作用於人類乳腺癌細胞Bcap-37，人類胃癌細胞D6和人類肝癌細胞SMMU-7721 72小時後對這些細胞細胞數減少的作用。縱坐標代表細胞減少的相對百分數((1-處理組細胞數/對照組細胞數)×100％)。圖中的每一個數據表示三個重複實驗的平均值。
具體實施例方式
實施例1 SiRNA的合成SiRNA的合成可委託公開對外開展合成業務的商業公司，比如美國Dharmacon公司，具體可通過www.dharmacon.com獲知，所有的SiRNA分子都經過2位上脫保護、脫鹽、純化、和退火形成雙鏈處理，然後溶於DEPC處理的蒸餾水中。
本發明提供的小幹擾RNA分子(SiRNA)的製備方法也可採用現有的固相化學合成法。該方法可參見Wincott F，DiRenzo A，Shaffer C，Grimm S，TraczD，Workman C，Sweedler D，Gonzalez C，Scaringe S and Usman N.Synthesis，deprotection，analysis and purification of RNA and ribozymes.NucleicAcids Res.1995，232677-84。
以前表序號2的小幹擾RNA分子(SiRNA)為例整個化學合成可大致分成四個的過程(1)寡聚核糖核酸的合成；(2)脫保護；(3)純化分離；(4)脫鹽退火無菌消毒。
具體製備操作如下(1)、寡聚核糖核酸的合成SiRNA的合成是在自動DNA/RNA合成儀(例如Applied Biosystems EXPEDITE 8909)上進行，根據P1號的小幹擾RNA分子的核酸序列(正義鏈5』-GAUUGUGCCUAAGUCUCUGTT，反義鏈5』-CAGAGACUUAGGCACAAUCTT)的次序將對應的核苷酸逐個連接起來。由於SiRNA是由一段19聚的寡聚核糖核酸和一個2聚的脫氧胸苷酸組成.因此起始物為固相(CPG)連接的5』-O-對二甲氧基三苯甲基-胸苷(1-2umol).具體每一個循環合成可分為四步來完成(圖1)。第一步是將與固相連接的胸苷上5』位的保護基在3％三氯乙酸的作用下洗脫；第二步在活性催化劑S-乙基四唑的作用下，將5』-O-對二甲氧基三苯甲基-胸苷亞磷醯胺偶聯到已脫去保護的上一個胸苷上，形成二胸苷亞磷酸三酯。偶合時間和偶合循環的次數均按儀器廠家提供程序來完成；第三步是將偶合的二胸苷亞磷酸三酯在0.05M碘水的作用下氧化成二胸苷磷酸三酯；第四步是乙醯化，將固相上的少量未反應的活性基團(例如羥基和胺基)在乙酸酐的作用下形成酯或醯胺。從而達到封閉作用，用以減少整體副產物的產生。重複此循環直至完成全部核酸序列的合成。
(1)脫保護將合成好的固相SiRNA放入一個可以密封的小瓶，並與加入1毫升的甲胺水溶液(10M，50％乙醇)，靜置在室溫。兩小時後，取出溶液，並將固相CPG再次用乙醇；水和乙腈的混合液淋洗，並將淋洗液和前面取出的溶液合併一處，將其溶劑抽乾。在小瓶中繼續加入1毫升四丁基氟化銨的四氫呋喃溶液(1M)。將溶液在室溫靜置12個小時。脫去所有寡聚核糖核酸上的保護基(包括鹼基，核苷磷酸和核苷2』位的矽烷化保護基)。再經過乙醇沉澱，產生SiRNA的粗產物。
(2)純化分離將SiRNA的粗產物溶解在2毫升的乙酸銨的水溶液中，然後經過反相C18高壓液相色譜的分離。運用梯度淋洗的方法，收集SiRNA的主產物(淋洗液A0.1M的乙酸銨；淋洗液b20％的0.1M的乙酸銨和80％的乙腈)。將SiRNA的主產物的溶劑除去，並加入5毫升80％乙酸水溶液，在室溫靜置15分鐘。然後將此溶液進行陰離子交換的分離(DEAE-5PW，陰離子交換柱)，即可得到純度在90％以上的SiRNA(梯度淋洗，淋洗液A0.025M的Tris-HCl，0.025M NaClpH＝8，5％乙腈；淋洗液b0.025M的Tris-HCl，2.0M NaCl，pH＝8，5％乙腈)。
(3)脫鹽退火無菌消毒純化的SiRNA經過透析，除去鹽份，SiRNA的溶液進行過濾消毒和乾燥結晶。然後將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸進行退火處理形成穩定的雙股交鏈的SiRNA。其方法是將正義鏈和反義鏈的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的緩衝溶液中(10mM Tris，pH＝7.5-8.0，50mM NaCl)。將此溶液加熱到95℃，然後緩緩將此溶液冷卻致室溫(此過程應不少於一個小時)。最後將此溶液存放在4℃冰箱中保存，以便隨時可以使用。
經過純化後的SiRNA的純度和鑑定有兩種比較常用的辦法。其一用毛細管凝膠電泳法來鑑定SiRNA的純度，該方法可參見Paulus A，Ohms JI.Analysisof oligonucleotides by capillary gelelectrophoresis.J Chromatogr1990，507113-123。
其二是用MALDI-TOF質譜來準確測量其分子量，從而確定SiRNA的化學結構組成。
本發明所說的所有SiRNA都可以根據其序列採用上述方法製備，鑑定方法同上。
實施例2 細胞培養和SiRNA的轉染1、細胞培養。SW480是從結腸癌組織中分離出來的一種結腸癌細胞系(Leibovitz A，Stinson JC，McCombs WB 3rd，McCoy CE，Mazur KC，Mabry ND.Classification of human colorectal adenocarcinoma cell lines.Cancer Res.1976；36(12)4562-9.)。該細胞在體外用含10％胎牛血清的DMEM培養劑基來培養。Bcap-37、D6和SMMU-7721是國內建株的腫瘤細胞，它們的培養條件是含10％胎牛血清的RPMI 1640培養基。
2、SiRNA的轉染SiRNA轉入腫瘤細胞藉助於Invitrogen(www.invitrogen.com)公司的Oligofectamine來進行，具體步驟按照說明書來進行。簡述如下，5×104的腫瘤細胞接種於24孔培養板上過夜，第二天被轉入SiRNA，然後繼續培養72小時後檢測細胞中PLK1 mRNA的水平。
3、SW480細胞PLK1 mRNA表達水平的檢測腫瘤細胞PLK1 mRNA表達水平的檢測用實時PCR的技術來進行。具體可以分為以下三步第一，細胞中RNA的提取，該方法可以參照現有的標準方法學來進行(見第四章，Currentprotocols in Molecular Biology，John Wiley，2003)。第二步，cDNA的合成，合成方法也可參照標準的方法學來進行(見第五章，Current protocols inMolecular Biology，John Wiley，2003)。第三步，實時PCR的進行，實時PCR是在ABI7700序列檢測儀上進行，具體方法參照ABI公司的標準程序來進行。在本專利中用於檢測PLK1的5』端引物的序列是5』-CAAGCTCATCTTGTGCCCACT-3』，對應於PLK1 cDNA序列中的1680到1700位，3』端引物的序列是5』-AGGCGGTATGTGCGGAAGT-3』，對應於PLK1 cDNA序列中的1754到1736位，實時PCR探針的序列是5』-CCGCTTCTCGTCGATGTAGGTCACG-3』，對應於PLK1 cDNA序列中的1710到1734位。
4、Bcap-37、D6和SMMU-7721細胞PLK1 mRNA表達水平的檢測均與SW480細胞PLK1 mRNA表達水平的檢測相同。
實施例3 SiRNA對腫瘤細胞PLK1 mRNA的抑制作用1、SiRNA的選擇本發明選擇了針對PLK1 mRNA編碼區的SiRNA分子共10個，即上表所列的10個SiRNA分子。攻擊位點從起始密碼的243-1599之間，每條SiRNA分子中19個互補成雙鏈的核苷酸序列中的G/C在37％-63％之間。
2、10種SiRNA對SW480細胞PLK1 mRNA表達的作用A、濃度為50nM的10個SiRNA對SW480細胞PLK1 mRNA的作用用50nM的這10種SiRNA作用於SW480細胞72小時後，觀察它們對PLK1 mRNA水平的作用時發現第1、4、9號SiRNA分子對PLK1的抑制作用最為明顯，分別達到91％、94％和89％。另外，第2、3、5、7、8對PLK1 mRNA的抑制作用也大於50％，而第6、10 A對PLK1 mRNA的也有相當的抑制作用(圖1)。
B、第1、4、9號SiRNA以及它們混合物對SW480細胞PLK1 mRNA抑制作用的濃度效應為了觀察以上對PLK1 mRNA具有最佳抑制效果的1、4、9號SiRNA對PLK1作用的濃度效應，我們選擇了濃度從0.1到50nM SiRNA以及3種SiRNA的混合物(總濃度與上述濃度相等，每種SiRNA在其中佔的比率各為1/3)。結果發現三種SiRNA對PLK1 mRNA抑制作用具有明顯的濃度效應，當濃度達到12.5nM時抑制作用已經達到最大，三種SiRNA的IC50分別為2.85nM、3.80nM和4.42nM。結果還發現，相同濃度三種SiRNA的混合物對PLK1的抑制作用比單獨使用一種SiRNA的抑制作用更強，其最大抑制濃度為6.25nM，IC50為1.38nM(圖2)。
3、第1、4、9號SiRNA以及它們混合SiRNA對SW480細胞數的影響由於在實驗中發現用1、4、9號SiRNA和三種SiRNA的混合物作用於細胞後觀察到SW480細胞數發生明顯減少。因此，我們觀察了這三種SiRNA及其混合物對SW480細胞作用後細胞數目的改變。結果發現，三種SiRNA以及它們的混合物作用於SW480後可導致細胞數目明顯減少。三種單獨使用的SiRNA對SW480細胞數減少最大的作用濃度在12.5nM左右，1、4、9號SiRNA對細胞數減少作用的IC50值分別為4.44nM、3.83nM和4.34nM。相比較而言，三種SiRNA的混合物對細胞數減少的作用比單獨使用一種SiRNA效果要更強，其最大作用效應濃度在3nM左右，IC50濃度為1.23nM(圖3)。
4、第1、4、9號SiRNA分子和它們的混合物作用於SW480細胞系統，對其存活率的影響用不同濃度的三種SiRNA以及它們的混合物作用於SW480細胞後，觀察細胞存活率的改變時發現單獨使用一種SiRNA對細胞的存活率無明顯的降低作用，只有當它們各自的濃度大於6.6nM時才會使細胞的存活率略有下降，當濃度達到50nM時細胞的存活率仍在80％左右。但是，三種SiRNA混合物對細胞存活率的影響要大於單獨使用一種SiRNA。其抑制作用在1nM時已出現，到50nM時細胞的存活率為75％(圖4)。
5、第1、4、9號SiRNA分子和它們的混合物對乳腺癌細胞、胃癌細胞和肝癌細胞PLK1 mRNA表達的作用。
用50nM的三種SiRNA以及它們的混合物(總濃度與上述濃度相等，P1、P4、P9的摩爾濃度比為40∶20∶40)作用於乳腺癌Bcap-37、胃癌細胞D6，肝癌細胞SMMU-7721後72小時發現這三種SiRNA以及它們的混合物對上述三種腫瘤細胞PLK1 mRNA表達都有明顯的抑制效應。其中，對Bcap-37細胞的抑制率在70％-75％；對D6細胞的抑制率在67％-73％；對SMMU-7721細胞的抑制率在74％-80％(圖5)。
7、第1、4、9號SiRNA分子和它們的混合物對乳腺癌細胞、胃癌細胞和肝癌細胞細胞數的作用。
用50nM的三種SiRNA以及它們的混合物(總濃度與上述濃度相等，P1、P4、P9的摩爾濃度比為40∶20∶40)作用於乳腺癌Bcap-37、胃癌細胞D6，肝癌細胞SMMU-7721後72小時發現這三種SiRNA以及它們的混合物可以使上述三種腫瘤細胞的細胞數明顯減少。其中，它們可使Bcap-37的細胞數減少80％-87％；可使D6細胞的細胞數減少76％-81％；可使SMMU-7721的細胞數減少80％-86％(圖6)結果還表明，三種SiRNA的混合物對細胞數減少的效應要好於單獨使用一種SiRNA。
實施例4 SiRNA的修飾如上所述，修飾的種類可分三大類並且每一類中有許多變化，因此它們各自的合成方法不盡一樣。這裡列舉兩種最為常見的SiRNA修飾方法。並且，下述的方法並不限制本發明所述的有關對SiRNA修飾的保護範圍。
1、硫化硫化是指將核苷磷酸二酯鍵上的一個氧原子轉變成硫原子形成核苷硫代磷酸二酯。由於整個SiRNA的其它組成結構沒有變化，因此它的合成和實施例1的SiRNA合成過程基本一樣。只需將合成過程中的氧化反應變成硫化反應，在此反應中加入適當的硫化試劑，例如3H-1，2-benzodithiol-3-one 1，1-dioxide(又稱Beaucage試劑)。
2、核苷2』位羥基的修飾核苷2』位羥基的修飾是指用各種飽和烷氧基或不飽和烷氧來取代核苷五員糖環上的2』位羥基。其中最常見的是用甲氧基來取代核苷2』位的羥基。SiRNA的核苷2』位甲氧基化的合成和實施例1的SiRNA的合成步驟基本一致，只需要在偶合反應中用2』-甲氧基核苷亞磷醯胺來取代2』-叔丁基二甲基矽氧基核苷亞磷醯胺即可。
序列表110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效抑制腫瘤細胞PLK1 mRNA的SiRNA分子1601121012112204212DNA213human polo-like kinase 1(PLK1)220
221misc_feature2221...2204223cDNA序列4001GAGCGGTGCG GAGGCTCTGC TCGGATCGAG GTCTGCAGCG CAGCTTCGGG AGCATGAGTG 60CTGCAGTGAC TGCAGGGAAG CTGGCACGGG CACCGGCCGA CCCTGGGAAA GCCGGGGTCC 120CCGGAGTTGC AGCTCCCGGA GCTCCGGCGG CGGCTCCACC GGCGAAAGAG ATCCCGGAGG 180TCCTAGTGGA CCCACGCAGC CGGCGGCGCT ATGTGCGGGG CCGCTTTTTG GGCAAGGGCG 240GCTTTGCCAA GTGCTTCGAG ATCTCGGACG CGGACACCAA GGAGGTGTTC GCGGGCAAGA 300TTGTGCCTAA GTCTCTGCTG CTCAAGCCGC ACCAGAGGGA GAAGATGTCC ATGGAAATAT 360CCATTCACCG CAGCCTCGCC CACCAGCACG TCGTAGGATT CCACGGCTTT TTCGAGGACA 420ACGACTTCGT GTTCGTGGTG TTGGAGCTCT GCCGCCGGAG GTCTCTCCTG GAGCTGCACA 480AGAGGAGGAA AGCCCTGACT GAGCCTGAGG CCCGATACTA CCTACGGCAA ATTGTGCTTG 540GCTGCCAGTA CCTGCACCGA AACCGAGTTA TTCATCGAGA CCTCAAGCTG GGCAACCTTT 600TCCTGAATGA AGATCTGGAG GTGAAAATAG GGGATTTTGG ACTGGCAACC AAAGTCGAAT 660ATGACGGGGA GAGGAAGAAG ACCCTGTGTG GGACTCCTAA TTACATAGCT CCCGAGGTGC 720TGAGCAAGAA AGGGCACAGT TTCGAGGTGG ATGTGTGGTC CATTGGGTGT ATCATGTATA 780CCTTGTTAGT GGGCAAACCA CCTTTTGAGA CTTCTTGCCT AAAAGAGACC TACCTCCGGA 840TCAAGAAGAA TGAATACAGT ATTCCCAAGC ACATCAACCC CGTGGCCGCC TCCCTCATCC 900AGAAGATGCT TCAGACAGAT CCCACTGCCC GCCCAACCAT TAACGAGCTG CTTAATGACG 960AGTTCTTTAC TTCTGGCTAT ATCCCTGCCC GTCTCCCCAT CACCTGCCTG ACCATTCCAC 1020CAAGGTTTTC GATTGCTCCC AGCAGCCTGG ACCCCAGCAA CCGGAAGCCC CTCACAGTCC 1080TCAATAAAGG CTTGGAGAAC CCCCTGCCTG AGCGTCCCCG GGAAAAAGAA GAACCAGTGG 1140TTCGAGAGAC AGGTGAGGTG GTCGACTGCC ACCTCAGTGA CATGCTGCAG CAGCTGCACA 1200GTGTCAATGC CTCCAAGCCC TCGGAGCGTG GGCTGGTCAG GCAAGAGGAG GCTGAGGATC 1260CTGCCTGCAT CCCCATCTTC TGGGTCAGCA AGTGGGTGGA CTATTCGGAC AAGTACGGCC 1320TTGGGTATCA GCTCTGTGAT AACAGCGTGG GGGTGCTCTT CAATGACTCA ACACGCCTCA 1380
TCCTCTACAA TGATGGTGAC AGCCTGCAGT ACATAGAGCG TGACGGCACT GAGTCCTACC 1440TCACCGTGAG TTCCCATCCC AACTCCTTGA TGAAGAAGAT CACCCTCCTT AAATATTTCC 1500GCAATTACAT GAGCGAGCAC TTGCTGAAGG CAGGTGCCAA CATCACGCCG CGCGAAGGTG 1560ATGAGCTCGC CCGGCTGCCC TACCTACGGA CCTGGTTCCG CACCCGCAGC GCCATCATCC 1620TGCACCTCAG CAACGGCAGC GTGCAGATCA ACTTCTTCCA GGATCACACC AAGCTCATCT 1680TGTGCCCACT GATGGCAGCC GTGACCTACA TCGACGAGAA GCGGGACTTC CGCACATACC 1740GCCTGAGTCT CCTGGAGGAG TACGGCTGCT GCAAGGAGCT GGCCAGCCGG CTCCGCTACG 1800CCCGCACTAT GGTGGACAAG CTGCTGAGCT CACGCTCGGC CAGCAACCGT CTCAAGGCCT 1860CCTAATAGCT GCCCTCCCCT CCGGACTGGT GCCCTCCTCA CTCCCACCTG CATCTGGGGC 1920CCATACTGGT TGGCTCCCGC GGTGCCATGT CTGCAGTGTG CCCCCCAGCC CCGGTGGCTG 1980GGCAGAGCTG CATCATCCTT GCAGGTGGGG GTTGCTGTGT AAGTTATTTT TGTACATGTT 2040CGGGTGTGGG TTCTACAGCC TTGTCCCCCT CCCCCTCAAC CCCACCATAT GAATTGTACA 2100GAATATTTCT ATTGAATTCG GAACTGTCCT TTCCTTGGCT TTATGCACAT TAAACAGATG 2160TGAATATTCA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAA 2204110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011210221121212RNA213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4002GAUUGUGCCU AAGUCUCUGT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011
210321121212RNA213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4003AGCCCUGACU GAGCCUGAGT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011210421121212RNA213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4004AUUGUGCUUG GCUGCCAGUT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011210521121212RNA
213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4005UGAAGAUCUG GAGGUGAAAT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011210621121212RNA213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4006AGAGCACAGU UUCGAGGUGT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011210721121212RNA213人工序列
220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4007AAGAGACCUA CCUCCGGAUT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011210821121212RNA213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4008GGUUUUCGAU UGCUCCCAGT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途16011210921121212RNA213人工序列220
221misc_feature
2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列4009GAGGAGGCUG AGGAUCCUGT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途160112101021121212RNA213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列40010GAUCACCCUC CUUAAAUAUT T 21110杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司120有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)、其混合物及它們的用途160112101121121212RNA213人工序列220
221misc_feature2221...21223雙鏈，表中所列為反義鏈序列
40011CGGCAGCGUG CAGAUCAACT T 2權利要求
1.有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，它為雙鏈RNA分子並且其核苷酸序列與具有以下特徵的核苷酸序列(I)至少70％的同源度正義鏈和反義鏈的長度均為21個核苷酸，正義鏈和反義鏈各自的3』端為兩個連續的脫氧胸苷酸(TT)，兩條鏈除去3』端的TT以外的19個核苷酸上的鹼基互補形成雙鏈，正義鏈自5』端開始的19個核苷酸序列和序列表第1號序列中連續兩個鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸之後的19個核苷酸序列完全一致，每條鏈中的鹼基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數量與鹼基為胞嘧啶(C)的核苷酸數量之和佔除去3』端的TT以外的19個核苷酸數量的比例為大於25％小於75％(即G/C比例)。
2.如權利要求1所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈GAUUGUGCCUAAGUCUCUGTT，反義鏈CAGAGACUUAGGCACAAUCTT。
3.如權利要求1所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈AGCCCUGACUGAGCCUGAGTT，反義鏈CUCAGGCUCAGUCAGGGCUTT。
4.如權利要求2所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈AUUGUGCUUGGCUGCCAGUTT，反義鏈ACUGGCAGCCAAGCACAAUTT。
5.如權利要求2所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈UGAAGAUCUGGAGGUGAAATT，反義鏈UUUCACCUCCAGAUCUUCATT。
6.如權利要求2所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈AGAGCACAGUUUCGAGGUGTT，反義鏈CACCUCGAAACUGUGCUCUTT。
7.如權利要求2所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈GGUUUUCGAUUGCUCCCAGTT，反義鏈CUGGGAGCAAUCGAAAACCTT。
8.如權利要求2所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈GAGGAGGCUGAGGAUCCUGTT，反義鏈CAGGAUCCUCAGCCUCCUCTT。
9.如權利要求2所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，核苷酸序列(I)為正義鏈GAUCACCCUCCUUAAAUAUTT，反義鏈AUAUUUAAGGAGGGUGAUCTT。
10.權利要求1至9中的任一所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，所述同源度以80％以上為佳。
11.權利要求1至9中的任一所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)的任何部份或全部經化學修飾後所形成的的小幹擾核糖核酸分子。
12.如權利要求11中所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，所述化學修飾包括對連接核苷酸的磷酸二酯鍵的部份修飾或用其它任何化學鍵取代。
13如權利要求11中所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)，所述化學修飾包括對這些SiRNA分子側鏈上核糖的2位上的OH作任何化學的修飾和改變，和鹼基上任何位置作化學修飾或改變。
14.權利要求1至9中的任一所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)在製備治療抗腫瘤與腫瘤相關的任何疾病的藥物中的應用。
15.如權利要求10所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)在製備治療抗腫瘤、腫瘤相關的任何疾病、與PLK1表達增加相關的任何疾病的藥物中的應用。
16.如權利要求11所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)在製備治療抗腫瘤、與腫瘤相關的任何疾病、與PLK1表達增加相關的任何疾病的藥物中的應用。
17.如權利要求12所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)在製備治療抗腫瘤、與腫瘤相關的任何疾病、與PLK1表達增加相關的任何疾病的藥物中的應用。
18.如權利要求13所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)在製備治療抗腫瘤、與腫瘤相關的任何疾病、與PLK1表達增加相關的任何疾病的藥物中的應用。
19.一種有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特徵在於它為與權利要求2所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與權利要求5所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與權利要求9所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子中任意兩種以上任意配比的混合物。
20.如權利要求19所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特徵在於它為與權利要求2所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與權利要求5所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與權利要求9所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子以任意配比混合而成的混合物。
21.如權利要求20所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特徵在於與權利要求2所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與權利要求5所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子、與權利要求9所述的小幹擾核糖核酸分子同源度70％以上的小幹擾核糖核酸分子，它們之間以以下的摩爾比為佳(20-80)∶(20-80)∶(20-80)。
22.如權利要求19所述的有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1 mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)的混合物，其特徵在於所述同源度以80％以上為佳。
全文摘要
本發明提供了有效殺傷腫瘤細胞的針對PLK1mRNA的小幹擾核糖核酸分子(SiRNA)。它為雙鏈RNA分子並且其核苷酸序列與具有以下特徵的核苷酸序列(I)至少70％的同源度正義鏈和反義鏈的長度均為21個核苷酸，正義鏈和反義鏈各自的3′端為兩個連續的脫氧胸苷酸(TT)，兩條鏈除去3′端的TT以外的19個核苷酸上的鹼基互補形成雙鏈，正義鏈自5′端開始的19個核苷酸序列和序列表第1號序列中連續兩個鹼基為腺嘌呤(A)的核苷酸之後的19個核苷酸序列完全一致，每條鏈中的鹼基為鳥嘌呤(G)的核苷酸數量與鹼基為胞嘧啶(C)的核苷酸數量之和佔除去3′端的TT以外的19個核苷酸數量的比例為大於25％小於75％(即G/C比例)。
文檔編號C07H21/00GK1651450SQ20031011678
公開日2005年8月10日 申請日期2003年11月21日 優先權日2003年11月21日
發明者丁佳逸 申請人:杭州新瑞佳生物醫藥技術開發有限公司