用於產生香茅醛的方法

2023-09-18 20:32:35 1

專利名稱：：用於產生香茅醛的方法用於產生香茅醛的方法檸檬醛是抗微生物的闢，它賦予植物植物如檸檬草(lemongrass)和澳洲檸檬桃金孃(Australianlemonmyrtle)特徵性檸檬香氣。它還可便利地作為工業中間體例如在維生素A和E的合成中獲得。已經報導通過還原或氧化醛基[l]、偶姻形成[2和裂合酶活性[1，3而對檸檬醛的幾種生物轉化。本研究的目的是篩選使檸檬醛中oc，p-不飽和碳鍵還原以產生手性產物香茅醛的酶活性(圖1)。檸檬醛是反式異構體香葉醛與順式異構體橙花醛的混合物，然而對這兩種異構體中任一異構體的底物專一性可能不是重要的，因為胺基酸可以催化異構化[41。產物(R)-(+)-香茅醛的有價值用途是經Prins反應而後繼環合至異蒲勒醇，隨後7K合成(lR,2S，5R)-(-)-薄荷醇[5]。非生物學策略因它們受限的立體選擇性(檸檬醛具有三個雙鍵)和對映選擇性而仍受到挑戰[6(見圖1)。使其它a，P-不飽和羰基的碳雙鍵還原的酶已經在文獻中報導。它們主要屬於黃素和NADPH依賴性還原酶的"老黃酶(oldyellowenzyme)"家族，這由Williams和Bruce[7在可能的生物技術應用方面綜述。另一個實例是來自紅平紅球菌(Rhodococcuserythropolis)的香芽酮還原酶，該酶使用未鑑定的熱穩定輔因子並且不依賴於添加的NADH或NADPH[8。為檢測檸檬醛至香茅醛的生物轉化，相應酶必須有活性，還原用電子必須可獲得，非常的疏水性底物檸檬醛必須以足夠的濃度接觸酶並且香茅醛形成必須比任何後續的轉化更快。因此，開發了篩選策略以試驗用於檸檬醛轉化的多種微生物。本發明的第一個實施方案是用於通過以所選擇的來自發酵單孢菌屬(Zymomonas)、檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)、假絲酵母屬(Candida)、酵母屬(Saccharomyces)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、假絲酵母屬(Candida)、伊薩酵母屬(Issatchenkia)、根黴屬(Rhiz叩us)的還原酶酶促還原檸檬醛而產生光學活性香茅醛的方法，其中還原在兩相液體系統中完成。該方法的優選實施方案使用所選擇的來自運動發酵單孢菌(Zymomonasmobilis)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、皺落假絲酵母(Candidarugosa)、貝酵母(Saccharomycesbayanus)、酉良酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、產脫假絲酵母(Candidautilis)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、爪唾根黴(Rhizopusjavanicus)的還原酶。以上提及的微生物是本領域眾所周知的並且可以通過已知方法分離或來自公共保藏中心如ATCC和DSMZ。運動發酵單孢菌已經尤其作為ATCC10998、ATCC29192、ATCC31821、ATCC35001、ATCC39985保藏。弗氏檸檬酸桿菌已經尤其作為ATCC8090D、ATCC11811保藏。皺落假絲酵母已經尤其作為DSM70761保藏。東方伊薩酵母已經尤其作為DSM3433、DSM6128、DSM11956、DSM70075、70079保藏。還原酶可以分離或純化的形式或作為"全細胞酶(whole-cell-enzyme)"使用，其中所述的"全細胞酶"應當意指酶與微生物一起用於本發明的方法。微生物也可以受到透化以改善底物、產物、輔因子轉移入和轉移出細胞。術語"還原酶"應當不僅意指分離的酶，還意指包含酶的提取物、溶液或混懸液、其中酶已被固定的載體和含有酶的全細胞。本發明的改良實施方案是利用因檸檬醛的同時還原而氧化的輔因子。作為輔因子，可以在本發明方法的條件下氧化的每種物質都是合適的。優選的輔因子系統是可以在等摩爾或甚至更高的量上使用或可以通過已知系統如電化學方法或酶再生系統如葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進行再生的NADH或NADPH。若再生輔因子，則在該方法中優選低於等摩爾的量。兩相液體系統意指含有相互不較大程度地混合的兩種液相的系統。優選其中一種相含有有^L液體而第二相含有水或基於水的溶劑的兩相液體系統。更優選其中有機相由醚如乙醚、曱基叔丁基醚(MTBE)或芳香烴如苯和曱苯構成的兩相液體系統。作為第二液相，優選緩衝的水溶液。本發明研究了用於立體專一性和對映專一性地將闢類檸檬醛(異構體香葉醛和橙花醛)的a,p-不飽和碳鍵還原成香茅醛的生物學策略。46種原核和真核微生物的常規含水篩選表明僅革蘭氏陰性細菌運動發酵單孢菌能夠形成香茅醛。這種含水系統的缺點是底物檸檬醛在含水介質中的低溶解度。在具有運動發酵單孢菌細胞的兩相生物轉化系統中，形成了比未添加有機溶劑的系統中高至多到10倍濃度的香茅醛。最佳結果用有機溶劑甲苯、甲基叔丁基醚(MTBE)、異戊醇和二乙醚實現。有機介質在使用全細胞的生物催化反應中提供幾種優勢[91。一個益處是底物和/或產物溶解度提高。有機相提供底物在反應中高的總濃度並同時維持7K相中有毒或抑制性化合物的低水平。使細胞透化是有機溶劑的另一益處。除了"凍融"循環之外，還使用有機溶劑如甲苯用於透化已經報導用於多種生物，例如克魯維酵母[10和運動發酵單孢菌[11，引起經細胞膜的被動流動(passiveilux)增加。EDTA的存在可以導致外膜透性的顯著提高，如對大腸桿菌所示[12。使用20。/。v/v甲苯或MTBE作為有機溶劑，46個菌林中先前檢驗呈陰性的IO林菌林證明是陽性的。與含水系統相比，本方法代表在篩選用於將檸檬醛生物轉化成香茅醛的潛在微生物上成功得多的策略。最高的產物濃度在原核菌抹運動發酵單孢菌和弗氏檸檬酸桿菌獲得，分別具有(S)-對映體>99%和75%的對映體過量值(6.6.)。與之相對，真核菌林顯示相反的對映專一性，鈹落假絲酵母、貝酵母和釀酒酵母分別具有(R)對映體大於98%、97%和96%的e.e.值。在使用全細胞的生物轉化中遭遇的一個問題是因細胞內眾多催化劑所致的副產物形成。有趣的是，用運動發酵單孢菌進行試驗的大部分有機溶劑引起醇副產物香葉醇、橙花醇和香茅醇整體減少。類似地EDTA對原核菌林和真核菌抹均減少醇的形成並且在大多數情況下提高香茅醛濃度。這些在產物和副產物形成上的相反作用可能提示對檸檬醛中醛基的還原和碳雙鍵的還原由不同酶催化。對a，p-不飽和羰基中雙鍵的酶還原已經描述。尤其"老黃酶(OYE)"家族的氧化還原酶即在酵母、植物和細菌中常見的黃素依賴性酶[13接受種類龐大的a，p-不飽和醛和酮[7、14、15]。然而，沒有報導由OYE對檸檬醛的轉化。進行了酵母OYEl、2和3蛋白質序列針對最近公開的運動發酵單孢菌ZM4基因組中翻譯讀碼框的BLASTP(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索[16。觀察到與具有未知功能的推定NADH:黃素氧化還原酶(ZM01885)的最密切相似性。然而，對酵母OYE的胺基酸相似性小於50%。香茅醛形成是否與OYE家族的酶相關仍然未知，並且需要過量表達相應的基因以便開發高產量的生物方法。實驗微生物培養20林酵母菌抹、9林絲狀真菌菌林和17祙細菌菌林從新南威爾斯大學培養物收集中心(世界培養物收集編號248)得到。酵母菌抹、絲狀真菌和細菌運動發酵單孢菌和掌形發酵單孢菌(Zymobacterpalmae)在YPG培養基(3g/1酵母提取物，5g/1蛋白腖，10g/lD-葡萄糖，pH6.9)中培育。乳酸細菌在來自Oxoid的MRS(deMan，Rogosa，Sharpe)肉湯(pH6.2)中培育。來自Oxoid的營養肉湯(pH7.4)用於全部其它細菌。對於檸檬色動性球菌(Planococcuscitreus)和哈維氏弧菌(Vibrioharveyi),營養肉湯中補充以3%[w/vNaCl。生長溫度是30。C或37。C，這取決於哪個溫度更接近已報導的最佳生長溫度。培養物在定軌搖床中於150轉/分鐘攪拌，除乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)和費氏丙酸桿菌(Propionibacteriumfreimdenreichii)的非攪拌培養之外。全部培養物培育至穩定期。為了產生透化細胞，生物質在緩沖液(50mMMOPS/KOHpH7)中洗滌兩次並重懸於一半體積的緩衝液(對酵母和絲狀真菌而言)或四分之一體積的緩衝液(對細菌培養物而言)中。使用液氮和25。C水浴，將混懸液凍融三次並且隨後以等分試樣在-20。C貯存。在含水系統中的培養物篩選檸檬醛(5mM)以異丙醇中0.2M溶液的形式添加。2.5。/。[v/v異丙醇發揮兩種功能增加疏水性底物檸檬醛的溶解度並且作為胞內醇脫氫酶的底物潛在發揮作用以再生NAD(P)H。每種培養物進行三個實驗。活性測定(用於確定檸檬醛還原酶活性的GC測定)方法500^1才羊品或水(空白)100pllM磷酸鉀，pH7.0100pllM葡萄糖溶液100jul溶液，在每一情況下具有10MNADPH/NADH100pl葡萄糖脫氫酶大腸桿菌細胞混懸液25fil在DMSO中的10%順/反式檸檬醛溫育在35°C至少15小時，劇烈搖動提取向每個樣品添加250jil氯仿並充分攪拌至少5分鐘。隨後離心3分鐘。將下層有機相取出並在4A分子篩上乾燥，轉移至帶微量襯管(microinset)的HPLC小玻璃瓶中，通過GC進行測量。純化酶(通過對面積比較而估計)的e.e.值超過98%。a.培養基中的全細胞添加5mL新鮮培養基至溫度不變的5niL穩定期培養物，150轉/分鐘攪拌1小時並且隨後添加在異丙醇中的檸檬醛。在3小時後及在24小時後，1ml肉湯以0.2ml新鮮製備的在氯仿中的0.30/。[v/vl-辛醇(GC內標)溶液提取。回收有機相，用異丙醇稀釋並通過GC進行分析。b.透化的細胞+NADH在定軌搖床上於150轉/分鐘並在30°C振搖的2ml螺口蓋小玻璃瓶含有在1ml總體積中的0.5ml融化的透化細胞，其中所述總體積中具有終濃度50mMpH7的MOPS緩沖液、10mMNADH,5mM檸檬醛和2.5%[v/v異丙醇。在3小時後，全部樣品用如上文的氯仿/辛醇提取。c.透化的細胞+NADPH再生系統方法與b中所述相同，除了NADH由具有終濃度1.5mMNADP+、10mM葡萄糖-6-磷酸、3.3mMMgCl2和0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的NADPH再生系統替換之外。在兩相系統中的培養物篩選在生物轉化之前，0.5mL透化細胞與0.15ml曱苯在2ml螺旋蓋玻璃小瓶中渦旋混合併且在室溫溫育10分鐘。隨後添加其它組分以產生具有如含7JC/NADPH系統那樣相同組成的1mL水相，僅無檸檬醛和異丙醇。反應通過添加0.05mL在甲苯中的0.4M檸檬醛而啟動並且將小瓶在30。C在輪上垂直轉動。在3小時後，全部樣品用0.4ml新鮮製備的在氯仿中的0.15。/。v/vl-辛醇(GC內標)提取。在離心後，取出0.4mL下層有機相(曱苯/氯仿混合物)用於GC分析。將形成香茅醛的菌林如下文詳述在曱苯和曱基叔丁基醚(MTBE)兩相系統中進行比較。生物轉化圖2-4中所示的生物轉化如對兩相培養物篩選那樣實施，但是用4ml螺旋蓋玻璃小瓶中的0.8ml水相和0.2ml有機溶劑，以磁力方式攪拌以維持有機溶劑在水相中的乳液。組成和條件的細節在分別的中給出。在啟動反應前，以定義的生物質濃度的0.5mL已洗滌細胞與0.15mL分別的有機溶劑在冰上攪拌30分鐘。反應通過添加0.05mL在相同有機溶劑中的0.4M檸檬醛而啟動。分析方法薛類的濃度由4吏用毛細管柱(來自Varian的ChrompackCP-SIL5B，50Mx0.25mm，0.12jim相厚度)的氣相色譜(GC)確定，以氮氣作為載氣(0.98ml7分鐘)並且具有氫(20ml/分鐘)及空氣(300ml/分鐘)的火焰離子化檢測器(250。C)。注射體積是ljil，分流比29:1。注射溫度是250°C並且柱溫度在100°C維持9分鐘並隨後以50。C/分鐘提高至240°C。使用1-辛醇作為內標，萜濃度基於已經接受如樣品那樣的相同提取方法處理的標準物進行計算。為分離香茅醛和異蒲勒醇，初始柱溫度是75。C持續12分鐘。橙花醇和香茅醇在任一先前條件下未得到分離。它們的分離以及手性分析用SupelcoBetaDex225柱(30mx0.25mm,0.25]iim相厚度)進行。分流比是1:35，柱流速是2.77ml/分鐘，柱溫度是95。C持續35分鐘，以5。C/分鐘增加至160°C。香茅醛通過從兩個GC柱中與香茅醛標準物共洗脫而鑑定。實施例1在含水系統中的培養物篩選對20林酵母菌抹、9林絲狀真菌菌林和17抹細菌菌林在三種含水系統中試驗檸檬醛轉化使用在培養基中的全細胞或者洗滌和透化的細胞以及NADH或NADPH。僅透化運動發酵單孢菌與NADPH才形成香茅醛。NADPH再生系統或NADPH的直接添加均支持香茅醛形成。香葉醇是在全細胞培養物中以及向透化細胞添加NADH或NADPH時眾多測試菌林的主要產物。也形成橙花醇和/或香茅醇。因此，用於還原醛基的酶活性與雙鍵還原所需的活性相竟爭。實施例2溶劑對由運動發酵單孢菌所致檸檬醛轉化的影響使用運動發酵單孢菌以試驗有機/水兩相系統將檸檬醛轉化成香茅醛的可行性。圖2a顯示在缺乏和存在多種水溶性(星號)和水不溶性溶劑時的香茅醛形成，其中所述的溶劑按官能性分類2種正烷、9種脂族醇、3種酮、2種酯、2種醚和3種芳族溶劑。與無任何有機溶劑的對照相比，4種溶劑即異戊醇、MTBE、二乙醚和甲苯支持高約IO倍的產物水平。作為額外優點，大部分溶劑引起副產物香葉醇、橙花醇和/或香茅醇的水平降低(圖2b)。對照實驗即對香葉醇、橙花醇及香茅醇標準物的提取證實相對於內標，它們的提取未受例如樣品中異丙醇、甲苯或MTBE存在的影響。因此下降的副產物水平可以歸因於酶還原醛基的減少。選擇甲苯和MTBE用於進一步的實驗。實施例3在兩相系統中的培養物篩選在水/甲苯篩選系統中，香茅醛由先前在含水篩選系統中未鑑定的幾個菌林自檸檬醛形成。為了比較，調節這些培養物至相似的生物質濃度，並且曱苯和MTBE兩相系統的香茅醛產生在圖3中顯示。在甲苯系統中，2林細菌菌林實現比9林真核菌林高至少5倍的香茅醛濃度。在MTBE系統中，弗氏檸檬酸桿菌形成比甲苯存在下更少的香茅醛。對東方伊薩酵母得到陽性結果，其中東方伊薩酵母在甲苯系統中不形成香茅醛。添加5mMEDTA對大部分菌林導致更高的香茅醛濃度，但是這對弗氏檸檬酸桿菌和絲狀真菌爪哇根黴產生相反作用(圖3b)。由運動發酵單孢菌形成的香茅醛不受EDTA影響。就MTBE/EDTA系統中的副產物形而言，酵母菌抹和細菌弗氏檸檬酸桿菌產生大部分香葉醇、一些橙花醇和少量香茅醇。尤其是，酵母屬菌林形成多達13mM香葉醇。省去EDTA則對酵母屬菌林增加醇副產物形成約10%，並且對運動發酵單孢菌增加甚至9倍。在任何實驗中未檢測到異蒲勒醇。產物香茅醛的對映體過量(e.e.)值列於表1。對運動發酵單孢菌而言，細菌酶優先形成6丄.值>99%的(8)-對映體，並且對弗氏檸檬酸桿菌而言，細菌酶優先形成6丄.值>75%的(8)-對映體。相反，酵母菌林主要產生(R)-香茅醛，例如皺落假絲酵母產生超過98%的e.e.值。表l:由多種菌林在含有5mMEDTA的7jC/MTBE兩相系統中所形成的香茅醛的對映體過量(圖3b)菌抹%e.e.對映體運動發酵單孢菌>99(s)-弗氏檸檬酸桿菌75(s)-皺落假絲酵母>98(R)-貝酵母>97(R)-釀酒酵母>96(R)-馬克斯克魯維酵母>95(R)-產朊假絲酵母>94(R)-東方伊薩酵母64(R)-爪哇根黴_>94(R)-檸檬醛生物轉化曲線圖4顯示在水/曱苯及在7K/MTBE兩相系統中由運動發酵單孢菌所致檸檬醛生物轉化的曲線。對前者而言，香茅醛濃度的增加以極為線性的方式繼續進行3小時時間。當NADPH再生系統的濃度加倍時，實現相同的香茅醛終濃度。這表明該反應不受NADPH再生系統限制。兩種檸檬醛異構體即香葉醛及橙花醛的濃度均隨時間降低。未檢測到醇即橙花醇、香葉醇和香茅醇。對於水/MTBE兩相系統，觀察到香茅醛形成隨時間變慢，儘管兩種檸檬醛異構體即香葉醛和橙花醛均隨時間以線性方式消耗。就醇副產物而言，形成0.34mM的香葉醇和小於0.1mM的香茅醇。3小時後的摩爾平衡表明初始底物在甲苯系統中丟失16%，並且在MTBE系統中丟失10%。在比較時，沒有生物質的對照經3小時未顯示檸檬醛或香茅醛的丟失。然而，具有煮沸的生物質的對照以如生物轉化中觀察到的相似程度丟失檸檬醛和香茅醛。實施例4自運動發酵單孢菌分離和表徵還原酶運動發酵單孢菌的培養細胞在由以下組成的培養基中培育細菌用蛋白腖10gA酵母提取物10g/1葡萄糖*112020g/1KH2P041g/1(NH4)2S041g/1MgS04*7H200.5g/1pH7.0;滅菌121。C20分鐘。為此目的，在每一情況下將800mL培養基導入lL錐形燒瓶(無擋板)並在100轉/分鐘和30。C溫育至少48小時(通常約65-72小時)。由離心去除輕微混濁(slightclouding)。生物質產量低(約2.0-2.5g/1溼生物質)。蛋白質的純化勻漿化106g溼生物質重懸於500mL破裂緩沖液(20mMTris/HCl，2mMEDTA，10片/L全蛋白酶抑制劑，pH8.0)中，並且pH用NaOH從pH6.6校正至7.5。混懸液的100mL等分試樣與100mL玻璃珠(直徑0.1-0.2mm)混合併且在球磨中以5000轉/分鐘破裂12分鐘。玻璃珠經Gl玻璃抽吸濾器以抽吸作用除去並且洗滌。濾液(710ml)於12000轉/分鐘(Sorva11，4。C)離心30分鐘。上清液(610ml，18.6mg/ml蛋白質，pH7.4,電導率2.6mS/cm)分成3個200ml等分試樣並在-20。C貯存。離子交換層析(Q-SepharoseFF)將勻漿物施加(15ml/分鐘)至Q-SepharoseFF層析柱(直徑5cm,體積400ml)上，以20mMTris/HCl,pH8.0，2mMEDTA,2片全蛋白酶抑制劑/L(緩衝液A)預洗滌。為此目的，將融化的粗製勻漿物用緩衝液A稀釋成500ml(電導率1.6mS/cm,pH8.0)。在上樣後，柱用1000mL緩衝液A洗滌(15ml/分鐘)。隨後用線性梯M開至100%緩衝液B(具有0.5MNaCl的緩衝液A，pH8.0)(1500ml)。隨後將又一個750mL100%B用於洗滌。在每一情況下，將10個12ml級分合併並進行測試。疏水層析(TSK-Phenyl)來自Q-S印harose柱的目的級分用於上樣(142ml，pH7.0，用32.2g石克酸銨調節至40%飽和度；500mg蛋白質)。來自Pharmacia的苯基-Sepharose柱具有2.6cm直徑，體積170ml,並且以每分鐘10ml運行。該柱用緩衝液A:40%硫酸銨飽和度，2mMEDTA，2片全蛋白酶抑制劑/L,20mM磷酸二氫鈉pH7.0)平衡。在上樣後，柱用緩衝液A洗滌直至達到吸光度基線。隨後用線性梯度展開至100%緩衝液B(無硫酸銨的緩衝液A，3個柱體積)。在結束時，柱用2.5個柱體積的緩衝液C(具有20。/。異丙醇的緩沖液B)洗脫。在每一情況下，將10個級分合併且測定活性。收集第61至70級分(92ml)。分子篩層析(Superdex)來自苯基Sepharose柱的目的級分(卯ml)用46.4g硫酸銨(80。/。飽和度)沉澱並且通過離心取出沉澱。將沉澱在運行緩衝液(20mM磷酸鈉，pH6.8,1片全蛋白酶抑制劑/L，1mMEDTA)(9ml)中重懸並施加至Superdex柱(4ml/分鐘，2分鐘級分)。收集活性級分27和28。使用以上全部方法，對所有三份勻漿物均進行處理。得到含有總計18.8mg蛋白質的67mL目的級分。親和層4斤(BIueSepharoseFF)藍色SepharoseFF柱(直徑2.6cm，50ml，Pharmacia)在20mM磷酸二氫鈉pH6.8，l片全蛋白酶抑制劑/L，lmMEDTA中平衡。來自分子篩層析的合併目的級分以3ml流量施加。柱隨後用150mL的相同緩沖液洗滌並隨後用添加0,5MNaCl的該緩衝液(130ml)洗滌。使用第二洗滌緩衝液實施洗脫，其中向第二洗滌緩衝液在每一情況下還已經添加1mMNADH和NADPH。在用該緩衝液洗脫之前，將柱在所述緩沖液中溫育16小時。收集活性級分。蛋白質在所選擇條件下不與藍色Sepharose結合。然而，其它蛋白質以如此方式除去，導致成功的純化。親和層析(4-羥基苯曱酸親和柱)親和柱的製備50mL氨基己酸Sepharose用5L水洗滌。濾餅重懸於40mL水中。4.2g的4-乙酸基苯曱酸(受保護的羥基苯甲酸)溶解於50mlDMF中並調節至pH4.7(10MNaOH)。將3.9gEDC溶解於10mL水中並且在15分鐘內添加至偶聯混合物中。將pH用HC1維持在4.7。添加另一份50mlDMF並且將混合物在室溫攪拌16小時。柱材料以抽吸作用經G2玻璃抽吸濾器去除，並且用1L50。/。水/DMF溶液洗塗。隨後，用1L水洗滌。柱材料隨後重懸於200mlNaHC03冷溶液中並且添加2mL乙酸酐。在冰上實施脫保護卯分鐘，強烈產生co2。反應溶液以抽吸作用除去並且柱材料用水洗滌。隨後，將柱材料在1M咪唑溶液pH7.9中攪拌1小時，隨後再次以抽吸作用取出並且用水洗滌，並且也在這種狀態下貯存。蛋白質也不與該柱結合。Mono-Q層析Mono-Q層析柱(lmlPharmacia)用20mM磷酸鈉，pH7.5，1片全蛋白酶抑制劑/L，1mMEDTA進行平衡。(1ml/分鐘)施加130mL來自藍色Sepharose柱的流通物(pH7.5,2.7mS/cm)。柱隨後用相同緩沖液洗滌。這裡，蛋白質再次在上樣期間被洗脫，而雜質與柱結合。疏7K層析(Resource-Phenylsepharose，FPLC)1mlResource柱(Amersham)用20mM磷酸鈉，pH7.0，2片全蛋白酶抑制劑/L，2mMEDTA,40%石克酸銨飽和度進行平衡。來自Mono-Q-Sepharose柱的140mL流通物(pH7.5，2.7mS/cm)用31.6g硫酸銨調節至40%飽和度並施加(160ml,1ml/分鐘)。柱隨後用相同緩沖液洗滌。柱使用線性梯度展開至不含硫酸銨的相同緩衝液。收集活性級分並將其通過SDS凝膠電泳展開(圖1)。條帶在40kDa處並進行氨基端測序。在下表2中總結了純化。表2tableseeoriginaldocumentpage15氨基端測序得到下列氨基端序列PSLFDPIRFGAFTAKNRIWMAPLTRGR以這個已鑑定的氨基端肽在運動發酵單孢菌公開的基因組(SeoJ.S等，"生乙醇細菌運動發酵單孢菌ZM4的基因組序列"，Nat.Biotechnol.23:63-68(2005)，EMBLAE008692)中進行的計算機搜索鑑定該蛋白質是具有358個胺基酸和39489道爾頓分子量的NADH黃素氧化還原酶(EMBLAE008692,AAV90509.1，原始登錄號Q5NLA1.)。參考文獻[1W.A.M.Wolken,M.J.vanderWerf,Appl.Microbiol.Biotechnol.57(2001)731.[2B.Stumpf，K.Kieslich,Appl.Microbiol.Biotechnol.34(1991)598.[3W.A.M.Wolken,W.J.V.VanLoo，J,Tramper,M.J.vanderWerf，Eur.J.Biochem.269(2002)5卯3.[4W.A.M.Wolken，R.tenHave,M.J.vanderWerf,J.Agric.食物Chem.48(2000)5401.[5A.F.Trasarti，A.J.Marchi,C.R.Apesteguia，J.Catal.224(2004)484.[6P.MSki畫Arvela，N.Kumar,D.Kubicka，A.Nasir，T.Heikkim，V.P.Lehto，R.Sjoholm,T.Salmi，D.Y.Murzin，J.Mol.Cat.A:CheM240(2005)72.[7R.E.Williams,N.C.Bruce,Microbiology148(2002)1607.8M.J.vanderWerf，A.M.Boot,Microbiology146(2000)1129.[9R.Le6n，P.Fernandes，H.M.Pinheiro,J.M.S.Cabral，EnzymeMicrob.Technol.23(1998)483.[10M.Decleire,W.DeCat,N.VanHuynh，EnzymeMicrob.Technol.9(1987)300.[11U.H.Chun,P丄.Rogers,Appl.Microbiol.Biotechnol.29(1988)19.[12H.J.P.Marvin,M.B.A.TerBeest，B.Witholt，J.Bacteriol.171(1989)5262.[13K.Kitzing,T.B.Fitzpatrick,C.Wilken，J.Sawa，G.P.Bourenkov，P.Macheroux，T.Clausen,J.Biol.Chem.280(2005)27904.[14A.D.N.Vaz，S.Chakraborty，V.Massey，Biochemistry34(1995)4246.[15K.Stott,K.Saito，D.J.Thiele，V.Massey，268(1993)6097.[16J.S.Seo，H.Chong，H.S.Park,K.O.Yoon,C.Jung,J.J.Kim，J.H.Hong，H.Kim,J.H.Kim，J丄Kil，C.J.Park,H.M.Oh，J.S.Lee，S.J.Jin，H.W.Urn,H.J.Lee,S.J.Oh，J.Y.Kim，H.L.Kang，S.Y.Lee，K.J.Lee，H爭S.Kang，NatureBiotechnol.23(2005)63.附圖描述圖l:種檬醛(香葉醛和橙花醛)至香茅醛的生物轉化圖2:由運動發酵單孢菌細胞在NADPH再生系統和多種溶劑存在下對檸檬醛的生物轉化a)產物香茅醛；b)副產物香葉醇、橙花醇和香茅醇的總和。初始條件20y。v/v有機溶劑，20mM檸檬醛，5mM二硫蘇糖醇，3.3mMMgCl2，1.5mMNADP+,10mM葡萄糖-6-磷酸，0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氬酶，約14g/1DCM運動發酵單孢菌，50mMMOPS/KOH,pH7.0，在30。C持續3小時。*以星號標記的溶劑溶解於水中，全部其它溶劑形成乳液。MTBE-甲基叔丁基醚，nd-未檢測到。AU—壬意單位化合物的GC面積除以內標的GC面積。給出三個重複的平均值和誤差條表示最高結果和最低結果。對於曱苯，面積比對應於1.4mM香茅醛的濃度。圖3:在a)水/甲苯兩相系統和b)水/甲基^L丁基醚(MTBE)兩相系統中由細菌、酵母和絲狀真菌所形成的香茅醛的比較(在30。C溫育3小時，組成如圖2中所示，生物質濃度約12gDCM/1)。給出兩個重複的平均值和誤差條表示最高結果和最低結果。nd-未檢測到。圖4:由運動發酵單孢菌在具有NADPH再生系統的a)水/曱苯和b)水/曱基^又丁基醚(MTBE)兩相系統(30。C，組成如圖2中所示，生物質濃度約14gDCM/l)中所致的檸檬醛生物轉化。給出三個重複的平均值和誤差條表示最高結果和最4氐結果。權利要求1.使用所選擇的來自如下屬和種的還原酶通過酶促還原檸檬醛而產生光學活性香茅醛的方法運動發酵單孢菌(Zymomonasmobilis)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundii)、皺落假絲酵母(Candidarugosa)、貝酵母(Saccharomycesbayanus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、馬克斯克魯維酵母(Kluyveromycesmarxianus)、產朊假絲酵母(Candidautilis)、東方伊薩酵母(Issatchenkiaorientalis)、爪哇根黴(Rhizopusjavanicus)，其中還原反應是在兩相液體系統中完成的。2.根據權利要求1所述的方法，其中(S)-香茅醛通過所選擇的來自運動發酵單孢菌、弗氏檸檬酸桿菌的酶產生。3.根據權利要求l所述的方法，其中(R)-香茅醛通過所選擇的來自皺落假絲酵母、貝酵母、釀酒酵母、馬克斯克魯維酵母、產朊假絲酵母、東方伊薩酵母、爪哇根黴的酶產生。4.根據權利要求1所述的方法，其中酶是所選擇的來自圖5中所示的酶。5.根據權利要求1所述的方法，其中兩相液體系統由MTBE和水形成。6.根據權利要求5所述的方法，其中使用緩沖水溶液作為兩相液體系統的一個相。7.根據權利要求1所述的方法，其中還原酶偶聯至NADPH再生系統。全文摘要本發明涉及使用來自運動發酵單孢菌(Zymomonasmobilis)的還原酶酶促還原檸檬醛而產生光學活性香茅醛的方法。文檔編號C12P7/24GK101415831SQ200680043009公開日2009年4月22日申請日期2006年11月10日優先權日2005年11月17日發明者A·米勒,B·羅舍,B·豪爾,R·施蒂默爾,T·弗裡德裡希申請人:巴斯夫歐洲公司