一種綴合疫苗及其製備方法

2023-09-18 14:47:25 1

一種綴合疫苗及其製備方法
【專利摘要】本發明公開了一種綴合疫苗，該綴合疫苗為多價肺炎球菌多糖與兩種或兩種以上的載體蛋白經連接體而成的綴合疫苗，其中，連接體為磁性納米微球。該綴合疫苗的製備方法將多價肺炎球菌多糖與兩種或以上的載體蛋白分別與磁性納米微球經偶聯而成。本發明提供的綴合疫苗製備工藝簡單，採用磁性納米微球為連接物的綴合疫苗能夠增強小鼠Th1型免疫應答，以及多糖特異性抗體的免疫持效性、特異性和親和性，此外還可誘導小鼠產生輪狀病毒抗體；具備兩種疫苗的預防效果；因此具有十分廣闊的應用前景。
【專利說明】一種綴合疫苗及其製備方法

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種疫苗，具體說，是涉及一種綴合疫苗疫苗及其製備方法，屬於生物

【技術領域】。

【背景技術】
[0002] -、微生物對人體的危害及應對措施
[0003] 微生物通常是指那些個體體積直徑一般小於Imm的生物群體，它們結構簡單，大 多是單細胞，還有些甚至連細胞結構也沒有，我們身邊無時無刻不存在著微生物，通常會借 助顯微鏡或者電子顯微鏡才能看清它們的形態和結構；其中，致病微生物是指能夠引起人 類、動物和植物的病害，具有致病性的微生物。一種病原體的致病性有賴於它的侵襲宿主並 在體內繁殖和抵禦宿主抵抗力而不被其消滅的能力。微生物致病性有種屬特徵，致病能力 強弱的程度稱為毒力。感染性疾病的成立並非由微生物的毒力單方面決定，還要視宿主的 健康情況與免疫功能狀態。一般而言，毒力強的微生物感染未曾免疫過的機體，能引起病理 損害出現顯性感染等，而正常機體卻能抵抗許多低毒微生物（如條件致病菌）的損害，但當 宿主抵抗力降低時則可對這些微生物易感而致病。病原體的毒力與宿主抵抗力兩者之間的 較量，引出感染性疾病的發生、發展、轉歸和預後，由於病原體和宿主之間適應程度不同，雙 方抗衡的結局各異，產生各種不同的感染譜，即感染過程的不同表現。致病性是對特定宿主 而言，有的只對人類有致病性，有的只對某些動物，而有的則屬人畜共患性微生物。而此時 宿主通常只能通過自身的免疫系統來對抗微生物的感染，死亡率非常高，致使各研究學者 研究出了疫苗來對抗致病性微生物對人體的侵害。
[0004] 而疫苗又分為治療性和預防性兩種，通過治療性疫苗治療疾病，並通過預防性疫 苗保護人體不受致病性微生物的侵害。通過接種預防性疫苗來預防疾病是人類在一個多世 紀的臨床實踐中，證明是行之有效的手段。經過多年的努力，醫學界已經開發出各種不同的 疫苗用以預防，諸如細菌、病毒和真菌等，感染造成的各種疾病，極大地提高了人類的健康 水平。生物技術的不斷發展，促進了疫苗品種的多樣化。今天，用以預防病毒導致的傳染病 有滅活病毒技術開發出來的疫苗，如乙腦疫苗、脊髓灰質炎疫苗、流感疫苗等；用減毒病毒 技術開發出來的減毒活疫苗，如輪狀病毒疫苗、口服脊髓灰質炎病毒疫苗、麻疹病毒疫苗、 腮腺炎病毒疫苗、風疹病毒疫苗和水痘疫苗等。預防細菌性傳染病的有用蛋白和多糖等生 物大分子純化技術開發出來的細菌類疫苗，如破傷風類毒素、白喉類毒素、百日咳類毒素及 其亞細胞組分、流行性腦膜炎球菌多糖和23價肺炎球菌多糖等。用基因重組蛋白技術開發 出來的疫苗，如B肝表面抗原（預防B型肝炎）、人類乳頭狀類病毒顆粒病毒（預防子宮頸 癌）等。用半化學結合技術開發出來的預防腦膜炎和肺炎的細菌疫苗，如流行性嗜血桿菌 b型多糖-蛋白結合疫苗、7價或10價肺炎球菌多糖-蛋白結合疫苗以及4價腦膜炎球菌 多糖-蛋白結合疫苗。由此可見，醫學生物技術的發展，是疫苗產品不斷發展的原動力，通 過對生物技術的不斷改進，能夠開發出更多的新型疫苗產品來應付不同的傳染病對人類健 康的挑戰。
[0005] 二、結合疫苗概述
[0006] 多糖是病原菌中的一種重要免疫有效成分，有菌體多糖（OPS)和莢膜多糖（CPS) 之分。當病原體侵入機體後，它們作為免疫原，能刺激機體產生保護性免疫應答。但是，多 糖分子屬於T細胞不依賴性抗原（Ti-Ag)，免疫原性較弱，接種嬰幼兒後免疫效果尤其不 理想，而目前許多危害嚴重的疾病如流感嗜血桿菌（Hib)引起的腦膜炎、E. Coli 0157:H7 引起的小兒出血性腹瀉脫水等在嬰幼兒中高發且臨床無有效的治療辦法，病死率高（王燕 等，結合疫苗概述[J]，微生物學免疫學進展，2000, 28(1) :60-63)。為了提高多糖疫苗的 免疫原性，國外於本世紀20年代初興起了多糖和蛋白的化學結合疫苗，即綴合疫苗，結合 (以蛋白為載體的細菌多糖類）疫苗採用化學方法將多糖共價結合在蛋白載體上製備成多 糖-蛋白結合疫苗，用於提高細菌疫苗多糖抗原的免疫原性，如b型流感嗜血桿菌結合疫 苗、腦膜炎球菌結合疫苗和肺炎球菌結合疫苗等，短短幾十年其發展相當迅速，已取得顯著 成果。
[0007] 三、肺炎球菌的危害及其流行病學研究
[0008] 由肺炎球菌（肺鏈）所引起的感染是全世界發病率和死亡率的主要起因。肺炎、 發熱性菌血症和腦膜炎是侵入性肺炎球菌性疾病的最常見表現形式，而呼吸道內的細菌擴 散可導致中耳感染、竇炎或復發性支氣管炎。與侵入性疾病相比，非侵入性的表現形式通常 不那麼嚴重，但更多見。由於抗生素耐藥性傳染病的擴散，以及肺炎球菌肺炎經常在流感感 染之後出現，肺炎球菌疾病在流感期間發作的可能性進一步增加。
[0009] 由肺炎鏈球菌引發的疾病已成為全球一個重要的公共衛生問題。肺炎球菌已成為 全球兒童的頭號殺手。我國肺炎的病死率為16. 4%，其中50歲以上中老年人及1歲以下 嬰幼兒分別高達28. 6 %和22. 0%。我國肺炎球菌在健康兒童中的攜帶率較高，資料統計顯 示，在北方地區健康兒童中的攜帶率為24. 2%，南方地區為31. 3%。而所述病是導致5歲以 下兒童死亡的重要原因。主要原因在於嬰幼兒免疫系統的發育尚不完善，免疫力較弱。並 且年齡越小的嬰兒，免疫力越弱。肺炎球菌大約有90種血清型（菌株），我國的統計資料 顯示肺炎球菌感染菌株前幾個血清型依次為：5、6、19、23、14、2、4型。據一項收集了 860株 肺炎球菌分離株的研究顯示，有109株（12. 7% )表現為血清群6,在中國肺炎球菌血清型 6的紅黴素耐藥性達100%，其中的6A、6B和6C型分別為62株（56. 9%)、38株（34. 9% ) 和 9 株（8.2% )。
[0010] 從化學結構上來看，以上病原體擁有一個細胞表面莢膜多糖（Capsular polysaccharide, CPS)或脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)殼，或者兩者兼有，其功能是 幫助病原體感染宿主。莢膜多糖能夠屏蔽細菌細胞表面功能成分免於被宿主免疫系統識 另Ij，防止補體系統被細菌表面蛋白激活和免疫細胞吞噬，如果細菌被吞噬，莢膜多糖能夠防 止細菌被殺滅。大多數病原菌中，不同的菌株表達不同結構的莢膜多糖和脂多糖，產生多種 不同的血清型菌株。肺炎球菌所致的肺炎和腦膜炎是由已知的90種血清型中的很大一部 分菌株感染所導致的。
[0011] 由此可見，大多數細菌多糖類疫苗必需含有多種不同種類的細菌多糖以提高致病 菌株覆蓋率，優化和選擇包含何種細菌或者血清型多糖在疫苗中是一個非常複雜的流行病 學問題。一旦明確何種多糖抗體具有保護作用，則可用這種多糖作為免疫原來生產疫苗。
[0012] 中國生物技術集團成都生物製品研究所生產的23價肺炎球菌疫苗是選取了 23種 最常見的致病菌（1，2,3,4,5,6B，7F，8,9N，9V，10A，11A，12F，14,15B，17F，18C，19A，19F，20， 22F，23F，33F)，分別發酵培養並分離提純肺炎球菌莢膜上的各型多糖，按等比例混合製成 疫苗。細菌的多糖是一種胸腺非依賴性抗原，這種抗原與胸腺依賴性抗原的主要區別在於 前者不需要T淋巴細胞的輔助來產生抗體。臨床使用證明，莢膜多糖製作的疫苗明確有效， 並在多個國家廣泛使用。但是這類多糖疫苗存在以下問題：（1)在幼小動物或嬰幼兒體內 只能產生微弱的免疫反應，甚至不產生免疫反應，免疫反應隨年齡的增長而增強；（2)產生 低親和力的抗體；（3)只產生短暫的免疫反應，不具備反覆接種時的免疫記憶和免疫增強 效應；(4)容易產生免疫耐受；（5)普通的佐劑對這種抗原不易起到免疫增強的作用，23價 多糖疫苗對於侵入型肺鏈感染的保護率為50-70%，而且只能用於2歲以上的人群接種，而 肺炎的高峰發病年齡為6-12月齡；(6)具有重複結構的多糖是T細胞獨立型2類的免疫 原，沒有T細胞的參與，它們是無法誘導免疫記憶效應，刺激機體產生的抗體主要是IgM和 IgG2,不能夠有效地激活補體系統。
[0013] 半化學結合技術（也稱結合技術）開發疫苗的方法是從20世紀80年 代出現的開發細菌疫苗的技術。John Robbins通過將流行性嗜血桿菌b型 (Haemophilusinfluenzaetype b, Hib)莢膜多糖（Polyribosylribitolphosphate, PRP), 用共價鍵的形式連接到蛋白載體（破傷風類毒素）合成出了流行性嗜血桿菌b型多糖 PRP-破傷風類毒素結合疫苗（PRP-TT)，在免疫動物後，能夠產生殺菌的保護性抗體，從而 開創了新一代細菌疫苗開發技術。特別有意義的是，對於年齡小於2歲的嬰幼兒來說，由 於免疫系統發育不完善，多糖對於嬰幼兒是屬於一種非T細胞依賴性抗原，不能夠刺激機 體如成人一樣產生長效的針對於所述多糖來源的細菌特異性保護IgG抗體。因此，多糖對 於小於2歲的嬰幼兒是一種半抗原，不能夠作為疫苗來接種小於2歲的兒童。當將細菌多 糖以共價鍵的形式連接到蛋白載體，如破傷風類毒素 （Tetanus Toxoid，TT)，由於蛋白質是 一種T細胞依賴性抗原，能夠將共價鍵連接的多糖轉變成T細胞依賴性抗原，從而刺激機 體產生針對於所述多糖的特異性IgG抗體，保護機體不受細菌的感染。流行性嗜血桿菌b 型多糖-破傷風類毒素（PRP-TT)結合疫苗開發的成功，開創了一個開發細菌疫苗的技術 平臺，即將細菌多糖，如莢膜多糖、0-特異性多糖（O-specificpolysaccharide)、或寡聚糖 (Oligosaccharide),以共價鍵連接到蛋白載體上而製成的結合疫苗。基於這一概念的成 功，醫學生物研究界通過採用同一種化學合成方法開發出了不同細菌的結合疫苗；同樣也 用不同的合成技術開發出同一種細菌的結合疫苗。
[0014] 莢膜多糖能夠屏蔽細菌細胞表面功能成分，使其免於被宿主免疫系統識別，防止 補體系統被細菌表面的蛋白激活和免疫細胞吞噬。如果細菌被免疫細胞吞噬，莢膜多糖也 能夠避免細菌被殺滅。莢膜多糖是腦膜奈瑟氏菌的主要抗原成分之一，作為疫苗對較大的 兒童有一定的保護力。然而，莢膜多糖對2歲以下嬰幼兒、老年人以及B細胞免疫缺陷的人 群免疫效果差，接種劑不能達到抗體保護水平，且抗體很快消失。所述多糖疫苗與其它多糖 疫苗一樣，屬T細胞非依賴性抗原，具有年齡相關的免疫原性，且不誘生T細胞依賴性的加 強應答。通過將多糖與某種蛋白質共價結合，可使多糖轉化成T細胞依賴性抗原，從而刺激 嬰幼兒的T細胞依賴性抗體的合成，並可產生加強應答，同時還能提高免疫球蛋白（IgG)的 抗體比例。這種多糖結合疫苗不僅能夠保護嬰幼兒（2歲以下兒童），還能夠大大地增強抵 抗力差的病人對細菌感染的抵抗力，因此具有十分廣闊的應用前景。1980年，JohnRobbins 用溴化氰來隨機活化Hib莢膜多糖，然後，將己二醯二肼（Adipic Dihydrazide，ADH)作 為連接物（linker)加到活化的多糖上，最後以EDC法將衍化後的多糖共價鍵地連接到 載體蛋白破傷風類毒素上，合成出了流行性嗜血桿菌b型多糖-破傷風類毒素結合疫苗 (PRP-TT)。由於在每個多糖鏈上有多個活化點，蛋白載體上同樣的有多個連接點，形成的 結合物是一種多糖和蛋白交叉連接的大分子，平均分子量約為5X106Da。1980年，Harold Jennings在美國專利4356170裡，陳述了用牛血清蛋白（Bovine serum albumin，BSA)為 載體，將腦膜炎球菌的A，C群多糖通過還原胺法共價鍵地連接到BSA上，合成出了流行性腦 膜炎多糖-BAS結合疫苗。1987年和1990年，Porter Anderson分別在美國專利4673574 和4902506裡，描述了用變異無毒株白喉毒素197 (Cross reaction material subl97, CRM197)作為載體蛋白，以還原胺法合成了流行性嗜血桿菌b型寡聚糖-變異無毒株白喉毒 素197 (HbOC-CRM197)結合疫苗。具體的方法是用高碘酸鈉氧化Hib莢膜多糖，產生在兩末 端為醒基的寡聚糖，通過還原劑氰基硼氫化鈉（sodiumcyanoborohydride)，將寡聚糖共價 鍵連接到蛋白載體上。形成分子量約為90kDa的脂多糖結合物，製成了含有30%的多糖和 每一個蛋白上帶有6個糖分子的結合疫苗。隨後，美國默克（Merck, Sharpe and Dohme)以 巰基化學方法，用純化的奈瑟氏腦膜炎B群菌株（Neisseria meningitidis groups B)細菌 表面蛋白複合物（outer membrane protein complex，0MP)作為蛋白載體，合成出流行性嗜 血桿菌b型多糖-細菌表面蛋白複合物（PRP-OMP)結合疫苗。運用這些合成技術，先後開 發出了三種現已廣泛用於臨床接種的流行性嗜血桿菌b型結合疫苗，即PRP-TT、PRP-HbOC 和PRP-0MP。Hib結合疫苗的成功為開發其它細菌結合疫苗提供了理論和技術基礎，隨後的 開發進入了技術更為複雜的多價結合疫苗階段，其原因是某些傳染病，如肺炎球菌導致的 肺炎、流行性腦膜炎球菌所致的腦膜炎等，可由多種不同的血清型或菌株感染所致，並且各 血清型或菌株間由於細菌表面多糖的化學結構的不同，其抗體沒有交叉免疫反應，因此，接 種單一的血清型或菌株結合疫苗，無法保護被接種人體免於其它血清型或菌株的感染。由 於這個原因，合成和配製多價結合疫苗來擴大疫苗的保護覆蓋率成為開發的主要目標。
[0015] 通過多年的努力，用結合技術開發出了多種覆蓋率廣的多價結合疫苗。細菌莢膜 多糖-蛋白結合疫苗最早出現在20世紀30年代，Goebel和Avery將3型肺炎球菌多糖連 接到馬血清球蛋白上，產生的偶聯物能在動物身上產生多糖專一的抗體，同時提供相應的 免疫保護。1987年，世界上第一個多糖蛋白結合疫苗，B型流感嗜血桿菌（HiB)多糖-破傷 風類毒素（TT)結合疫苗被美國FDA批准進入市場。默克公司、輝瑞公司和諾華公司相繼開 發了 HiB多糖-破傷風類毒素結合疫苗和流行性腦膜炎多糖-破傷風類毒素結合疫苗，並 成功上市。2000年，美國惠氏（Wyeth)公司成功開發並上市了 7價肺炎球菌多糖-CRM197結 合疫苗，是由7個不同的肺炎球菌血清型多糖分別共價鍵連接到CRM197蛋白載體上，混合 配製而成的一種多價疫苗，用以預防小兒肺炎，所述7個血清型肺炎球菌涵蓋了北美和歐 洲90%以上流行的肺炎球菌不同血清型菌株。2006年，Sanofi Pasteur開發出了 4價腦膜 炎球菌多糖-破傷風類毒素結合疫苗，用於預防4種流行性腦膜炎球菌群，即A，C，Y，W135， 所致的腦膜炎。2009年，GlaxoSmithKline(GSK)也開發出了一種10價肺炎球菌多糖-蛋 白質結合疫苗，用以預防10種肺炎球菌血清型所導致的肺炎。所述疫苗運用了三種蛋白質 作為蛋白載體，其中最主要的載體是蛋白_D(Protein D，H))，有8個血清型多糖是用這個 蛋白作為載體。蛋白-D是用非可分型的流行性嗜血桿菌的基因重組方法表達出來的無酯 化表面蛋白，能夠刺激機體產生保護性抗體，有潛在的預防非可分型的流行性嗜血桿菌感 染所致的急性中耳炎，其他還有破傷風類毒素和白喉內毒素作為作為載體，被分別用作血 清型18C和19F的結合疫苗的蛋白載體。從以上結合疫苗產品的設計，可以看出，結合疫苗 的開發從單價疫苗過渡到技術上更為複雜的多價疫苗，提高了細菌疫苗的覆蓋率。
[0016] 多糖蛋白綴合疫苗（結合疫苗）是目前最先進的疫苗技術，在特異抗原上加上蛋 白質載體，可增加其免疫原性。蛋白質載體具有T細胞依賴特性，多糖蛋白綴合疫苗可將非 T細胞依賴性質的多糖抗原轉變為T細胞依賴性質的抗原，激發機體的T輔助細胞產生一 系列的免疫增強效應。莢膜多糖結合疫苗，在多糖上加蛋白載體，由非T細胞依賴性抗原變 為T細胞依賴性抗原，增加其免疫原性。結合疫苗接種後產生的抗體在質量和數量上是一 代疫苗的400-1000倍，產生免疫保護更廣更強，保護時間更長久，達到高效保護。2000年， 美國輝瑞公司第一個7價肺炎球菌結合疫苗上市；美國輝瑞公司開發嬰幼兒更有針對性的 7 (4、6B、9V、14、18C、19F和23F)價肺炎球菌蛋白疫苗，對5歲以下兒童也有效。莢膜多糖蛋 白結合疫苗，在多糖上加蛋白載體，由非T細胞依賴性抗原變為T細胞依賴性抗原，可增加 其免疫原性，可用於6周齡以上的兒童。目前輝瑞公司正在中國註冊13價結合疫苗，增加 了 6個血清型（1，3, 5, 7F，6A，19A)。但是我國的資料顯示肺炎球菌感染菌株血清型依次為： 5、6、1、19、23、14、2、4,輝瑞7價肺炎球菌結合疫苗對我國常見致病菌型覆蓋率只有50%左 右，而13價結合疫苗的覆蓋率也僅有70%。惠氏7價肺炎球菌結合疫苗需要接種4針劑， 每針860元，價格昂貴，不利於推廣。13價疫苗估計其價格將更為昂貴。因此美國輝瑞公司 的7和13價結合疫苗不太適合我國大範圍的兒童肺炎預防。
[0017] 儘管13價肺炎球菌結合疫苗已經上市，但是其中有幾個血清型的免疫效果相對 其他血清型較低，如3型。且隨著不同血清型的增加和同種載體蛋白的重複使用，使得載體 蛋白用量增多，其免疫原性反而降低。GlaxoSmithKline在開發10價肺炎球菌多糖結合疫 苗的設計中，選擇了蛋白-D為載體，其原因是基於二個方面的考慮。其一，是為了避免重複 使用已經作為百白破疫苗組分的破傷風類毒素和白喉類毒素作為載體。臨床試驗表明，當 多價肺炎結合疫苗與其他含有與蛋白載體相同組分的單價疫苗或多聯疫苗同時接種時，t匕 如Hib-TT、百白破-Hib多糖結合疫苗-IPV (滅活脊髓灰質炎疫苗）-B肝疫苗（簡稱6聯 疫苗），多價肺炎球菌結合疫苗中的大部分血清型多糖的免疫原性會受到抑制，特別是對用 破傷風類毒素作為載體的血清型多糖免疫原性影響尤其明顯。原因是多價肺炎球菌結合疫 苗中作為載體的破傷風類毒素和白喉類毒素總濃度過高，在同時接種含有百白破組分的聯 合疫苗時，如6聯疫苗，會造成所謂載體受體競爭性抑制效應，降低了結合疫苗多糖部分的 免疫原性。SanofiPasteur的11價肺炎球菌多糖-TT和DT混合載體蛋白結合疫苗和Merck 的7價肺炎球菌多糖-OMP結合疫苗（PCV-OMP)，都是臨床試驗結果不佳而導致產品開發失 敗的例子，原因就在與此。其二，是賦予蛋白載體以真正的保護性免疫原性功能。臨床試驗 證明蛋白-D能夠刺激機體產生保護性抗體，有潛在的預防非可分型流行性嗜血桿菌感染 造成的急性中耳炎。GlaxoSmithKline的10價肺炎球菌多糖結合疫苗選擇蛋白-D作為載 體，使得蛋白載體產生的抗體具有臨床意義的保護作用，是結合疫苗技術開發過程上的一 大進步。
[0018] 不過，非可分型的流行性嗜血桿菌實際臨床意義受到所述類細菌感染率低下的限 制，其感染導致的急性中耳炎發病率較低。但這些結合疫苗有一個共同點缺點，就是蛋白 載體沒有賦予免疫原性的保護功能，也就是說，儘管結合疫苗載體能夠刺激機體產生抗體， 但是，疫苗的設計者並沒有利用其抗體具有的保護性來預防傳染病，同時，也沒有確定其產 生的抗體是否達到保護性滴度水平。破傷風類毒素、白喉類毒素和白喉無毒變異株毒素等 傳統蛋白被選擇作為載體的主要原因，並不是因為它們的產生的抗體具有保護性，而是從 其安全性和能夠增強結合物中多糖的免疫原性來考慮。顯而易見，破傷風類毒素和白喉類 毒素已經是百白破三聯疫苗的二個組分，被常規接種；所以，結合疫苗中的破傷風類毒素和 白喉類毒素載體是否能夠刺激機體產生達到保護性抗體滴度並不重要，相反的，結合疫苗 中的多糖部分的抗體滴度才是疫苗設計者需要關注的主要問題。另外，一些正在開發中的 結合疫苗產品所用的載體，如E. coli所表達的基因缺失突變脫毒的重組銅綠假單胞菌外 毒素 A(rEPA)，E. coli所表達的基因缺失突變脫毒的重組霍亂毒素等也都是基於相同的考 量。
[0019] 新多糖結合疫苗的種類和型別在逐年增加，而可供選擇的載體蛋白種類較少，不 同疫苗重複使用載體蛋白較多。接種相同載體蛋白的不同結合疫苗可能會產生免疫抑制效 應，導致不同疫苗之間免疫效果的相互影響。而且，多糖結合物的主要載體蛋白如TT等，其 本身作為疫苗已大範圍接種嬰幼兒，人群體內原有的針對載體蛋白的高滴度特異性抗體可 能會抑制機體對結合疫苗中多糖的特異性免疫反應。
[0020] 中國專利（ZL02159032.X)公開了一種多糖-蛋白結合疫苗的製備方法，也是目前 製備多糖結合疫苗最常使用的技術之一。在所述技術中，以己二酸二醯肼（ADH)作為連接 劑結合多糖與蛋白。這種結合方式首先需要將多糖經溴化氰活化，即在鹼性條件下用溴化 氰作用於多糖分子上的羥基，形成氰酸酯，然後與ADH反應；氰酸酯中的一個碳氧鍵斷裂， 與ADH-端的氨基發生加成反應，從而將酯醯肼（AH)基團導入多糖分子，形成多糖-AH衍 生物；多糖-AH衍生物在碳二亞胺（EDAC)的介導下與載體蛋白形成穩定的結合物。這樣的 結合方式可減少多糖與載體蛋白結合的空間位阻，保留了多糖的抗原表位，同時避免了多 糖本身的溶解性，減少多糖與抗血清反應的副作用。
[0021] 然而，上述傳統的多糖-蛋白結合技術存在著以下不足之處：（1)多糖-AH衍生物 會繼續與溴化氰活化的多糖反應，形成多糖的自身聚合物，降低了多糖-蛋白的結合效率； (2)EDAC在介導ADH衍化多糖與載體蛋白結合的同時，容易引起多糖與載體蛋白的自身交 聯，從而降低多糖-蛋白的結合效率；（3)多糖和載體蛋白均為大型生物分子，中間靠僅有 6個碳原子長度的ADH相連，多糖和蛋白質的結構勢必會相互影響，使得多糖的一些重要抗 原表位易被蛋白質所屏蔽，進而降低多糖的免疫原性。因此，多糖-蛋白結合疫苗的免疫原 性和抗體持效性仍有待進一步提高，如多糖結合疫苗需要免疫三次才能產生免疫效果。這 些不足之處限制了多糖結合疫苗的進一步發展。
[0022] 四、人輪狀病毒的危害及其流行病學研究
[0023] 在世界範圍內，輪狀病毒（Rotavirus)是導致兒童嚴重性腹瀉的主要病原體，在 發達國家，因急性腹瀉住院的兒童中，輪狀病毒的檢出率佔35?52%。在美國，估計每年 有3百萬兒童患輪狀病毒腹瀉，致使82000人住院治療，150人死亡。在發展中國家，輪狀 病毒也是導致2歲以下嬰幼兒嚴重胃腸炎最常見的病原體，估計每年有超過1. 25億5歲以 下的兒童患輪狀病毒性腹瀉，其中一千八百萬兒童患中度腹瀉，87萬死亡。在中國，兒童出 生率約一千七百萬，估計每年大約有35萬兒童由於患輪狀病毒腹瀉導致死亡，排世界第二 位。由於所述病毒的感染對2歲以下嬰幼兒腹瀉的發病率和致死率的增加有顯著作用，開 發預防輪狀病毒感染，有效且安全的疫苗是當務之急。
[0024] 輪狀病毒屬呼腸孤病毒科（Reoviridae genus)，是導致人類和眾多動物腹瀉的病 原體。全病毒直徑70nm，具有特殊的三殼結構，最裡層的核殼結構為核殼蛋白，包裹有病毒 基因。病毒的基因由雙股RNA的11個分段式片段組成，為6個結構蛋白和5個非結構蛋白 編碼。核殼蛋白是由VPl，VP2和VP3三個病毒蛋白構成；中間殼蛋白為VP6,外殼蛋白是由 VP4和VP7組成。由於輪狀病毒的基因是雙股的RNA，多片段結構，這種結構的基因可以進 行基因間的某種程度的重新組合，即輪狀病毒基因的重配（reassortment)。當二個或者多 個病毒同時感染一個宿主細胞後，在新病毒顆粒的包裝階段，各個病毒的基因片段將在細 胞內重新組合，造成重配基因發生。輪狀病毒這種重配基因的能力導致了人體對其免疫反 應的多樣性，也增加了製作特異性輪狀病毒疫苗的難度。
[0025] 輪狀病毒根據病毒抗原性的不同可分成不同的型，亞型和血清型。現已發現有7 個血清型（A型?G型），大多數人類病原體屬於A、B和C型。流行病學調查發現致使人類 和動物患病的輪狀病毒中以A型最常見，是疫苗開發的主要目標。A型輪狀病毒根據其VP6 抗原特性的不同，進一步分類為亞型，絕大部分病毒株屬於亞型I或II中的一種。不同的 輪狀病毒表面殼蛋白VP7和VP4的中和抗原簇有所不同，能夠獨立地誘導各自的中和性抗 體，病毒的血清型可由VP4和VP7抗原的特異性決定。A型輪狀病毒根據VP7和VP4的不同 可進一步分類成G血清型和P血清型。由於輪狀病毒基因是由11個片段組成，VP7和VP4 的編碼基因能夠獨立分離組合，產生了 一種二進位方式進行的基因重配。VP7是一種糖蛋白 (glycoprotein)，因其抗原特性分為15種不同的G血清型，與其特異性的核酸序列，即基因 型（genotype)相對應；也就是說，每一 G血清型都有其特異的基因型，因此，通常G血清型 和G基因型可通用。全球鑑定出的人類致病輪狀病毒株中，超過90%的是Gl，G2, G3, G4， 和G9株，共有10個血清型從人體上分離出來（見表1)。VP4是一種能夠被胰蛋白酶切斷 成兩個不同的病毒蛋白，即VP8和VP5病毒蛋白，由其的抗原性的不同而決定的血清型為P 血清型，有些P血清型可進一步分為2個亞血清型。由於缺乏區別不同VP4血清型分型的 血清或單克隆抗體，阻礙了 VP4的血清型分型。RT-PCR的應用才使得VP4的基因型分型成 為可能，並運用於樣品的流行病學調查。因此，VP4基本上是根據基因序列來進行分類，目前 共發現14個P血清型和至少26個P基因型（標於括號中）。P血清型和P基因型可能不 對應，需要同時標出，例如，輪狀病毒Wa毒株被標示為PlA [8] Gl病毒。人類致病的毒株中， G1，G3，G4和G9的P和G血清型組合通常是P1A[8]，而G2通常是P1B[4]。由此可見，在世 界範圍內流行的輪狀病毒享有相同的交叉中和的抗原簇（印itopes) Pl血清型，至少有7個 VP4血清型在人類輪狀病毒中被發現。在流行病學上有意義的人類毒株的G血清型1，3,和 4是屬於P血清型的IA亞血清型，和G血清型2是P血清型的IB亞血清型。
[0026] 由於自然輪狀病毒感染能夠很好地誘導免疫保護，至少對嚴重輪狀病毒的感染， 因此，大多數開發疫苗的努力放在減毒活疫苗上。最初的研究集中於使用動物輪狀病毒株， 通過稱之為Jennerian法來進行，原因是自然減毒的動物毒株在人體是安全的，而且主要 產生的是混合型免疫保護。
[0027] 在發現輪狀病毒是導致兒童嚴重性腹瀉的病原體10年後，於1983年，開始 了用豬輪狀病毒株RIT4237(G6P[1]型），製成的第一個輪狀病毒減毒活疫苗進行了臨 床試驗，在芬蘭試驗的結果顯示，所述疫苗是安全和有效的，通過混合型人類輪狀病毒 〇16七61'(^7。；[011111]^111'(^3￥；[；101868)的作用，預防嚴重輪狀病毒腹瀉的保護率達80(%。但 是，在隨後的其他國家進行的臨床試驗效果令人失望，顯示低或者沒有保護作用，所述試驗 以失敗告終。在1987年，猴輪狀病毒RRV毒株被用以開發減活疫苗，是第一批開發的輪狀 病毒疫苗中的另一個。臨床試驗表明，儘管所述疫苗能夠誘導機體產生保護性抗體，但結 果不穩定，究其原因在於，RRV毒株的G血清型是G3P [3]，當人體感染的輪狀病毒是同型的 G血清型時，即G3,疫苗的效果顯著；如果是不同型的G血清型感染時，則效果不佳。隨後， RRV株通過基因重配的方法將人類毒株中的VP7基因引入到所述毒株中，使得人類輪狀病 毒中常見的其他三種G血清型Gl，G2和G4也能夠在RRV重配毒株上表達，這導致了 4價 Rotashield疫苗的開發成功。所述疫苗於1998年獲得FDA批准上市銷售，但是由於大規模 接種後發現了少數，但是數量明顯升高的腸套疊副作用病例的發生，在1999年而被生產公 司下市。在1988年，開始用另一個輪狀病毒毒株，即WC3豬毒株（G6P[5]型），進行臨床試 驗時，開始結果證明有效，但是在隨後的試驗中顯示沒有顯著的保護性，所述疫苗也停止了 繼續試驗。到1990年，為了使得WC3毒株的抗原結構更接近於人類輪狀病毒，通過基因重配 (gene reassortment)的方法，將為VP4和VP7蛋白編碼的基因從人類輪狀病毒引入到WC3 重配毒株上,這種方法稱之為改進的Jennerian法。所述毒株和方法就是被Merck用以開 發RotaTeq的5價（pentavalent)疫苗的開發方法。2006年，由Merck生產5價的WC3-基 因重配疫苗RotaTeq也被批准上市，所述疫苗含有VP7和VP4這兩個人類輪狀病毒蛋白取 代基因，即61，62,63,64中的相應的￥?7蛋白基因，和？[8]的相應的￥?4。臨床試驗表明， 所述疫苗沒有腸套疊副作用，對由於G1-G4輪狀病毒所致的胃腸炎的保護率為74%，對嚴 重胃腸炎的保護率達98%，對住院和急症訪問的保護率為94. 5%。同年，GSK生產的人類 輪狀病毒減毒活疫苗Rotarix也獲得上市批准，這個疫苗是基於減毒的人類毒株89-12,血 清型為G1P[8]株，是世界範圍內最常見血清型。所述病毒是從一個患輪狀病毒胃腸炎的患 者臨床樣品中分離出來，並在組織細胞多次傳代變異減毒後獲得。臨床試驗表明，在注射兩 個劑量後，對所有輪狀病毒感染的保護率達87%以上，對嚴重的胃腸炎的保護率達96%， 對需要住院胃腸炎病例的保護率達100%。進一步試驗表明，所述疫苗的範圍保護不僅僅包 括由61?[8]株導致的胃腸炎，而且包括了與￥?4有關的63?[8]，64[8]和69?[8]株導致的 胃腸炎。對G3，G4和G9輪狀病毒感染保護的有效性與Gl的相同，超過了 95 %，而對G2株 的有效性是75%，對所有輪狀病毒致胃腸炎住院的保護率為75%。
[0028] 統計數據表明，Gl株在世界範圍內是最常檢測到的毒株，在亞洲、北美和歐洲， G1-G4株佔總感染輪狀病毒的97. 5%。在南美洲、非洲、澳大利亞佔83. 5% -90. 4%，同時， 在這些地區G5、G8和G9毒株開始變得重要起來。從P血清型來看，PlA[8]株最常見，接下 來的是PlB [4]株。這一結果是可以預見的，因為VP7血清型Gl是P1A[8]，為最常檢測到的 VP7血清型；其他兩個流行病學重要的VP7血清型，G3和G4,也具有相同的VP4血清型。另 一個主要血清型G2的VP4有P1B[4]的特徵。儘管G和P血清型或基因型可有多種不同的 組合，但是，4種P-G的組合，即P [8]Gl，P [4]G2，P [8]G3，和P [8]G4組成了 88. 5%的常見的 致病性毒株。
[0029] 由此可見，如果以G血清型的VP7蛋白來配置疫苗，需要包含多種不同的G血清型 毒株來提高疫苗的覆蓋率，即Gl、G2、G3、G4、G9、G8和G5, 7價的輪狀病毒減毒活疫苗也是 目前開發新一代疫苗的努力方向。如果從另一個策略來開發輪狀病毒疫苗，以P血清型決 定蛋白VP4的不同來配製新一代的疫苗，則可大大減少疫苗中包含的毒株品種來達到相同 發覆蓋率。從以上的分析可見，如果以P[8]和P[4]兩個P血清型毒株來配製疫苗，免疫的 效果將和7價的G血清型相當。從臨床上使用的Rotarix和Rotateq效果來看，幾乎沒有區 另Ij，而且，現有的統計數據上看，Rotarix似乎比Rotateq更有效。從分析這兩個疫苗所包含 的毒株血清型決定蛋白的組成來看，Rotarix僅含有Gl這一種VP7病毒蛋白；儘管Rotateq 含有Gl、G2、G3、和G4的四種VP7病毒蛋白，免疫效果並沒有增強；而從兩者含有的P血清 型決定蛋白VP4的數量來看，Rotarix含有P [8] -種，而Rotateq含有P [8](其中一個毒 株）和P [5] (WC-3原始毒株為G6P [5])兩種；但是Rotarix中的重要抗原成分P [8]的含量 將高於Rotateq中的含量。由此可見，從P血清型的角度來評估，含P [8]的VP4毒株輪狀 病毒疫苗有著重大的意義。如果新一代疫苗中包含有P血清型的P[8]、P[4]和P[6]三種 VP4抗原成分，即可涵蓋全球大部分地區的流行毒株。
[0030] 五、納米微球在生物技術中的應用及前景
[0031] 納米材料是指晶粒尺寸小於100納米的單晶體或多晶體，獨特的小尺寸效應和表 面或界面等效應，使其具備了許多優異的或全新的性能，它正日益受到人們的重視。例如納 米材料對藥物研究領域的不斷滲透和影響，已經引發了藥物領域一場深遠的革命。藥物是 人類用於抵禦和預防疾病的重要物質，長期以來，藥物的研究開發已經為臨床提供了許多 的治療手段，為患者帶來了許多益處。但是，現有藥物仍存在著許多問題，如藥物無法在循 環系統內滯留並達到有效濃度、無法到達特定的治療目標、無法通過血腦屏障、無法在某個 局部形成較高濃度而同時又不產生毒副作用等（吳新榮.載藥納米微粒的應用及研究進展
[J].中國醫院藥物學雜誌，2001，21 (3) : 171-173.)。磁性納米微球藥物載體是納米技術與 現代醫藥學結合的產物，由於它具有小尺寸效應、良好的靶向性、生物相容性、生物降解性 和功能基團等優點，因此有望克服傳統藥物所帶來的這些缺陷。磁性納米微粒也可用於蛋 白質和酶的純化、回收以及酶的固定化，操作簡單，且提高酶的穩定性。利用磁性納米微粒 進行免疫分析，具有特異性好、分離快、重現性好的特點。使用磁性微球載體進行介入治療， 在磁控血管內進行栓塞，則具有磁控導向、靶位栓塞等優點。
[0032] 磁性納米微球在生物醫學中的應用隨研究的深入日漸廣泛，具體有：
[0033] 1、固定化酶
[0034] 生物高分子例如酶分子等都具有很多官能團，可以通過物理吸附、交聯、共價偶 合等方式將他們固定在磁性微粒的表面。用磁性納米微球固定化酶的優點是：易於將酶 與底物和產物分離；提高酶的生物相容性和免疫活性；提高酶的穩定性，且操作簡單可降 低成本。Bendkiene等製備了殼聚糖磁性微球，用作固定化載體。酶被固定在這種載體上 之後，可以很容易地用磁性裝置從反應的混合液中分離回收。國內的研究者對這方面也 作了探索，丁小斌等採用分散聚合法，合成出Fe30V(St-MPE0) (St-苯乙烯，MPEO-聚環氧 乙烷大單體）微球，所述微球具有兩親結構，在大多數極性、非極性介質中都具有良好的 溶脹性能，使得微球固載的化合物在多種介質中都具有較高的活性（Ding XB，Wei L，Zhao HZ.Synthesis and characterization of aliphatic polycarbonatediols[J]. Applied Polymer Science, 2001，79 (3) :1847-1851)。所述磁性納米微球載體可望用於蛋白質和酶 的純化、回收以及酶的固定化、細胞分離等領域。
[0035] 2、靶向藥物
[0036] 具有靶向性的藥物載體微球是指載藥微球能高選擇地分布於作用對象，從而增強 療效、減少副作用。最初的靶向藥物載體微球是根據臨床需要，通過選用對機體各種組織 或病變部位親和力不同的載體製作載藥微球，或將單克隆抗體與載體結合，以使藥物能夠 輸送到治療期望達到的特定部位。隨著人們對治療的要求越來越高，靶向定位也因受基質 的限制而不能完全令人滿意，因此就出現了磁性納米微球載藥系統。這種系統在外加磁場 的作用下，通過動（靜）脈注人到病變組織，把載體定向到病變部位（靶位），使所含藥物 得到定位釋放，集中到病變部位發生作用（A Paul,Alivisatos. Ultrasensitive magnetic biosensor for homogeneous immunoassay[J]· Science,2001，12(5):53-60)〇 德國的 Lubbe等完成了世界上第一例應用磁性藥物靶向治療的臨床實驗。在對14個晚期實體瘤患 者的磁靶向治療中，發現患者對磁性靶向藥物的耐受性很好。Lexion等也應用磁性微球作 為藥物載體治療兔子的鱗癌（Lexion C，Arnold W, Klein RJ, et al. Locotegional cancer treatment with magnetic drug targeting[J]. Cancer Res,2000, 60(23):6641-6648), 國內的陶凱雄等用阿黴素磁性蛋白微球治療鼠種植性胃腫瘤（陶凱雄，孫宏武，陳 道達，等.阿黴素磁性蛋白微球靶向治療鼠種植性胃腫瘤[J].中華實驗外科雜誌， 2000, 17(1) :63-64))，郭軍等用平陽黴素磁性微球治療口腔領面部海綿狀血管瘤25例。此 夕卜，強磁場也具有抑癌作用（郭軍，李澄，吳漢江.平陽黴素磁性微球靶向治療口腔頜面部 海綿狀血管瘤25例臨床報告[J].南京鐵道醫學院學報，2000，19(2):112-114))。徐慧顯 等用葡萄糖磁性微球固定化L-天冬酞胺酶來治療急性淋巴白血病，也取得了良好的治療 效果。這些結果都表明，隨磁場強度的提高磁性藥物在腫瘤部位的聚集增多，利用外加磁 場的磁導向作用，使藥物定點於靶部位，發揮集中、高效的抗腫瘤作用。正是由於磁性納米 微球的靶向性和表面結合的特異性載體，使人們有望利用它來追蹤和消滅正在轉移的癌細 胞，從而成為人體內消滅癌細胞的"生物飛彈"。但是，目前應用磁性藥物治療的腫瘤多位於 體表或離體表較近，因此外加磁場的強度可以較弱，且易於控制，若治療深部器官或組織的 腫瘤，則需要進一步優化磁場強度、定位和藥物載體顆粒大小等。而要提高磁性微球的磁化 強度則有一定的難度，因為磁性微粒表面的包覆層會大大降低其磁性能，另外，顆粒大小的 可控也是有待解決的一個問題。
[0037] 3、細胞分離和免疫分析
[0038] 如果磁性微粒表面引接具有生物活性的專一性抗體，在外加磁場的作用 下，利用抗體和細胞的特異性結合，就可以得到免疫磁性微球（Immunomagnetic microspheres, IMMS)或免疫磁性珠 （Immunomagnetic beads, IMBS)，利用它們可快速有效 地將細胞分離或進行免疫分析。尤其是採用MBS對細胞、細胞器表面所特有的抗原物質進 行分離時，具有簡便快速、分離純度高、保留靶物質活性等特點。Mccole等用MBS分離被肝 吸蟲感染過的成年牛外周血中的T淋巴細胞，分出的細胞純淨，用於肝吸蟲感染機制效果 良好。John用連有單抗的I麗S檢測沙門氏菌，整個檢測過程只需2-3h，靈敏度為103-104 菌體/ml，一定量血液和糞便的存在對分析無幹擾，與凝集法和免疫螢光法相比，靈敏度提 高103倍。Glenn用MBS分離呼吸合包體病毒，結合酶聯免疫分析，減低了傳統管和微孔 分析中的擴散和非特異性吸附，複合物的形成只需7min，而傳統微孔法則需120min。細胞 的分離技術還可用於癌症的治療。康繼超等用物理吸附結合化學鍵共價結合的方法，將抗 人膀朧癌單克隆抗體連接到預先製備的聚苯乙烯磁性微球載體的表面，構建了能特異地與 靶細胞結合併賦予其以磁響應性的免疫磁性微球。結果表明，所構建的IMMS可有效地和靶 細胞結合，用IMMS從動物骨髓中分離癌細胞的初步實驗表明，IMM可有效清除癌細胞，而骨 髓細胞僅有很少量的損失。免疫分析在現代生物分析技術中是一種重要的方法，它對蛋白 質、抗原、抗體及細胞的定量分析發揮著巨大的作用。利用磁性納米微粒載體結合的抗原或 抗體進行免疫分析，具有特異性高、分離快、重現性好等特點。景曉燕等採用無乳聚合法，在 醇一水體系中，以過二硫酸鉀為引發劑，在Fe304磁性流體粒子表面形成引發點，以丙烯酸 (AA)為穩定劑，通過苯乙烯（ST)與丙烯酞胺共聚，製備出單分散的胺基磁性微球，所述微 球可直接、快速與抗體（抗原）蛋白質交聯，避免了其它功能團微球結合免疫試劑時需採用 蛋白質為交聯劑的缺點（景曉燕，王君，李茹民，等.磁性功能高分子微球的製備研究[J]. 應用科技，2000, 27 (1) : 16-17))。
[0039] 4、磁控檢塞
[0040] 在通常的介人治療過程中，會發生異位栓塞及梗死等現象，並引起嚴重的併發症， 這是臨床上急需解決的棘手問題，而使用磁性微球載體的介人治療，在磁控血管內進行栓 塞則具有磁控導向、靶位栓塞等優點，為解決以上難題提供了途徑。學者們著重在磁球粒 徑、磁控時間、磁場強度、磁性微球包裹材料（粗糙、攜帶正電荷、具有疏水特性）等方面 做了細緻的研究。Minalnimura等運用熱療和動脈栓塞相結合的療法用於鼠肝癌模型的 研究。他們研製了 DM-MS動脈導管局部給藥，外加500kHz的磁場。治療3d後，腫瘤增長 率（栓塞-熱療組、單純栓塞組和對照組）分別為28%、124%和385% (Minalnimura T， Sato H, Kasaoka S, et al. Tumor regression by inductive hyperthermia combined with hepatic embolization using dextran magnetite incorporated microspheres in rats [J]· Int J Oncol ,2000, 16 (6) :1153-1160)。此研究顯示 DM-MS 熱療和栓塞相結合療 法是一種抗腫瘤可行性療法，具有廣闊的研究和應用前景。Goodwin等對阿黴素磁性微球 肝動脈栓塞和藥物祀向對抗腫瘤療法的毒性做了研究（Goodwin SC, Bittner CA, Peterson CL, et al. Single-dose toxicity study of hepatic intra-arterial infusion of doxorubicin coupled to a novel magnetically targeted drug carrier[J]. Toxical, 2001，60 (I) : 117-183)。他們建立的豬肝癌模型結果顯示阿黴素磁性微球低劑量 無毒副作用。只有當磁性微球的含量> =75mg(含或不含阿黴素）靶區才有較好的效果， 肝癌細胞的壞死程度與栓塞程度成正比，阿黴素不能在全身自由循環而成功地被控制在靶 區。惠旭輝等用自製的聚甲基丙烯酸甲醋磁性微球對血管內栓塞進行了探討，實驗表明， 30-50um的PMMA磁性微球具有磁響應能力強、磁控栓塞效果好、在高血流速情況下仍能實 現靶位栓塞等優點，是一種較好的磁控血管內栓塞材料（惠旭輝，高立達，何能前.聚甲基 丙烯酸甲酯磁性微球血管內栓塞實驗研究[J].四川醫學，2001，22(10):928-929))。在磁 控栓塞中，磁性微球載體的大小是影響靶區定位最重要的因素。如果粒徑較小，則磁響應性 弱，磁控度較差，不能用於高血流速或較大管徑血管內的磁控栓塞。因此，與磁性微球在其 他方面的應用有所不同，在磁控栓塞介人治療中，一般採用粒徑較大的磁性微球。
[0041] 也有報告指出，納米微球可作為DNA疫苗的載體蛋白和佐劑，但應用於預防性多 糖和/或蛋白類疫苗未見報導。


【發明內容】

[0042] 針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供一種免疫原性更強的綴合疫 苗。
[0043] 為實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下：
[0044] 一種綴合疫苗，其為多價肺炎球菌多糖與兩種或兩種以上的載體蛋白經連接體而 成的綴合疫苗，其中，連接體為磁性納米微球。
[0045] 作為一種優選方案，所述磁性納米微球的磁性微粒位於磁性納米微球的內部為 核，高分子材料包裹於磁性微粒的外部。
[0046] 作為進一步優選方案，磁性微粒為Fe304。
[0047] 作為進一步優選方案，磁性納米微球粒徑為0. 1-10 μ m，優選為0. 1-5 μ m。
[0048] 作為另一種優選方案，高分子材料為生物高分子材料，選自殼聚糖、聚乙二醇、聚 乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA)中的一種或以上的混合 物；最佳為PLGA或PELA。
[0049] 作為另一種優選方案，多價肺炎球菌多糖為多種肺炎球菌莢膜多糖，優選為分離 提純血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血清型包括1、2、3、4、5、 6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F 和 / 或 33F。
[0050] 作為進一步優選方案，多價肺炎球菌多糖與兩種載體蛋白的質量比為（0. 5?2): 1，優選為（〇. 5?1) :1，其中各載體蛋白間的質量比優選為1 :1。
[0051] 作為一種優選優選方案，所述載體蛋白選自重組人輪狀病毒蛋白、白喉類毒素、破 傷風類毒素、載體蛋白CRM197、嗜血流感桿菌表面蛋白HiD、百日咳Prn表面蛋白、百日咳 Fha抗原和/或肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)。
[0052] 作為進一步優選方案，所述載體蛋白中有一種為嗜血流感桿菌表面蛋白HiD或肺 炎球菌表面蛋白A(rPspA)。
[0053] 作為進一步優選方案，重組人輪狀病毒蛋白為P基因型輪狀病毒蛋白的部分氨基 酸序列或全序列，優選為P基因型輪狀病毒毒株P [8]、P [4]、P [6]或P [11]中的一種；其中， P 基因型輪狀病毒毒株選自 P[8]G1、P[4]G2、P[8]G3、P[8]G4、P[8]G9、P[8]G5 或 P[6]G8 中 的一種。
[0054] 作為更進一步優選方案，P基因型P[8]的輪狀病毒毒株選自Wa、Ku、P、Y0、M0、 VA70、D、AU32、CH-32、CH-55、CHW2、CH927A、W161、F45、Ai-75、Hochi、Hosokawa、BR1054、 WT78或WI79毒株中的一種。
[0055] 作為更進一步優選方案，P基因型P[4]的輪狀病毒毒株選自DS-1、RV-5、S2、L26、 KUN、E210、CHW17、AU64、107E18、MW333 或 TB-Chen 毒株中的一種。
[0056] 作為更進一步優選方案沖基因型？[6]的輪狀病毒毒株選自1〇7、1076、1^-3、5丁3、 SC2、BrB、McN13、US1205、MW023、US585 或 AU19 毒株中的一種。
[0057] 作為另一種進一步優選方案，重組人輪狀病毒蛋白選自VP8、VP4、VP8多肽鏈片 段、核VP8、VP4多肽鏈片段、VP8特異性抗原簇肽鏈或VP4特異性抗原簇肽鏈中的一種。
[0058] 作為另一種進一步優選方案，重組輪狀病毒蛋白是G血清型輪狀病毒的VP7蛋白 的部分胺基酸序列或全序列。
[0059] 作為另一種進一步優選方案，重組輪狀病毒蛋白是G血清型輪狀病毒的VP7蛋白 的部分胺基酸序列或全序列。
[0060] 作為更進一步優選方案，G血清型輪狀病毒毒株選自G1、G2、G3、G4、G9、G5、G8、G10 或Gll血清型中的一種。
[0061] 作為更進一步優選方案，所述G血清型輪狀病毒毒株選自P [8]Gl、P [4]G2、P [8] G3、P[8]G4、P[8]G9、P[8]G5 或 P[6]G8 血清型中的一種。
[0062] 本發明的另一目的是提供所述綴合疫苗的製備方法，具體是將多價肺炎球菌多糖 與兩種或以上的載體蛋白分別與磁性納米微球偶聯而成。
[0063] 作為一種優選方案，所述綴合疫苗的製備方法，具體包括以下步驟：
[0064] a)分別分離提純多種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖；
[0065] b)分別製備並分離提純所選用的載體蛋白；
[0066] c)分別將各種莢膜多糖與磁性納米微球偶聯成多糖-磁性納米微球偶聯體；
[0067] d)再將多糖-磁性納米微球偶聯體分別與多種載體蛋白偶聯結合；
[0068] e)分離純化步驟d)所得偶聯體成所述綴合疫苗原液。
[0069] 作為進一步優選方案，所述綴合疫苗的製備方法，具體包括以下步驟：
[0070] a)分別分離提純多種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖；
[0071] b)分別分離提純所選用的多種載體蛋白；
[0072] c)分別將各種莢膜多糖與磁性納米微球偶聯成多糖-磁性納米微球偶聯體，再經 化學改性，從而將所述多糖-磁性納米微球偶聯體表面未與多糖反應的-OH改性為-CHO ;
[0073] d)再將多糖-磁性納米微球偶聯體分別與多種載體蛋白偶聯結合；
[0074] e)分離純化步驟d)所得偶聯體成所述綴合疫苗原液。
[0075] 作為進一步優選方案，所述製備方法還包括製備磁性納米微球，包括先製備納米 磁性粒子再製備磁性納米微球的過程；其中納米磁性粒子可通過化學共沉澱法、水熱法或 溶膠法熱解法製備，磁性納米微球可通過包埋法、單體聚合法或原位法製備，優選為採用化 學共沉澱法製備納米磁性粒子再將納米磁性粒子與高分子材料經快速膜乳化結合溶劑萃 取法和/或包埋法或單體聚合法製備磁性納米微球；最優選為採用化學共沉澱法製備納米 磁性粒子再將納米磁性粒子與高分子材料經快速膜乳化結合溶劑萃取法和/或包埋法制 備粒徑均一的磁性納米微球；其中磁性微粒優選為Fe 304。
[0076] 作為更進一步優選方案，上述納米磁性離子的製備方法可可參照現有技術中Fe3O 4 磁性納米微球的方法製備，具體可參見下述【具體實施方式】，並不作為本發明是否可實現的 關鍵因素。
[0077] 作為更進一步優選方案，步驟a中多糖的分離純化工藝可根據所需的多糖及蛋白 種類根據現有技術進行操作。
[0078] 作為更進一步優選方案，步驟b中的蛋白的製備及分離純化工藝可根據所需的多 糖及蛋白種類根據現有技術進行操作。
[0079] 作為更進一步優選方案，步驟c的具體操作為：在偶聯介質反應緩衝液中，室溫 下、pH4. 0-9. 0下，將步驟a所得多糖與磁性納米微球共反應6-24小時得多糖-磁性納米 微球偶聯體，再通過25%戊二醛對其進行進一步改性，使得多糖-磁性納米微球偶聯體表 面未與多糖反應的-OH改性為-CHO ;其中偶聯介質優選為PB、PBS或TBS，最佳為0. IM TBS 溶液；反應緩衝液的最佳pH為6 ;最佳反應時間為12-16小時。
[0080] 作為更進一步優選方案，步驟d的具體操作為：在偶聯介質反應緩衝液中，4°C、 pH4. 0-9. 0下，將步驟c所得經化學改性的多糖-磁性納米微球偶聯體與載體蛋白共反應 12-24小時；其中偶聯介質優選為PB、PBS或TBS，最佳為0. IM TBS溶液；反應緩衝液的最 佳pH為6 ;最佳反應時間為24小時。
[0081] 作為更進一步優選方案，步驟e的分離純化是將偶聯結合物和未反應的多糖和 載體蛋白分離純化，純化方法可用層析法或超濾法；可根據獲得的綴合疫苗的分子大小進 行分離純化，層析法優選採用Superdex200凝膠過濾柱、Sepharose CL-4B或Sepharose CL-6B進行；而超濾法是採用不同滯留分子量膜來分離結合物和未反應物。
[0082] 所述綴合疫苗製劑可採用水劑或凍幹劑。為了增強其免疫原性，可加入佐劑，常用 的佐劑有鋁佐劑，如氫氧化鋁、磷酸鋁，本發明優先選擇磷酸鋁。結合物的溶劑可為〇. 2氯 化鈉溶液、I XPBS緩衝液或其它能夠穩定多糖或者結合物的緩衝液。本發明的綴合疫苗各 製劑的製備方法採用本【技術領域】的常規手段製備。其中，優選在糖（例如蔗糖或乳糖）存 在下進行凍幹。
[0083] 本發明提供的綴合疫苗可以以任何已有的途徑進行免疫，包括真皮層或皮膚給 藥、肌肉給藥等形式。其中，所給予的量是本領域技術人員根據常識可以確定的。
[0084] 術語定義
[0085] 核VP8 :是輪狀病毒蛋白VP8中的一段具有和細胞表面含有唾液酸（sialic acid) 粘合功能的多肽鏈，通常含有160胺基酸殘基。
[0086] VP8多肽鏈片段：為任何分子量低於全長VP8的多肽鏈。
[0087] VP4多肽鏈片段：為任何分子量低於全長VP4的多肽鏈。
[0088] VP8特異性抗原簇鏈：全VP8多肽鏈含有多個抗原決定簇，通過基因重組的方法剪 切去不含重要的胺基酸，而保留含有特異性抗原簇的多肽鏈，分子量通常小於全長VP8多 肽鏈。
[0089] VP4特異性抗原簇鏈：全VP4多肽鏈含有多個抗原決定簇，通過基因重組的方法剪 切去不含重要的胺基酸，而保留含有特異性抗原簇的多肽鏈，分子量通常小於全長VP4多 肽鏈。
[0090] VP8融合蛋白：用基因重組方法，將VP8蛋白和其它可溶性蛋白多肽鏈融合表達， 以提高VP8在水溶液中的可溶性；或增強VP8的免疫原性。
[0091] NSP4蛋白：是非結構性蛋白，具有腸毒素特性，分子量為28kDa，含有175個氨基 酸。
[0092] VP8-NSP4融合蛋白：用基因重組的方法，將VP8和NSP4多肽鏈融合表達，以提高 VP8在水溶液中的可溶性，同時使得融合蛋白具有刺激機體產生抗NSP4的保護性抗體。 [0093] 莢膜多糖片段：通過物理（如超聲波、微粒噴霧）、化學（如酸、鹼、酶消化）等方法 將由細菌培養液中純化的多糖（稱全多糖或原始多糖）降解（depolymerization)所獲得 的多糖片段，分子量通常低於原始多糖。莢膜寡聚糖：通過物理（如超聲波、微粒噴霧）、化 學（如酸、鹼、酶消化）等方法將由細菌培養液中純化的多糖（稱全多糖或原始多糖）降解 (depolymerization)所獲得的多糖片段，分子結構中的單糖殘基通常低於10。不過單糖殘 基數量的定義有差異，有些文獻將多於10個少於20個單糖殘基的多糖鏈也成為寡聚糖。 [0094] 與現有技術相比，本發明具有以下優勢：
[0095] 1.所述綴合疫苗是含兩種或兩種以上不同載體蛋白的免疫綴合物，與現有的肺 炎球菌結合疫苗相比，其免疫原性更強，誘發的多糖抗體水平高於單載體結合物，可以在更 廣闊的人群中引起免疫應答，尤其是嬰幼兒；可通過減少各載體劑量而避免載體表位過載； 可通過兩種載體增強輔助T細胞活性；
[0096] 2.由於兩種載體蛋白中具有保護性的蛋白抗原表位也會誘導比兩種蛋白混合注 射時更高的免疫反應，相互協同作用，進一步增進了載體蛋白的免疫原性，增加了機體對多 糖的免疫反應；
[0097] 3.本發明首創的採用磁性納米微球作為多糖與多載體蛋白的連接體，有效地避免 在製備過程中莢膜多糖和蛋白質間的自身偶聯，能夠提高結合產物的收率，並且利於產品 的質量控制；可有效延長莢膜多糖與載體蛋白之間的空間距離，減小了載體蛋白對莢膜多 糖抗原表位的空間屏蔽效應，有利於提高莢膜多糖的免疫原性；
[0098] 4.所述綴合疫苗的製備過程中首創的將磁性納米微球表面的-OH先與多糖進行 偶聯反應，再將偶聯體經化學改性將未反應-OH改性為-CHO在與載體蛋白中的-NH2進行 偶聯結合，較現有技術中的結合方法更為穩定；
[0099] 5.其製備方法簡單，適合規模化工業生產的需要，未顯著改變莢膜多糖和載體蛋 白的結構特徵。
[0100] 綜上述，本發明提供的綴合疫苗製備工藝簡單，採用磁性納米微球為連接物的綴 合疫苗能夠增強小鼠 Thl型免疫應答，以及多糖特異性抗體的免疫持效性、特異性和親和 性，此外還可誘導小鼠產生輪狀病毒抗體；具備兩種疫苗的預防效果；因此具有十分廣闊 的應用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0101] 圖1為本發明實施例1所製得的綴合疫苗的1H-NMR譜圖；
[0102] 圖2為本發明提供的綴合疫苗的多糖特異性抗體的免疫應答實驗結果示意圖；
[0103] 圖3為本發明提供的綴合疫苗的多糖特異性抗體的免疫持效性實驗結果示意圖。

【具體實施方式】
[0104] 下面結合實施例對本發明作進一步詳細、完整地說明。以下所用試劑或設備均為 市售品種，如無特殊說明，均按照說明書操作，在此不做贅述。
[0105] 以下為結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但不應視為對本發明的限定。
[0106] 實施例1
[0107] 一、製備磁性納米微球
[0108] L 取 2. 24gFeS04-7H20 和 3. 24gFeCl3-6H20 分別溶於 IOmL 和 15mL 過濾除氧的 ClddH2O中，溶解後混合均勾，加入IOOmL過濾除氧的ClddH2O ;
[0109] 2.在N2的保護下攪拌5min，一次性加入50mLlmol/LNa0H溶液，再調節溶液pH至 9-10,加快攪拌速度至200-250r/min，連續攪拌30min ;
[0110] 3.將反應容器轉移至65-70°C水浴中，繼續在N2的保護下攪拌陳化30min ;
[0111] 4.反應完畢定容至lOOmL，顯微鏡下觀察磁性粒子合成情況；
[0112] 5.將400mgPLGA溶於IOmLEA溶劑中作為油相（0)，加入3mL上述磁性粒子溶液作 為內水相（W1),採用超聲細胞破碎儀（120W、60s)在冰水浴中進行初乳化化製備初乳，再將 初乳倒入一定量含15g/LPVA和0.9% (co)NaCl的水溶液（外水相，W2),磁力攪拌（300r/ min、2min)製備預復乳液（W1AVW2),再將預復乳倒入快速膜乳化的儲料罐中，以一定N 2壓 力將其反覆壓過SPG膜，得粒徑均一的納米微球復乳液滴。此外，未用完的納米微球可製成 凍幹劑留用。
[0113] 或通過取Fe3O4磁性粒子與50mL與無水乙醇按等體積加入，超聲活化30min後， 置60°C水浴中，緩慢的滴加 IOmLPELA對磁性納米微球進行-NH2末端改性且將PELA包裹在 Fe3O4磁性粒子外，在氮氣保護下攪拌反應10h，製成磁性納米微球；反應完畢後，用50mL無 水乙醇洗漆3次，再用0. OlMPBS洗漆三次後，定容至50mL，顯微鏡下觀察磁珠改性情況，至 磁性納米微球表面-NH2末端改為-OH末端。
[0114] 二、肺炎球菌多糖的製備
[0115] L 選取 24 種血清型（1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、 18C、19A、19F、20、22F、23F、33F)的肺炎球菌培養；
[0116] 2.分別提純以上各種血清型肺炎球菌中抗原性強的莢膜多糖：肺炎球菌，滅活 後離心收集上清液，經超濾濃縮，根據各肺炎球菌血清型特性分別加入適量（體積分數為 70 %的）預冷乙醇，離心收集，得粗製多糖；將粗製多糖溶於乙酸鈉溶液中，然後按1 :2比 例以冷酚混勻，離心去除蛋白，反覆酚提5-6次，收集上清，用蒸餾水透析，透析後液體加 2mol/L氯化鈣溶液，加入乙醇攪拌，離心去除核酸，收集上清，補加乙醇（終濃度80 %攪 拌），離心收集沉澱，用乙醇、丙酮洗滌沉澱，脫水乾燥後即為多價精製莢膜多糖，置-20°C 保存備用。三、輪狀病毒載體蛋白的製備
[0117] 輪狀病毒載體蛋白的製備可參見現有技術中的多種重組蛋白的製備方法，本實施 例採用CN 101972475中提及的方法製備，可簡化為以下步驟，具體參數不做贅述：
[0118] 1、建立輪狀病毒的cDNA庫
[0119] 選用的為Wa毒株VP8蛋白的VP4基因，擴增引物設計如下：sense引物 HWaVP4 P ET28 ：
[0120] 5, -TTACATATGGCTTCGCTCATTTATAG-3,，anti-sense 引物 AHWaVP4 P ET28 :
[0121] 5 ' -CCGGATCCCTAGTCTTCATTAACTTGTGCT-3 '。
[0122] 2、構建pET28aWaVP8表達全長VP8質粒
[0123] 3、表達重組VP8蛋白
[0124] 1)將製得的pET28aWaVP8質粒轉化入BL21(DE3)competent細胞中，接種細胞到 50 μ g/mL卡那黴素 LB培養皿，在37 °C下於CO2培養箱內過夜。
[0125] 2)挑選出一個菌落，接種到10毫升含有50 μ g/mL的卡那黴素 LB培養液（1 %胰 蛋白腖、0.5%酵母提取物、1%似(：1，？!17.5)中擴增，在371：培養過夜。
[0126] 3)將培養液轉接種到100毫升的50 μ g/mL卡那黴素 LB培養液，繼續培養。待吸 光度600nm的OD到達I. 0時，將培養液轉接種到6升到50 μ g/mL卡那黴素 LB培養液中，繼 續在37°C，搖速200rpm的搖床內培養，待吸光度600nm的OD到達0. 6?0. 8時，加入0. 3mM 的IPTG (異丙基-β -D-硫代半乳糖苷）誘導VP8表達。
[0127] 4)在相同的培養條件下，誘導4小時後，以4000g下，在KTC離心20分鐘後，收集 菌體。
[0128] 5)將細菌懸浮於2〇1^的1父？85溶液，用法式壓濾壺$代11(^)代％)破碎細菌後， 在IOOOOg下，在KTC離心30分鐘，丟棄上清液，收集沉澱的包涵體。在進一步純化前，存儲 包涵體於-40°C。
[0129] 3、從包涵體中純化VP8蛋白
[0130] 1)稱取製備的VP8包涵體0. 5克（溼重），用清洗緩衝液（lOmMTris，IOOmM磷酸 鹽緩衝液，2Murea，pH8. 0)懸浮包涵體，在室溫下孵育30分鐘，以10, OOOg離心10分鐘，收 集包涵體。重複以上步驟三次除去汙染的雜蛋白。
[0131] 2)將包涵體沉澱溶於溶解緩衝液（IOmMTris-HCl，IOOmM磷酸鹽緩衝液，8M尿素， PH8.0)中，在冰上攪拌孵育1小時。以16, OOOg離心30分鐘，收集上清液，丟棄不溶沉澱 物。
[0132] 3)用固定金屬離子親和層析色譜法（IMAC)純化His-tagged重組VP8蛋白。
[0133] 4)收集含有VP8的洗脫液，轉入透析袋中在含有20πιΜβ-巰基乙醇1和8M尿素的 TBS (ρΗ4.0)中透析，並逐漸降低尿素的濃度（即8,6,4, 2,和1Μ)，在4°C中透析過夜。然後 在含有2πιΜβ -巰基乙醇的TBSpH5. 5溶液中透析兩次，最後在TBS溶液中透析。根據重組 VP8蛋白來源的毒株不同，來進行最後透析。
[0134] 四、肺炎球菌表面蛋白A(rPspA)的製備
[0135] 將PspA蛋白克隆至大腸桿菌進行表達並分離純化，具體包括：
[0136] 1.目的基因的優化和重組表達質粒的構建
[0137] 在GenBank中獲取PspA基因序列（GI :193804931)並進行優化，加上His標籤後 進行全基因合成，將合成的序列經Sac I和Nde I雙酶切後，定向克隆至同樣雙酶切的表 達載體pET-30a (+)中，轉化感受態大腸桿菌BL21Star (DE3)，37°C過夜培養，挑取陽性單克 隆菌落，擴增培養後提取質粒，用Nde I和Sac I雙酶切鑑定，並送測序，將測序正確的重 組表達質粒命名為pET-30a-rPspA。
[0138] 2.重組蛋白的誘導表達及純化
[0139] 復甦工程菌，以I :100的比例接種2XLB培養基，在37°C，237r/min下擴大培 養，當菌體值約為12時，加入IPTG至終濃度為lmmol/L，37°C誘導4h，取樣進行SDS-PAGE 分析離心收集誘導菌體,加入生理鹽水重懸洗滌2次，以1:10 (g/mL)的比例加入05mol/ LNaC15mmol/L咪唑20mmol/LPB(pH7. 4)的緩衝液重懸菌體，超聲波破碎菌體，8000Xg離 心40min，收集上清，於鎳離子層析柱中進行純化，按說明書操作純化產物的及分析將載體 pET-30a(+)轉化的大腸桿菌BL21Star(DE3)全菌體（對照）和將上步純化樣品經SDS-PAGE 分離後電轉移至硝酸纖維素膜上，用5%脫脂奶粉搖床輕微振蕩封閉2h ;加入His鼠源單抗 (1 : 800稀釋），4°C過夜；TBST清洗3次，加入HRP標記的羊抗鼠 IgG(l : 2000稀釋），室 溫孵育Ih ;洗滌3次，DAB顯色。
[0140] 五、綴合疫苗的製備
[0141] 1.多糖-磁性納米微球偶聯
[0142] 0. IMTBS溶液緩衝液下，pH6. 0加入上述步驟製得的任一或多種莢膜多糖和磁性 納米微球，本實施例中採用13價莢膜多糖（1、3、5、6A、6B、7F、9V、14、18C、19A、19F和23F)， 莢膜多糖與磁性納米微球的質量比為1: (〇. 5-1)，於室溫下反應6-24小時；其中優化的質 量比為1: 1，於室溫下縮醛反應16小時。反應結束後，用透析袋充分透析，除去未反應磁性 納米微球。
[0143] 2.偶聯體改性
[0144] 取步驟1多糖-磁性納米微球偶聯體30mL，攪拌條件下緩慢滴加2mL25 %戊二酸， 200r/min攪拌反應6小時；反應完畢後，用0. OlMPBS洗滌三次後，定容至30mL，顯微鏡下觀 察磁性納米微球改性情況，使得多糖-磁性納米微球偶聯體表面未與多糖反應的-OH改性 為-CHO ;N2、4°C保存備用。
[0145] 3.與PspA載體蛋白和輪狀病毒蛋白共偶聯
[0146] 0. IMTBS溶液緩衝液下，4°C、pH4. 0-9. 0下，將改性後的多糖-磁性納米微球分別 與輪狀病毒蛋白和PspA蛋白共反應24小時（為保證足量的載體蛋白與磁性納米微球，採 用過量納米載體蛋白加入量，如質量比採用多糖：磁性納米微球=PspA :輪狀病毒蛋白=1 : 1 ：2 ：2) 〇
[0147] 4.綴合疫苗的分離純化
[0148] 用Superdex200凝膠過濾柱（2. 6cmX60cm)進行分離純化，洗脫液為20mM的磷酸 緩衝液（PH7. 4)，流速為3mL/min。收集對應於多糖-磁性納米微球-雙載體蛋白的洗脫峰。
[0149] 製得的綴合疫苗的組成分析
[0150] 用1H-NMR進行檢測所述綴合疫苗，檢測結果見圖1。如圖1所示，與莢膜多糖分 子相比，綴合物在0. 4-1. 4ppm處出現了特徵峰，對應於載體蛋白的脂肪鏈胺基酸殘基。在 7. 2ppm處出現了對應於載體蛋白的芳香族胺基酸殘基的特徵峰。這表明莢膜多糖分子成功 地偶聯了輪狀病毒蛋白和PspA載體蛋白兩種載體蛋白。在6. 2ppm處出現了對應於琥拍醯 亞胺的特徵峰，這表明多糖結合疫苗的連接橋中含有琥珀醯亞胺。此外，5. 2、I. 6、3. 6出線 了 PELA的特徵峰證明磁性納米微球PELA作為連接物。因此，莢膜多糖在結合兩種載體蛋 白前後，其結構未發生明顯改變。
[0151] 通過CL-4B即SEC-MLLS方法檢測多糖蛋白綴合物的分子量分布情況；通過免疫 雙擴的方法使用不同的抗體血清確定多糖蛋白綴合物中的蛋白和多糖種類；通過蒽酮法檢 測多糖蛋白綴合物的多糖含量；Lowry法蛋白含量檢測多糖蛋白綴合物的總蛋白含量，再 通過計算得到綴合物的多糖蛋白結合比（Ratio);輪狀病毒蛋白、PspA蛋白濃度通過酶聯 免疫法檢測。結果表明：在所述綴合疫苗原液中，各物質的濃度比約為：多糖：磁性納米微 球：PspA :輪狀病毒蛋白=1 :1 :1 :1)。
[0152] 對比例1
[0153] 本對比例與實施例1的區別僅在於：製得的疫苗中無磁性納米微粒作為連接體， 而且通過現有技術中提及的方法將雙載體蛋白與多糖綴合而得。
[0154] 對比例2
[0155] 本對比例與實施例1的區別僅在於：製得的疫苗中無 PspA載體蛋白，僅採用多 糖-磁性納米微粒-輪狀病毒載體蛋白為綴合疫苗。
[0156] 實施例2
[0157] 本實施例與實施例1的區別僅在於所述綴合疫苗的載體蛋白為破傷風類毒素載 體蛋白和PspA。
[0158] 製得的綴合疫苗的組成分析結果與實施例1所得結果存在理論誤差範圍內的一 致性。
[0159] 實施例3
[0160] 本實施例與實施例1的區別僅在於：所述綴合疫苗的載體蛋白為輪狀病毒載體蛋 白和破傷風類毒素載體蛋白。
[0161] 製得的綴合疫苗的組成分析結果與實施例1所得結果存在理論誤差範圍內的一 致性。
[0162] 實施例4
[0163] 本實施例與實施例1的區別僅在於：所述綴合疫苗的載體蛋白為輪狀病毒載體蛋 白和嗜血流感桿菌表面蛋白HiD。
[0164] 製得的綴合疫苗的組成分析結果與實施例1所得結果存在理論誤差範圍內的一 致性。
[0165] 實施例5
[0166] 本實施例與實施例1的區別僅在於：所述綴合疫苗的載體蛋白為載體蛋白CRM197 和PspA。製得的綴合疫苗的組成分析結果與實施例1所得結果存在理論誤差範圍內的一致 性。
[0167] 實施例6
[0168] 本實施例與實施例1的區別僅在於：連接體為PLGA磁性納米顆粒。
[0169] 製得的綴合疫苗的組成分析結果與實施例1所得結果存在理論誤差範圍內的一 致性。
[0170] 實施例7
[0171] 本實施例與實施例1的區別僅在於：連接體為PEG磁性納米顆粒。
[0172] 製得的綴合疫苗的組成分析結果與實施例1所得結果存在理論誤差範圍內的一 致性。
[0173] 疫苗評價
[0174] 以下採用免疫原性等疫苗常規效價的評估實驗評估實施例1?7及對比例1?2 所得疫苗的免疫效果：
[0175] A.綴合疫苗免疫原性實驗
[0176] 選取100隻5周齡的雌性Blab/C小鼠，體重為15-22克。隨機分為10組，即實施 例1?7、對比例1?2和陽性對照組（P reVnarl3)，每組10隻小鼠。腹腔注射，每隻每次 注射為5微克，每周注射1次，共注射3次。21天後眼眶取血。用ELISA法檢測小鼠血漿中 抗莢膜多糖的IgG、IgGl和IgG2a。實驗結果見表1
[0177] 表 1
[0178]

【權利要求】
1. 一種綴合疫苗，其特徵在於：所述綴合疫苗為多價肺炎球菌多糖與兩種或兩種以上 的載體蛋白經連接體而成的綴合疫苗，其中，連接體為磁性納米微球。
2. 根據權利要求1所述的綴合疫苗，其特徵在於：所述磁性納米微球的磁性微粒位於 磁性納米微球的內部為核，高分子材料包裹於磁性微粒的外部。
3. 根據權利要求2所述的綴合疫苗，其特徵在於：高分子材料為生物高分子材料，選自 殼聚糖、聚乙二醇、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA)、聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PELA)中的 一種或以上的混合物。
4. 根據權利要求1所述的綴合疫苗，其特徵在於：多價肺炎球菌多糖為多種肺炎球菌 莢膜多糖，優選為分離提純血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖，所述血清型肺炎球菌的血 清型包括 1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、 23F 和 / 或 33F。
5. 根據權利要求1所述的綴合疫苗，其特徵在於：所述載體蛋白選自重組人輪狀病毒 蛋白、白喉類毒素，破傷風類毒素，載體蛋白CRM197,嗜血流感桿菌表面蛋白HiD，百日咳 Prn表面蛋白，百日咳Fha抗原和/或肺炎球菌表面蛋白A。
6. 根據權利要求1所述的綴合疫苗，其特徵在於：所述載體蛋白中的一種為嗜血流感 桿菌表面蛋白HiD或肺炎球菌表面蛋白A。
7. 根據權利要求1所述的綴合疫苗，其特徵在於：重組人輪狀病毒蛋白為P基因型輪 狀病毒蛋白的部分胺基酸序列或全序列。
8. 根據權利要求1所述的綴合疫苗，其特徵在於：重組人輪狀病毒蛋白的病毒株為P 基因型輪狀病毒毒株P[8]、P[4]、P[6]或P[ll]中的一種。
9. 權利要求1?8任一所述綴合疫苗的製備方法，其特徵在於：將多價肺炎球菌多糖 與兩種或以上的載體蛋白分別與磁性納米微球經偶聯而成。
10. 根據權利要求9所述的綴合疫苗的製備方法，其特徵在於，具體包括以下步驟： a) 分別分離提純多種血清型肺炎球菌莢膜上的莢膜多糖； b) 分別製備並分離提純所選用的多種載體蛋白； c) 分別將各種莢膜多糖與磁性納米微球偶聯成多糖-磁性納米微球偶聯體； d) 再將多糖-磁性納米微球偶聯體分別與多種載體蛋白偶聯結合； e) 分離純化步驟d)所得偶聯體成所述綴合疫苗原液。
【文檔編號】A61K39/116GK104225589SQ201410491388
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月23日 優先權日:2014年7月25日
【發明者】吳克, 史晉, 鮑路偉, 劉昊智 申請人:武漢博沃生物科技有限公司