應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法
2023-09-19 02:18:15
專利名稱：應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法
技術領域：
本發明涉及到獸用生物製品技術領域，具體涉及一種應用生物反應器工業化生產 豬細小病毒疫苗的方法。
背景技術：
豬細小病毒病(porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要疾病之一。 懷孕母豬主要表現為流產、死胎、木乃伊胎、弱仔等，以頭胎母豬最為嚴重，給全球的養豬業 造成巨大的經濟損失。目前對豬細小病毒的防治主要是以免疫預防為主，由於PPV血清型 單一及其高免疫原性，使得疫苗接種成為控制該病感染的一種行之有效的方法。目前在我國廣泛應用的疫苗為豬細小病毒滅活疫苗，疫苗的生產採用的是傳統的 轉瓶工藝，該工藝在我疫苗行業已經使用了數十年，其操作技術相對簡單和成熟。但是每個 轉瓶均是獨立的細胞培養單元，每瓶細胞的質量、病毒產量和滴度都不同，導致疫苗批間差 異大，而且操作勞動強度大，生產效率低，隱性汙染引起的高內毒素等缺點，已經越來越不 適應當前疫苗大規模生產的要求。
發明內容
本發明為了克服豬細小病毒疫苗現有生產方法的缺陷，提供一種應用生物反應器 工業化生產豬細小病毒疫苗的方法，其優點是設備佔地面積小、生產規模大；自動化控制程 度高，生產效率好；培養設備密閉，不易汙染；副產物少，疫苗的副反應小；生產的病毒液效 價高，疫苗質量穩定。本發明的技術方案為應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)將微載體和生物反應器滅菌後，加入細胞生長液，接種制苗用細胞進行培養，待微載體 上的細胞形成緻密的單層，接種豬細小病毒，並繼續培養，使病毒繁殖；所述的制苗用細胞 為對豬細小病毒毒株敏感的細胞，且細胞為IBRS-2、PK-15或ST細胞；⑵待細胞病變達到 80%以上時，停止培養，收穫病毒液；C3)對收穫的病毒液進行超濾濃縮和病毒滅活；(4)通 過柱層析方法純化滅活的病毒製成疫苗。所述的生物反應器設定參數為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、 攪拌速度30 lOOrpm。考慮到細胞培養的最適條件，優選的pH 6. 9 7. 3、細胞培養階段 溫度設定37°C，病毒培養階段溫度設定35°C、溶氧50%、攪拌速度30 lOOrpm。所述病毒的接種量為0. 0001 0. 1M0I。所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2 25g/L。所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。所述的生物反應器容積為14 150L。制苗用細胞可採用14L 40L或14L 40L 150L逐級放大的培養模式，即通過胰酶將14L生物反應器培養的細胞消化下來，作為 種子細胞接種到40L的生物反應器，再將40L的反應器內培養的細胞消化下來作為種子細胞接種到150L生物反應器，如此形成生物反應器之間的逐級放大培養過程，從而避免了單 純的用轉瓶培養種子細胞而容易造成汙染和增加勞動強度的缺陷；或，直接用14L、40L或 150L的生物反應器培養病毒。所述的生物反應器的培養採用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率根據細 胞的密度以每天0. 5 4個工作體積。本發明採用生物反應器微載體培養技術進行細胞的高密度培養，生產豬細小病毒 疫苗，與傳統的轉瓶生產工藝相比，自動化控制程度高，生產可實時監控；節省人力，降低 成本；生產用地少，規模易於擴大；生產的病毒滴度高，批間差異小，產品質量穩定，副反應
圖1為本發明的工藝流程圖。圖加為細胞接種後4h的微載體細胞圖片。圖2b為接毒後細胞狀態的微載體細胞圖片圖3為細胞生長曲線。
具體實施例方式以下是本發明一個具體的實施方案，以進一步的闡述本發明，但不能解釋為限制 本發明的範圍。實施例1生物反應器美國NBS公司14L和40L生物反應器；微載體=Cytodex-I (美國通用電氣醫療集團生命科學部)；豬細小病毒冊-I株；細胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公 司)；病毒維持液含體積濃度為小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公 司)；細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodexl，水化後， 用pH7. 2的磷酸鹽緩衝液PBS淘洗2遍，滅菌，接種IBRS-2細胞，進行培養；培養的方法參數 為pH7. 2、溫度37°C、D050%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取樣觀察細胞生長情況，進 行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到1. 5X 106/ml時，開始灌注，灌注的速度 依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維持細胞的生長，培養4 5天，細胞的密度達到7 X 106/ml。微載體培養的放大待14L生物反應器細胞的密度達到7X 106/ml，將長滿細胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度為0. 02% EDTA的pH7. 2的PBS緩衝液清洗 細胞兩次，加入37°C預熱的含質量濃度為0. 02% EDTA、質量濃度為0. 25%胰酶的胰酶消化 液，消化8min，排出多餘的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘餘胰酶的消化，啟動容器攪拌 使其充分分散消化的細胞，然後將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按照上 述的培養方法進行培養。4
病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到8X106/ml，更換成病毒維持液，按 照0. 01M0I接種豬細小病毒；接毒後他開始灌注培養，以維持病毒繁殖所必需的營養物質， 待細胞病變達到80%以上時，同時收穫病毒液，測定病毒含量8. Ol0gTCID5ciAil，，將收穫的 病毒液置於2 8°C中，並保存在-20°C。病毒濃縮、純化、配苗將上述收穫的病毒液用10萬截留分子量的超濾膜包濃縮 10倍，按滅活劑與病毒濃縮液體積比為1 2000加入質量濃度為37%甲醛溶液滅活劑進 行滅活後，再經過凝膠層析柱^^11虹0^ 4FF柱層析得到純化疫苗；按抗原和油佐劑1 1 比例加入油佐劑，乳化配製成滅活疫苗。油佐劑的配製為94% (V/V)白油、6% (V/V)的 Span-80,2% (g/V)硬脂酸鋁。實施例2生物反應器美國NBS公司14L和40L生物反應器；微載體=Cytodex-I (美國通用電氣醫療集團生命科學部)；豬細小病毒冊-I株；細胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公 司)；病毒維持液含體積濃度為小牛血清的DMEM(北京清大天一生物技術有限公 司)；細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodex-Ι，水化後， 用pH7. 2的磷酸鹽緩衝液PBS淘洗2遍，滅菌，接種PK-15細胞，進行培養；培養的方法參數 為pH7. 2、溫度37°C、D050%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取樣觀察細胞生長情況，進 行細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到1.5X 106/ml時，開始灌注，灌注的速度 依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0. 5 4個工作體積，以維持細胞的生成，培養4天， 細胞的密度達到7 X 106/ml。微載體培養的放大待14L生物反應器細胞的密度達到7X 106/ml，將長滿細胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度為0. 02% EDTA的pH7. 2的PBS緩衝液清洗 細胞兩次，加入37°C預熱的含質量濃度為0. 02% EDTA、質量濃度為0. 25%胰酶的胰酶消化 液，消化lOmin，排出多餘的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘餘胰酶的消化，啟動容器攪 拌使其充分分散消化的細胞，然後將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按照 上述的培養方法進行培養。病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到8X106/ml，更換成病毒維持液，按 照0. 01M0I接種豬細小病毒；接毒後他開始灌注培養，以維持病毒繁殖所必需的營養物質， 待細胞病變達到80%以上時，同時收穫病毒液，測定病毒含量7. 81ogTCID5(1/ml，將收穫的 病毒液置於2 8°C中，並保存在-20°C。病毒濃縮、純化、配苗將上述收穫的病毒液用10萬截留分子量的超濾膜包濃縮 50倍，按滅活劑與病毒濃縮液體積比為1 2000加入37%甲醛溶液滅活劑進行滅活後，再 經過凝膠層析柱kpharose 4FF柱層析得到純化疫苗；按抗原和油佐劑1 1比例加入油 佐劑，乳化配製成滅活疫苗，油佐劑的配製為94% (V/V)白油、6% (V/V)的Span-80，2% (g/V)硬脂酸鋁。實施例3
生物反應器美國NBS公司14L和40L生物反應器；微載體=Cytodex-I (美國通用電氣醫療集團生命科學部)；豬細小病毒冊-I株；細胞生長液含體積濃度為8%小牛血清的DMEM/F12 ；病毒維持液含體積濃度為1 %小牛血清的DMEM/F12 ；細胞培養分別在14L生物反應器內，按照10g/L的濃度加入Cytodexl，水化後， 用pH7. 2的磷酸鹽緩衝液PBS淘洗2遍，滅菌，接種ST細胞，進行培養；培養的方法參數為 PH7. 2、溫度37°C、D050%、攪拌速度30 IOOrpm ；每天定時取樣觀察細胞生長情況，進行 細胞計數，測定葡萄糖的消耗，當細胞的密度達到1 1.5X106/ml時，開始灌注，灌注的 速度依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天0.5 4個工作體積，培養4d，細胞的密度達到 7X106/ml。微載體培養的放大待14L生物反應器細胞的密度達到7X 106/ml，將長滿細胞的 微載體收集到特定密閉容器中，用含質量濃度為0. 02% EDTA的pH7. 2的PBS緩衝液清洗 細胞兩次，加入37°C預熱的含質量濃度為0. 02% EDTA、質量濃度為0. 25%胰酶的胰酶消化 液，消化lOmin，排出多餘的胰酶溶液，加入細胞生長液，終止殘餘胰酶的消化，啟動容器攪 拌使其充分分散消化的細胞，然後將消化分散的細胞懸液接種到40L的生物反應器，按照 上述的培養方法進行培養。病毒繁殖當40L生物反應器細胞的密度達到8X106/ml，更換成病毒維持液，按 照0. 01M0I接種豬細小病毒；接毒後他開始灌注培養，以維持病毒繁殖所必需的營養物質， 待細胞病變達到80%以上時，同時收穫病毒液，測定病毒含量7. 81ogTCID5(1/ml，將收穫的 病毒液置於2 8°C中，並保存在-20°C。病毒濃縮、純化、配苗將上述收穫的病毒液用10萬截留分子量的超濾膜包濃縮 30倍，按滅活劑與病毒濃縮液體積比為1 2000加入質量濃度為37%甲醛溶液滅活劑進 行滅活後，再經過凝膠層析柱^^11虹0^ 4FF柱層析得到純化疫苗；按抗原和油佐劑1 1 比例加入油佐劑，乳化配製成滅活疫苗。油佐劑的配製為94% (V/V)白油、6% (V/V)的 Span-80,2% (g/V)硬脂酸鋁。
權利要求
1.應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法，其特徵在於包括如下步驟 (1)將微載體和生物反應器滅菌後，加入細胞生長液，接種制苗用細胞進行培養，待微載體 上的細胞形成緻密的單層，接種豬細小病毒，並繼續培養，使病毒繁殖；所述的制苗用細胞 為對豬細小病毒毒株敏感的細胞，且細胞為IBRS-2、PK-15或ST細胞；⑵待細胞病變達到 80%以上時，停止培養，收穫病毒液；(3)對收穫的病毒液進行超濾濃縮和病毒滅活；(4)通 過柱層析方法純化滅活的病毒製成疫苗。
2.根據權利要求1所述的應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法，其特徵 在於所述的生物反應器設定參數為pH 6. 5 7. 8、溫度33 37°C、溶氧30 80%、攪拌 速度30 lOOrpm。
3.根據權利要求1所述的應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法，其特徵 在於病毒的接種量為0. 0001 0. IMOI。
4.根據權利要求1 3之一所述的應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方 法，其特徵在於所述的生物反應器容積為14 150L ；或，制苗用細胞經過14L 40L或 14L 40L 150L逐級放大培養後，於40L或150L生物反應器培養狂犬病毒；或，直接用 14L、40L或150L的生物反應器培養病毒。
5.根據權利要求1 3之一所述的應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方 法，其特徵在於所述的微載體為Cytodex系列微載體，微載體的使用密度為2 25g/L。
6.根據權利要求1 3之一所述的應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方 法，其特徵在於所述的生物反應器為攪拌式生物反應器。
7.根據權利要求1 3之一所述的應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方 法，其特徵在於所述的生物反應器的培養採用批式、流加或灌注培養的方式，灌注的速率 根據細胞的密度為每天0. 5 4個工作體積。
全文摘要
本發明提供一種應用生物反應器工業化生產豬細小病毒疫苗的方法，包括如下步驟(1)將微載體和生物反應器滅菌後，加入細胞生長液，接種制苗用細胞進行培養，待微載體上的細胞形成緻密的單層，接種豬細小病毒，並繼續培養，使病毒繁殖；(2)待細胞病變達到80％以上時，停止培養，收穫病毒液；(3)對收穫的病毒液進行超濾濃縮和病毒滅活；(4)通過柱層析方法純化滅活的病毒製成疫苗。本發明具有工藝參數可控性好，細胞密度高，病毒效價高，疫苗安全性好、質量穩定可靠，生產效率高等優點。
文檔編號C12R1/93GK102038945SQ20101028213
公開日2011年5月4日 申請日期2010年9月15日 優先權日2010年9月15日
發明者劉漢平, 朱薇, 李偉, 李晶梅, 溫文生, 漆世華, 秦紅剛, 靖志強 申請人:武漢中博生物股份有限公司