用於治療退變性病症的ledgf肽及其製劑的製作方法

2023-09-19 01:00:15 1

用於治療退變性病症的ledgf肽及其製劑的製作方法
【專利摘要】本發明提供具有抗蛋白質聚集活性的LEDGF肽和使用方法。本文公開的LEDGF肽顯示治療退變性疾病和具有包括氧化應激和蛋白質聚集應激的各種細胞應激的疾病的能力。此外，本發明提供延長釋放製劑，包括適於眼部施用的製劑。
【專利說明】用於治療退變性病症的LEDGF肽及其製劑
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2012年5月21日提交的美國臨時專利申請號61/649, 847和2012年 11月16日提交的國際專利申請號PCT/US2012/065620的優先權。以上確認的優先權申請 的內容據此以引用的方式完全併入本文。

【技術領域】
[0003] 本發明大體上涉及用於治療退變性疾病和具有包括氧化應激和蛋白質聚集應激 的各種細胞應激的疾病的新型晶狀體上皮源性生長因子（LEDGF)肽及其組合物。更具體來 說，本發明涉及具有增強的穩定性和持續的遞送分布的新型LEDGFh 26製劑和它們治療蛋白 質聚集介導的疾病、老年性疾病和退變性疾病的用途。
[0004] 背景
[0005] 在美國，包括老年性黃斑變性（AMD)和視網膜色素變性（RP)的眼後段疾病是致 盲的主要病因。（Jager等，N Em J MED，2008. 358(24) :2606-17)。當前，在美國約800萬 個體正摧患AMD,並且截至2020年，預期這個數目會達到1200萬。（Jager等；Friedman等 Arch 0phthalmol，2004. 122(4):第564-72頁）。與慢性氧化應激和炎症相關的乾性形式 的 AMD (乾性 AMD)佔 AMD 病例的 90%。（Libby 等 Adv Exp Med Biol，2010. 664:第 403-9 頁；Stuen. Generations，2003. 27 :第8-14頁）。另一方面，RP是一種由超過50個不同基 因突變引起的遺傳疾病。（〇hguro，H.等，Nihon Ganka Gakkai Zasshi，2002. 106(8):第 461-73 頁；Dryja，，等，Nature，1990. 343 (6256):第 364-6 頁。）全世界約 150 萬人當前罹 患 RP。（Hartong 等，Lancet，2006. 368 (9549):第 1795-809 頁）。
[0006] 眼的獨特解剖結構和生理機能是針對眼背面（包括視網膜退變性疾病）的藥物 治療劑進步的主要障礙。（Kompella等，Ther Deliv.l(3):第435-56頁）。由於存在各 種靜態屏障（角膜、結膜和鞏膜以及其它組織）和動態屏障（眨眼、淚膜、淚翻轉和誘發的 流淚），表面施用途徑在向眼背面遞送藥物方面是低效的。（Gaudana，R.等，Ocular drug delivery. Aaps J，2010. 12(3):第 348-60 頁；Thrimawithana 等 Drug Discov Today， 2011. 16 (5-6):第270-7頁）。另一方面，血液視網膜屏障（BRB)、全身性降解、全身性副作用 和在靶標部位處濃度較低是靜脈內途徑的主要挑戰。如前眼房內、眼周、視網膜下的其它途 徑具有它們自身的一小組問題，所述問題與表面和全身性施用途徑共有一些爭論點（Baid 等 Drug Development and the back ofthe eye. Kompella UB 編.2〇10,第 4〇9-448 頁： Springer)。如玻璃體內注射的局部遞送將藥物放置在緊密鄰近視網膜（視網膜退變性疾 病的靶標組織）處且因此是向視網膜遞送藥物的最有效途徑。然而，頻繁玻璃體內注射藥 物會導致各種併發症，如視網膜脫離、視網膜出血、眼內炎、眼內壓增加，而更不必提及患者 順應性和感染。（Peyman 等 Retina，2009. 29(7):第 875-912 頁· ；Wu 等 Semin Ophthalmol， 2009.24(2):第100-5頁）。因此，對可延長藥物在眼中的保留的組合物和遞送系統存在需 要。
[0007] 新型藥物遞送系統已贏得較大關注，其可持續延長時期來持續或控制釋放藥物以 及增加如蛋白質、基因和其它小分子的治療劑的穩定性和生物可用度。生物可降解（PLGA、 PCL)和非生物可降解（例如維曲賽特（Vitraset)和萊替舍特（Retisert))植入物提供用 於歷經數月至數年持續釋放藥物的平臺。然而，生物可降解植入物的不穩定藥物釋放分布 以及要求高度侵襲性眼手術是少許缺點。微米顆粒和納米顆粒持續數周至數月提供囊封的 分子的持續釋放。然而，在製備期間使用如二氯甲烷的有機溶劑會使蛋白質變性且降低蛋 白質功效，從而導致治療無效。此外，囊封效率、控制的顆粒尺寸和製備期間的無菌性是其 它障礙。也已嘗試基於離子電滲、微針、超聲的眼部遞送，然而，主要進步是就小分子藥物而 言，且仍然處於探究階段並且需要驗證以確定它們的功效和安全性。因此，隨著湧現的用於 視網膜變性的療法獲得不斷提高的進步，向後段的非侵襲性或最小侵襲性控制和持續遞送 正變得極其重要。
[0008] 概述
[0009] 本發明涉及可以高數量、高純度或兩者產生的LEDGF生物活性肽。舉例來說，如 通過SDS-PAGE和SEC-HPLC所定量，本發明涉及可在每升培養物20mg或大於20mg下且在 90 %或大於90 %純度下產生的LEDGF肽。在一個示例性實施方案中，肽是約40kDa單體，其 可以SOkDa二聚體形式存在。在另一示例性實施方案中，肽主要具有無規捲曲結構且包括 N末端應激相關的結合結構域和任選TAT結合結構域。
[0010] 在另一示例性實施方案中，肽包含LEDGF的胺基酸I-SZe(LEDGF1I 26)。在另一示 例性實施方案中，肽包含SEQ ID NO :2。在另一示例性實施方案中，肽包含與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨 基酸序列。此外，本發明包括編碼SEQ ID NO :2的核酸序列或編碼與SEQ ID NO :2具有至 少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的胺基酸序列 的核酸序列。本發明還包括含有所述核酸序列的載體。在一個示例性實施方案中，載體是 pET-28a(+)載體。
[0011] 在另一方面，本發明包含含有LEDGF肽的組合物。在一個示例性實施方案中，組合 物包含LEDGF肽與藥物載體、稀釋劑、賦形劑或其組合的組合。在另一示例性實施方案中， 組合物包含與如鋅的膠態金屬顆粒締合或結合以形成納米裝配體的LEDGF肽。在另一示例 性實施方案中，組合物包含囊封或結合於裝載至多孔外部顆粒中的內部顆粒的LEDGF肽。 在某些示例性實施方案中，用於以上組合物中的LEDGF肽是LEDGF 1I6。
[0012] 在另一方面，本發明涉及通過向有需要的患者施用以上LEDGF肽組合物來治療蛋 白質聚集介導的疾病的方法。在某些示例性實施方案中，蛋白質聚集介導的疾病是視網 膜變性疾病。示例性視網膜變性疾病包括但不限於老年性黃斑變性（AMD)、視網膜色素變 性（RP)和糖尿病性視網膜病變（DR)。在另一示例性實施方案中，蛋白質聚集介導的疾病 是神經退變性疾病，包括但不限於阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD)、帕金森氏病 (Parkinson's disease, F1D)、亨廷頓氏病（HD)、肌萎縮性側索硬化或朊病毒疾病。
[0013] 附圖簡述
[0014] 圖1是純化全長LEDGF的免疫印跡，其指示試圖純化全長LEDGF會產生不穩定和 片段化產物。
[0015] 圖2是比較全長LEDGF與LEDGFh26的圖。
[0016] 圖3是瓊脂糖凝膠的圖片，其顯示編碼LEDGF1I26的核酸序列被成功克隆至 pET-28a(+)中。PCR擴增Ledgf^326基因且接著連接至pET-28a(+)載體中。泳道1:PCR 擴增的Ledgf ^26基因，泳道2 :未切割環狀pET-28a (+)，泳道3 :線性化BamHI消化的 pET-28a (+)，泳道 4 :未切割環狀 pLEDGFn (連接有 LedgfV32f^ pET-28a (+))，泳道 5 :線 性化BamHl消化的PLEDGFh26，泳道6 :線性化HindIII消化的PLEDGFh26，泳道7 和 HindIII 雙重消化的 PLEDGFh26，泳道 8 :自 PleDGFh26PCR 擴增 Ledgf基因。
[0017] 圖4A至4C是一組顯示成功表達和純化LEDGF1I的圖：A) SDS-PAGE-泳道1蛋 白質標記（Fermentas，Glen Burnie，MD),泳道2未誘導的細胞溶解產物，泳道3IPTG誘導 的細胞溶解產物，泳道4溶解產物的可溶性部分，泳道5由FPLC-陽離子交換管柱獲得的 LEDGFn，泳道6由FPLC-凝膠過濾管柱獲得的LEDGFn5B) FPLC-陽離子交換色譜圖；C) FPLC-凝膠過濾色譜圖。
[0018] 圖5A至是一組顯示LEDGF1I2J^某些物理特徵的圖。A) SEC-HPLC :使用含有ImM CaClj^]25mM Tris-HCL緩衝液（pH 7.0)在Agilent Bio-SEC管柱上按尺寸分離LEDGF^6。 LEDGF1I6主要洗脫為在11. 5分鐘時的單峰，伴有約5%較高分子量物質。B)MALDI-T0F : LEDGF1I6具有分子量40kDa，並且可以二聚體形式存在。C)DLS :使用Nano ZS在25mM磷酸 鹽緩衝液（pH 7.0)中分析LEDGF1I6尺寸。LEDGF 具有直徑約IOnm的單分散群體，不存 在聚集體。D) SDS-PAGE :在4-15% SDS-PAGE膠凝上在還原性（β -巰基乙醇且煮沸）和非 還原性（無 β-巰基乙醇且不煮沸）條件下按尺寸分離LEDGFm26。非還原性膠凝指示存在 LEDGF1J6 的二聚體。
[0019] 圖6Α至6Β是一組代表關於LEDGF1I的預測結構特徵的其它數據的圖。Α)圓 二色性：使用Chirascan分析25mM磷酸鹽緩衝液（ρΗ7· 0)中的500 μ g/ml LEDGF1^26的二 級結構。未獲得α-螺旋或β-摺疊的特徵峰。此外，在200nm下存在強烈陰性信號指示 LEDGF1I6主要是無規捲曲蛋白質。B)LEDGF 模型：通過I-Tasser蛋白質建模伺服器 基於LEDGF1I6的胺基酸序列和與結構可在蛋白質資料庫中獲得的蛋白質的同源性來預測 LEDGF^J-D結構。根據3-D模型，LEDGF1I6是無規捲曲蛋白質。
[0020] 圖7A至7F提供代表關於LEDGF^j^預測結構特徵的其它數據的其它圖。螢光光 譜術-化學變性：A)在激發波長280nm下自300至400nm記錄與含0-6M脲的25mM磷酸鹽 緩衝液（pH 7.0) -起孵育的300μ/πι1 LEDGF1I26的螢光光譜。B)將340/356nm下的螢光 強度比率相對於脲濃度繪圖以確定構象穩定性參數。C)自220至260nm記錄與含0-6M脲的 25禮磷酸鹽緩衝液（?!17.0)-起孵育的30(^8/11111^6? 1_326的〇)光譜。0)將23011111下 的CD信號相對於脲濃度繪圖以確定構象穩定性參數。E)使用熱使LEDGF^/變性且自215 至250nm記錄相應⑶信號變化。F)將222nm下的⑶信號相對於溫度繪圖以確定LEDGF 1J6 的熔解溫度。
[0021] 圖8A至8B是一組顯示LEDGFp32fJg夠從聚集介導的應激中挽救ARPE-19細胞的 圖。ARPE-19細胞在A)不存在或B)存在聚集應激下用LEDGFh 26處理48小時。
[0022] 圖9A至9B是一組說明LEDGF1I延遲RCS大鼠中的光受體功能性損失的圖。A) 使用〇.41og cd-s/m2閃光記錄暗視ERG，並且將暗視B波幅值相對於大鼠年齡繪圖。對於 明視ERG，使用30cd/m 2背景光使大鼠適應光照3分鐘，隨後記錄ERG。B)將明視B波幅值 相對於大鼠年齡繪圖。將個別大鼠的三個ERG平均化且接著將各組內的b波幅值平均化以 得到平均值。數據代表N = 3的平均值土 S. D.。*，相較於相應未處理組，p < 0. 05。
[0023] 圖10是一組顯示LEDGFn6/鋅納米裝配體在稀釋之後穩定的圖。
[0024] 圖IlA至IlC是一組顯示在不存在或存在添加劑下的LEDGF1-326三級結構、二級 結構和尺寸變化的圖。
[0025] 圖12是在還原性條件下裝載的LEDGFn6W SDS-PAGE膠凝圖片。
[0026] 圖13A至13B是一組顯示在存在和不存在各種添加劑下LEDGF1I26的可溶性蛋白 質和不溶性聚集體的量的圖。
[0027] 圖13C是顯示在存在各種添加劑下不存在LEDGFn6的不溶性聚集體的微量離心 管圖片。
[0028] 圖14是描繪在存在和不存在各種添加劑下LEDGF1I6的免疫反應性的圖。
[0029] 圖15A至15C是一組顯示在添加劑存在下LEDGF1I2J^結構完整性和構象穩定性的 生物物理學表徵的圖。A)在各種添加劑存在下，在280nm激發下，1^06匕_ 326在34211111下的 隨時間而變的螢光強度。抝1^06匕_326在208nm下的隨時間和添加劑而變的圓二色性（CD)。 C) LEDGFm26的隨時間和添加劑而變的流體動力學尺寸。
[0030] 圖16是提供LEDGF1I隨時間而變的分子量分析的SDS-PAGE膠凝圖片。
[0031] 圖17A至17D是一組顯示在鋅存在下的LEDGF^gA米裝配體形成的圖。A)動態 光散射。1^06? 1_326在鋅存在下形成納米裝配體。B)圓二色性。在鋅存在下，LEDGF^dA 二級結構被改變。C)螢光光譜術。在鋅存在下，LEDGFh26-光光譜被淬滅，從而指示疏水 性殘基暴露於極性更大環境。D)紫外光譜術：在0. ImM和ImM鋅存在下而非在IOmM鋅下， LEDGFh26紫外吸收被淬滅。
[0032] 圖18是LEDGF1I6鋅納米裝配體的一組TEM圖像。
[0033] 圖19A至19D是一組說明LEDGF1I^米裝配體的可逆形成的圖。
[0034] 圖20A至20D是說明LEDGF^jA米裝配體的穩定性隨時間增加的一組圖和 SDS-PAGE膠凝圖像。
[0035] 圖21是說明ARPE-19細胞對LEDGF1I^米裝配體的攝取增加的圖。
[0036] 圖22是描繪MTT測定的結果的圖，其說明LEDGF1I納米裝配體能夠從血清飢餓 中挽救ARPE-19細胞。
[0037] 圖23A至23D是一組說明如使用視網膜電描記術所考查，LEDGF1I 26納米裝配體能 夠降低視網膜變性的圖。
[0038] 圖24A至24H是一組說明如通過檢測正常SD大鼠中的Alexa-LEDGF1I 2f^螢光信 號所測量，LEDGF1I6納米裝配體在玻璃體中持續至少14天的圖。A)說明在玻璃體內注射 SD大鼠眼之前，空白掃描的結果。B)和C)分別說明對照和LEDGF1I6裝配體的標準曲線。 D) 和E)說明如由Flurotron掃描獲得的在包括玻璃體、脈絡膜-RPE和水狀液的各種組織 中的螢光信號；F)、G)和H)分別使以上測量的玻璃體、脈絡膜-RPF和水狀液的螢光信號轉 換成實際LEDGF^ 26納米裝配體。
[0039] 圖25是說明納米裝配體能夠保持LEDGF1I的免疫反應性的圖。
[0040] 圖26A至26B是A)用LEDGF1I26轉染的ARPE-19細胞的細胞計數測定的一組圖像 以及B)說明細胞計數測定的結果隨時間和LEDGF 1I^度而變的圖。
[0041] 圖27是說明測定結果的圖，其指示用LEDGF1I轉染的ARPE-19細胞中的吞噬活 性增加。
[0042] 圖28A至28D是一組說明對用LEDGF1I6注射的SD大鼠眼的組織學分析的結果的 圖像和圖。A)是對眼垂直截面和玻璃體內注射部位的圖示描繪。B)是正常SD、未處理RCS 和LEDGF1I6處理的RCS視網膜的橫截面的一組圖像。C)和D)是分別描繪對照和LEDGF 處理的視網膜中的眼外核層和內核層的測量厚度的圖。
[0043] 圖29是對照和LEDGFu處理的大鼠 SD視網膜的免疫螢光圖像的圖面。
[0044] 圖30是顯示His-LEDGFp326自示例性PinP組合物累積釋放的圖
[0045] 圖31是顯示在大鼠眼中用Alexa-His-LEDGFn6進行玻璃體內注射之後的非侵襲 性眼螢光光度法的結果的圖。
[0046] 詳述
[0047] 定義
[0048] 如本文所用，"視網膜和視網膜性"是指視網膜以及鄰近於視網膜的一般性眼後段 兩者。
[0049] 如本文所用，"治療"是指完全逆轉或消除潛伏疾病、臨時或持續防止疾病進展、臨 時或持續消退疾病、以及改善一種或多種與疾病相關的症狀。
[0050] 術語"肽"、"多肽"和"蛋白質"在本文中可互換使用。除非另外指示，否則所述術 語是指具有至少兩個通過肽鍵連接的胺基酸的聚合物。因此，所述術語包括寡肽、蛋白質片 段、類似物、衍生物、糖基化衍生物、聚乙二醇化衍生物、融合蛋白等。
[0051] 如本文所用，"序列同一性/類似性"是指兩個或更多個胺基酸序列的同一性、類 似性。序列同一性可以同一性百分比來量度，百分比越高，序列越相同。比對方法和供比較 的序列在本領域中是熟知的。各種程序和比對算法描述於Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2 :482,1981 ;Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443 ;Pearson 和 Lipman, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 :2444,1988 ;Higgins 和 Sharp，Gene，73 :237-44,1988 ;Higgins 和 Sharp，CABI0S 5 :151-3,1989 ;Corpet 等 Nuc. Acids. Res. 16 :10881-10,1990 中，所述文獻 呈現對序列比對方法和同源性計算的詳述考慮。
[0052] NCBI 基本局部比對研究工具（BLAST) (Altschule 等 J. Mol. Biol. 215 :403-10， 1990)可自若干來源，包括國家生物信息中心（NCBI，National Library of Medicine， Building 38A，Room 8N805, Bethesda，MD 20894)和在網際網路上獲得以與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx關聯使用。Blastp用於比較胺基酸序列。其 它信息可見於NCBI網站。
[0053] -般來說，一旦對準，即通過對相同胺基酸殘基存在於兩個序列中所處的位置的 數目計數來確定匹配的數目。同一性百分比是通過用匹配的數目除以鑑定的序列中闡述的 序列長度或連貫長度（如來自鑑定的序列中闡述的序列的100個連續核苷酸或胺基酸殘 基），隨後用100乘以所得值來確定。
[0054] 引言
[0055] 全長LEDGF能夠從P23H突變視紫紅質（rhodopsin)聚集誘導的應激中挽救視網 膜色素上皮細胞（Baid等，PLoS One. 6(9):第e24616頁）。然而，由於要求蛋白質維持特 定三維結構以保持生物活性，所以在蛋白質可用作治療劑的水平上使基因翻譯成蛋白質已 始終具有挑戰性。此外，由於在整個生物合成和純化過程期間缺乏蛋白質穩定性，所以生產 和生物合成常常失敗。此外，為有效使用蛋白質治療劑，常常必須達成數毫克產量以有效表 徵蛋白質性質。舉例來說，每500ml僅產生0. 9mg全長LEDGF，遠低於為適當表徵蛋白質所 需的數十毫克，並且會產生片段化產物。
[0056] 本發明提供維持全長蛋白質的細胞存活活性，同時允許以高數量和純度產生和純 化LEDGF肽的LEDGF肽。此外，本發明的LEDGF肽具有抗蛋白質聚集活性。本發明的LEDGF 肽顯示治療退變性疾病和與包括氧化應激和蛋白質聚集應激的各種細胞應激相關聯的疾 病的能力。因此，如本發明的LEDGF肽的分子可代表一種用於治療多種蛋白質聚集介導的 疾病，包括其它視網膜退變性和神經退變性疾病的通用治療性蛋白質。本發明還包含適用 於治療以上疾病的延長釋放LEDGF肽製劑。
[0057] LEDGF 肽
[0058] 本發明的LEDGF肽含有全長LEDGF的N末端肽。在一個示例性實施方案中，LEDGF 肽包含LEDGF N末端應激相關的結合結構域。儘管不受以下理論限制，但LEDGF充當轉錄 因子且啟始其它應激反應基因的轉錄的能力可有助於LEDGF肽保護免遭蛋白質聚集介導 的疾病的能力。或者，LEDGF肽可直接或通過其它中間蛋白質結合錯誤摺疊的蛋白質，並且 有助於正常摺疊或錯誤摺疊的蛋白質的泛素化以確保蛋白水解降解。在某些示例性實施方 案中，LEDGF肽可還包含TAT結合結構域。
[0059] 在一個示例性實施方案中，LEDGF肽是LEDGF1J6 (SEQ ID NO: 2)。LEDGFh26被純 化至接近均質。LEDGF^6S要具有無規捲曲結構，在室溫下穩定，並且以40kDa單體和/或 80kDa二聚體形式存在。如以下實施例章節中進一步詳細所述，LEDGFp 32fJg夠防止ARPE-19 細胞中P23H突變視紫紅質介導的聚集應激。單次玻璃體內注射1^06?1_ 326使視網膜退變性 大鼠模型中的光受體功能性損失降低超過八周。
[0060] 本發明的LEDGF肽也包括與LEDGFh26具有至少約70 %、至少約75 %、至少約 80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列同一性的LEDGF肽。在一個示例性實施 方案中，LEDGF肽包括涵蓋全長LEDGF的N末端應激相關的結合結構域且與LEDGFm 26具有 至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列同一 性的肽。在另一示例性實施方案中，LEDGF肽包括具有N末端應激相關的結合結構域和TAT 結合結構域且與LEDGF1I6具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少 約90%或至少約95%序列同一性的肽。此外，本發明包括涵蓋大於或小於SEQ ID NO :2的 326個胺基酸的肽，其中較大或較小肽不導致在生物合成和純化期間LEDGF生物活性或穩 定性顯著降低。LEDGF肽供與本發明一起使用的適合性可由本領域普通技術人員通過使用 以下實施例章節中所述的測定評估推定肽與生物物理學和生物化學性質和生物活性的類 似性來確定。普通技術人員可預測地認識到與LEDGF 1I6具有類似生物物理學性質、生物化 學性質和生物活性的LEDGF肽將具有類似效用且因此屬於本發明的範圍。
[0061] 在某些示例性實施方案中，上述LEDGF肽是以合成方式製備。在某些其它示例性 實施方案中，上述LEDGF肽是以重組方式製備。適於表達LEDGF肽的宿主包括但不限於大腸 桿菌（E.coli)、酵母屬（Saccharomces)、畢赤酵母屬（Picchia)、桿菌屬（Bacillus)、CH0、 BHK、COS 和 NSO 細胞。
[0062] 標準藥物製劑
[0063] 本文所述的LEDGF肽可使用已知技術提供為生理可接受的製劑。由E. W. Martin 所著的 Remington, s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 19 版（1995))描述適於藥物遞送本文公開的LEDGF肽的組合物和製劑。
[0064] 本發明的製劑可以片劑、膠囊、糖錠、扁囊劑、溶液、混懸液、乳液、粉劑、氣霧劑、栓 齊?、噴霧劑、軟錠劑、軟膏劑、霜劑、糊劑、泡沫劑、凝膠劑、棉塞、子宮託、顆粒劑、大丸劑、嗽 口劑、植入物、裝置、滴眼劑或經皮貼片形式施用。
[0065] 製劑包括適於口服、經直腸、經鼻、吸入、表面（包括經皮膚、經皮、經頰和滴眼 劑）、經陰道、胃腸外（包括皮下、肌肉內、靜脈內、皮內、眼內、氣管內和硬膜外）、眼部（眼 周、眼內，包括脈絡膜上、視網膜下和玻璃體內）或吸入施用的製劑。在一個示例性實施方 案中，本發明的肽被配製來供經鞏膜、脈絡膜上、視網膜下或玻璃體內遞送。經鞏膜遞送包 括結膜下、眼球筋膜下和眼球後經鞏膜遞送。製劑可宜以單位劑型呈現且可通過常規醫藥 技術來製備。所述技術包括使活性成分和藥物載體或賦形劑締合的步驟。一般來說，製劑 是通過使活性成分與液體載體或微細固體載體或兩者均一且精細締合，並且接著必要時使 產物成形來製備。
[0066] 適於口服施用的本發明的製劑可呈現為個別單元，如膠囊、扁囊劑或片劑，各自含 有預定量的活性成分；粉劑或顆粒劑；於水性液體或非水性液體中的溶液或混懸液；或水 包油液體乳液或油包水乳液等。
[0067] 片劑可通過任選與一種或多種輔助成分一起壓制或模製來製備。壓製片劑可通過 在適合機器中壓制任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合 的呈自由流動形式（如粉劑或顆粒）的活性成分來製備。模製片劑可通過在適合機器中模 制溼潤粉劑狀化合物與惰性液體稀釋劑的混合物來製備。片劑可任選被包覆或劃線且可被 配製以便提供其中活性成分的緩慢或控制釋放。
[0068] 適於在口中進行表面施用的製劑包括糖錠，其包含活性劑於通常是蔗糖和阿拉伯 膠或黃蓍膠的調味基質中；軟錠劑，其包含活性成分於如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠的 惰性基質中；以及嗽口劑，其包含待施用的成分於適合液體載體中。
[0069] 適於向皮膚進行表面施用的製劑可呈現為包含待施用的成分於藥學上可接受的 載體中的軟膏劑、霜劑、凝膠劑、糊劑和滴眼劑。
[0070] 用於經直腸施用的製劑可呈現為具有包括例如可可脂或水楊酸鹽的適合基質的 栓劑。
[0071] 適於經鼻施用的其中載體是固體的製劑包括顆粒尺寸例如在20至500微米的範 圍內的粗粉，其是以進行鼻吸的方式施用；即通過鼻部通道自貼近鼻部固持的具有粉劑的 容器快速吸入。適於施用的其中載體是液體的製劑（如例如鼻噴霧劑或如滴鼻劑）包括活 性成分的水性或油性溶液。
[0072] 適於經陰道施用的製劑可呈現為除活性成分之外也含有如本領域中已知為適當 的成分（如載體）的子宮託、棉塞、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧製劑。
[0073] 適於吸入的製劑可呈現為除活性成分之外也含有如本領域中已知為適當的成分 (如載體）的噴霧、粉塵、粉劑或噴霧製劑。
[0074] 適於腸胃外施用的製劑包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩 衝劑、制菌劑和致使製劑與預定接受者的血液等張的溶質；以及水性和非水性無菌混懸液， 其可包括混懸劑和增稠劑；凝膠劑；和手術放置將植入物。
[0075] 納米裝配製劑
[0076] 在某些示例性實施方案中，本發明的LEDGF肽可通過使LEDGF肽與膠態金屬顆粒 結合或另外締合來以納米顆粒裝配體形式遞送。任何膠態金屬都可用於本發明中。膠態金 屬包括任何水不溶性金屬顆粒、分散在液體水中的金屬化合物、水溶膠或金屬溶膠。膠態金 屬顆粒可選自周期表的IA、IB、IIB和IIIB族中的金屬以及過渡金屬，尤其是VIII族的那 些。示例性金屬包括鋅、金、銀、鋁、釕、鐵、鎳和鈣。其它適合金屬包括呈它們的所有各種氧 化狀態的以下金屬：裡、納、緩、鍾、銳、欽、鑰;、絡、猛、鑽、銅、嫁、銀、銀、鑰、鈕!、鋼、錫、鶴、鍊、 鉬和釓。金屬優選以離子形式自適當金屬化合物獲得，例如Al 3+、RU3+、Zn2+、Fe3+、NilPCa 2+。
[0077] 在一個示例性實施方案中，納米顆粒是通過直接向含有LEDGF肽的溶液中添加膠 態金屬來形成。如本文所用，"納米顆粒"是指一種或多種結合或吸附於單一膠態金屬顆粒 的表面的肽或結合或吸附於多個膠態金屬顆粒的肽。舉例來說，LEDGF/Zn納米顆粒是通過 在室溫下以控制方式添加 IOmM Zn(II)來形成。此後，在37°C下歷經24小時時期使納米裝 配體形成。使用其它膠態金屬來形成其它納米裝配體的條件可易於由本領域普通技術人員 確定。
[0078] 顆粒包顆粒製劑
[0079] 在另一示例性實施方案中，LEDGF肽被配製成顆粒包顆粒延長釋放製劑。本發明 的延長釋放組合物包含含有在較大多孔外部顆粒內的內部顆粒，包括各種構造，如納米顆 粒在多孔微粒中（PMP包NP)、小納米顆粒在多孔大納米顆粒中（PLNP包SNP)、以及小微粒 在多孔大微粒中（PLMP包SMP)。相較於較大顆粒，內部顆粒較小且相對不可膨脹。外部顆 粒是可膨脹的且在加工期間形成允許在外部顆粒的多孔結構內嵌入內部顆粒的顯著多孔 結構。
[0080] 如本發明的上下文中所用，如果顆粒的初始表面積在約1. 25倍至約100倍的範圍 內增加，那麼顆粒被視為在超臨界流體存在下膨脹。在某些示例性實施方案中，如果顆粒的 初始表面積在約1. 25至約5倍、約5至約25倍、約25至約50倍、約50至約75倍、或約75 至100倍的範圍內膨脹，那麼顆粒被視為會膨脹。或者，如果顆粒的初始尺寸增加至少5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或 50%，那麼顆粒被視為會膨脹。
[0081] 本發明的內部顆粒是使用在超臨界流體存在下不膨脹的聚合或非聚合物材料制 備。在某些示例性實施方案中，納米顆粒材料是在超臨界流體存在下將不膨脹的聚合物材 料。在某些示例性實施方案中，聚合物材料是在超臨界二氧化碳存在下將不膨脹的材料。 可用於本發明中的適合聚合和非聚合物材料的實例包括聚交酯（PLA)、聚（乙醇酸）、乳酸 和乙醇酸的共聚物（PLGA)、纖維素衍生物、殼聚糖、聚乙烯（PE)、聚丙烯、聚（四氟乙烯）、 聚（對苯二甲酸乙二酯）、氧化鐵、氧化鈰、氧化鋅、金、銀、其它生物相容性金屬和晶體、以 及二氧化矽。結晶材料或結晶區域較大的材料在超臨界流體加工期間膨脹的可能性較小。 聚合內部顆粒可使用常規乳化-溶劑蒸發方法或其它類似適合合成方法來製備。LEDGF肽 可在形成期間囊封在內部顆粒中，或在內部顆粒形成之後裝載在表面上。
[0082] 本發明的外部顆粒是使用在超臨界流體存在下膨脹的材料製備。在某些示例性 實施方案中，微粒材料是在超臨界流體存在下膨脹的聚合物材料。在某些示例性實施方案 中，材料在超臨界二氧化碳存在下膨脹。可用於本發明中的適合聚合物材料的實例包括丙 交酯-共聚-乙交酯、聚醯胺、聚碳酸酯、聚亞烷基二醇、聚亞烷基氧化物、聚乙烯醇、聚乙烯 醚、聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯及其共聚物。此外，適合聚合物材料也包括烷基 纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合 物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸 纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧乙基纖維素、纖維素聚（甲基丙烯酸 甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（乙烯醇）、聚（乙酸乙烯酯）和 聚乙烯吡酪烷酮。一般來說，非晶材料或非晶區域較大的材料適於在超臨界流體加工期間 膨脹。聚合外部顆粒可使用常規乳化-溶劑蒸發或其它類似適合合成方法來製備。在某些 示例性實施方案中，LEDGF肽可在形成期間囊封在外部顆粒中或在外部顆粒形成之後裝載 在表面上。
[0083] 產生各種顆粒構造的方法是使用超臨界流體流動技術來達成。所得無有機溶劑裝 載尤其非常適合於易經受聚集或降解的藥物，如基於肽和核苷酸的藥物。舉例來說，LEDGF 肽可被裝載在內部顆粒、外部顆粒或兩者的表面上；內部顆粒、外部顆粒或兩者的基質中； 存在於外部顆粒的孔中；或其組合。在某些示例性實施方案中，LEDGF肽可存在於內部顆 粒的表面上。在另一示例性實施方案中，LEDGF肽可存在於內部和外部顆粒的表面上。在 另一示例性實施方案中，LEDGF肽可存在於內部顆粒的基質中。在另一示例性實施方案中， LEDGF膚可存在於內部顆粒與外部顆粒兩者的基質中。在另一不例性實施方案中，此外，治 療劑可存在於外部顆粒的多孔結構中。
[0084] 使內部顆粒和外部顆粒混合在一起且在高壓下暴露於超臨界流體。在某些示例性 實施方案中，超臨界流體是二氧化碳。在暴露於超臨界流體後，外部顆粒膨脹以在外部表面 上產生多孔結構。超臨界流體接著使內部顆粒注入外部顆粒中以形成顆粒包顆粒延長釋放 製劑。在一個示例性實施方案中，顆粒包顆粒延長釋放製劑包含在直徑約1 μ m至約100 μ m 的外部微粒中併入直徑約Inm至約900nm的內部納米顆粒。在另一示例性實施方案中，顆粒 包顆粒延長釋放製劑包含在直徑約IOnm至約999nm的外部納米顆粒中併入直徑約Inm至 約300nm的內部納米顆粒。在另一示例性實施方案中，顆粒包顆粒延長釋放製劑包括在直 徑約2 μ m至約500 μ m的外部微粒中併入直徑約1 μ m至約100 μ m的內部微粒。對適當尺 寸的內部和外部顆粒的選擇將取決於構成顆粒的材料的類型、外部顆粒在所用超臨界流體 中的膨脹能力、以及待併入在外部顆粒內的內部顆粒的尺寸。這些是可易於由本領域普通 技術人員選擇的所有因素。一般來說，內部顆粒與外部顆粒之間的尺寸比率可自約1 : 5至 約1 : 100變化。在一個示例性實施方案中，尺寸比率可為1 : 5、1 : 10、1 : 15、1 : 20、 1 : 25、1 : 30、1 : 35、1 : 40、1 : 45、1 : 50、1 : 55、1 : 60、1 : 65、1 : 70、1 : 75、 1 : 80、1 : 85、1 : 90、1 : 95 或 1 : 100。
[0085] PMP包NP的形成可通過在約IOOOpsi至約HOOpsi下暴露納米顆粒和微粒來達 成。暴露時間可例如自約5分鐘至約2小時變化。溫度可在30°C至45°C的範圍內。對適當 壓力和溫度範圍的選擇是主要由接近給定超臨界流體的超臨界點的溫度和壓力範圍決定。 因此，本領域普通技術人員將能夠選擇基於所用超臨界流體、所需外部顆粒膨脹的尺寸或 量、以及所需外部顆粒中的孔隙度確定範圍的適當時間、溫度和壓力。舉例來說，持續較長 時期和/或在較高壓力下暴露繼之以壓力淬滅將導致膨脹和孔隙性大於較短暴露時間和/ 或壓力。
[0086] 在一個示例性實施方案中，內部顆粒和外部顆粒是在約1 : 3的比率下混合。在 一個示例性實施方案中，所用內部顆粒與外部顆粒的比率是約1 : 9。這些比率將影響納米 顆粒併入和藥物緩慢釋放的程度。一般來說，內部顆粒相對於外部顆粒的量越大，外部顆粒 中併入的內部顆粒的量越高，從而增加藥物釋放速率和劑量。內部顆粒相對於外部顆粒的 量越小，爆發性釋放越小。
[0087] 蛋白質聚集介導的疾病和治療方法
[0088] 本發明的LEDGF製劑可用於治療蛋白質聚集介導的疾病。可用本發明的LEDGF組 合物治療的蛋白質聚集介導的疾病包括視網膜退變性疾病和神經退變性疾病。視網膜退變 性疾病包括老年性黃斑變性、視網膜色素變性和糖尿病性視網膜病變。神經退變性疾病包 括阿爾茨海默病（AD)、帕金森氏病（PD)、亨廷頓氏病（HD)、肌萎縮性側索硬化和朊病毒疾 病。
[0089] 在一個示例性實施方案中，本發明包含治療視網膜退變性疾病的方法，其包括向 患有視網膜退變性疾病的患者施用包含本發明的LEDGF肽的組合物。在某些示例性實施方 案中，LEDGF肽是SEQ OD NO :2。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是經鞏膜遞送。 在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是以滴眼劑形式向眼進行表面施用。在另一示例性 實施方案中，LEDGF組合物是以延長釋放製劑形式植入或全身性施用。在一個示例性實施 方案中，延長釋放製劑是納米裝配延長釋放製劑，如LEDGF/鋅納米裝配製劑。在另一示例 性實施方案中，延長釋放製劑是顆粒包顆粒製劑，如納米顆粒於多孔微粒中（PMP包NP)制 劑。
[0090] 在一個示例性實施方案中，本發明包含降低視網膜退變性疾病中蛋白質聚集的方 法，其包括向患有視網膜退變性疾病的患者施用包含本發明的LEDGF肽的組合物。在某些 示例性實施方案中，LEDGF肽是LEDGFm 26。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是經鞏 膜遞送。在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是以滴眼劑形式向眼進行表面施用。在 另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是以延長釋放製劑形式植入或全身性施用。在一個 示例性實施方案中，延長釋放製劑是本發明的納米顆粒延長釋放製劑，如LEDGF/鋅納米顆 粒製劑。在另一示例性實施方案中，延長釋放製劑是顆粒包顆粒製劑，如納米顆粒於多孔微 粒中（PMP包NP)製劑。
[0091] 在另一示例性實施方案中，本發明包含治療神經退變性疾病的方法，其包括向患 有神經退變性疾病的患者施用包含本發明的LEDGF肽的組合物。在某些示例性實施方案 中，LEDGF肽是LEDGF 1I6。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是腹膜內遞送。在另一 示例性實施方案中，LEDGF組合物是口服施用。在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是 以延長釋放製劑形式全身性施用。在一個示例性實施方案中，延長釋放製劑是本發明的納 米顆粒延長釋放製劑，如LEDGF/鋅納米顆粒製劑。在另一示例性實施方案中，延長釋放制 劑是顆粒包顆粒製劑，如納米顆粒於多孔微粒中（PMP包NP)製劑。
[0092] 在另一示例性實施方案中，本發明包含降低神經退變性疾病中蛋白質聚集的方 法，其包括向患有神經退變性疾病的患者施用包含本發明的LEDGF肽的組合物。在某些示 例性實施方案中，LEDGF肽是LEDGFm 26。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是腹膜 內遞送。在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是口服施用。在另一示例性實施方案中， LEDGF組合物是以延長釋放製劑形式施用。在一個示例性實施方案中，延長釋放製劑是本發 明的納米顆粒延長釋放製劑，如LEDGF/鋅納米顆粒製劑。在另一示例性實施方案中，延長 釋放製劑是顆粒包顆粒製劑，如納米顆粒於多孔微粒中（PMP包NP)製劑。
[0093] 組合物和方法由以下非限制性實施例進一步說明，所述實施例無論如何都不應解 釋為對其範圍施加限制。相反，應明確了解的是在不脫離本發明的精神下可採取其各種在 讀取本文描述之後可向本領域技術人員顯現它們自身的其它實施方案、修改和等效物。 實施例
[0094] 實施例1
[0095] 1.材料
[0096] 質粒 pEGFP-LEDGF 由 Toshimichi Shinohara 博士 （University of Nebraska Medical Center，Omaha，NE)惠贈。正向和反向引物自 Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)獲得。DNA聚合酶 I、T4DNA連接酶和限制酶自 New England Biolab Inc. (Ipswich, MA)獲得。QIAquick膠凝提取試劑盒、QIAprep旋轉小型製備試劑 盒和QIAGEN質粒小型試劑盒自Qiagen (Valencia，CA)獲得。XK 16/20管柱、S-200凝膠過 濾管柱、SP 瓊脂糖珠粒自 GE Lifesciences Healthcare (Piscataway，NJ)獲得。ARPE-19 細胞自ATCC(Manassas，VA)獲得。DMEM/F12細胞培養基、胎牛血清、轉脂胺2000、LB培 養基和超純瓊脂糖自Invitrogen (Carsbad，CA)獲得。除非指定，否則所有其它材料都自 Sigma-Aldrich(St. Louis，MO)獲得。
[0097] 製備LEDGF^DNA構建體
[0098] 將編碼 LEDGFh26蛋白的基因克隆至 pET_28a(+)載體（Novagen，Madison，WI)中。 簡要來說，使用由HindIII限制核酸內切酶位點組成的正向引物5'AGTAGTGGATCCATGACTCG CGATTTCAAAC3' (SEQ ID NO :3)和由BamHI限制核酸內切酶位點組成的反向引物5'AATAATA AGCTTTCACTGCTCAGTTTCCATTTGTTC' 3 (SEQ ID NO :4)，自 pEGFP-LEDGF 質粒 PCR (聚合酶鏈反 應）擴增Ledgf^26基因。使用DNA聚合酶I用以下方案進行PCR擴增：在94°C下變性5分 鍾；繼之以36個循環：在94°C下變性30秒，在50°C下退火45秒並在72°C下延伸2分鐘；以 及最終在72°C下進行延伸步驟5分鐘。根據製造商方案，使用QIAquick膠凝提取試劑盒純 化擴增的LedgfV 326基因。此後，分別使用HindIII和BamHI限制酶在5'和3'末端處連續 消化純化的LedgfH 6基因插入物和pET-28a(+)載體。接著根據製造商方案使用QIAprep 旋轉小型製備試劑盒來純化它們。在4°C下使用T4DNA連接酶將插入物和載體的粘末端連 接過夜。根據製造商方案使用熱激程序用連接產物轉化感受態大腸桿菌DH5ci細胞。挑選 十個菌落且使用QIAGEN質粒小型試劑盒擴增、提取和純化質粒。通過三種不同方式確認 LedgfH6插入pET-28a(+)載體中：首先通過PCR篩選，其次通過限制消化，並且最後通過 DNA測序。使用2%瓊脂糖凝膠分析重組DNA的純度和尺寸。使用NanoDrop 1000 (Thermo scientific, Wilmington, DE)進行DNA定量。進一步培養顯示陽性PCR信號和正確測序結 果的菌落，並且製備細菌甘油儲備物並儲存在-80°C下供所有未來使用。
[0099] 生物信息學分析
[0100] 將LEDGF1I胺基酸序列提交至ExPASy生物信息學資源門戶且計算LEDGF M26W 分子量、理論pi、胺基酸組成、原子組成、消光係數、估計半衰期。
[0101] 表達和純化LEDGFh326
[0102] 對於蛋白質生物合成，根據製造商方案使用QIAGEN質粒小型試劑盒自大腸杆 菌DH5a菌落擴增和純化PLEDGFh 26質粒。接著根據製造商方案將質粒轉化於大腸桿菌 BL21(DE3)菌株中。此後，將含有質粒的細菌的單菌落接種至含有SOyg/ml卡那黴素的 LB(魯裡亞（Luria)肉湯）培養基中過夜。添加1 %過夜生長培養物接種物至一升含有 50^8/1111卡那黴素的1^培養基中。使培養物在371：下生長直至培養基的光密度（0.0.)達 到0.6-0. 8。通過添加 IPTG (異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷）以達到最終濃度200 μ M來 誘導蛋白質表達。此後，在37°C下再孵育細胞3小時且通過在4°C下在3000g下離心15分 鍾來收集。將收集的細胞再混懸於緩衝液A(25mM Tris-HCKpH 7.0)、I mM EDTA、ImM PMSF 和5%蔗糖）中。在70%輸出（36瓦）5秒繼之以冷卻15秒下對細胞進行脈衝超聲處理 (]^8〇11丨1，3〇11；^31:〇1 3000，？31'111；[1^(1316，附），持續總計30分鐘。在4°(1|下在 1300(^下離 心溶解的細胞20分鐘以分離溶解產物的可溶性和不溶性部分。在SDS-PAGE上分析可溶性 (上清液）和不溶性（離心塊）部分的蛋白質含量且測定產生的蛋白質的可溶性/不溶性 性質。
[0103] FPLC =LEDGFp32f^在可溶性部分中表達，如通過SDS-PAGE所確定。使用快速蛋白 質液相色譜（FPLC)技術分兩步，首先基於電荷（陽離子交換）且接著基於尺寸（凝膠過 濾）來純化LEDGFh 26。簡要來說，將陽離子交換SP瓊脂糖珠粒裝填在XK 16/20管柱中且 使用緩衝液A在2ml/min流速下進行平衡。此後，在流速lml/min下將可溶性部分裝載在 管柱上。管柱接著用五管柱體積的緩衝液A在2ml/min流速下洗滌。使用尖銳梯度的氯化 鈉（0至28%電導）洗脫大多數非特異性以及鬆散結合的雜質。在移除顯著比例的管柱結 合雜質之後，使用在40分鐘內電導自28 %至40 %的第二梯度的NaCl達成LEDGF^26的進 一步洗脫。通過使用嵌入紫外檢測器測量280nm下的吸光度來監測蛋白質洗脫曲線。在洗 脫過程期間收集2. 5ml洗脫份且在SDS-PAGE上分析以測定純度。將含有高蛋白質量的洗 脫份匯合在一起。使用透析緩衝液（25mM Tris (pH 7.0)和0. 1 %鹿糖）透析匯合的洗脫份 且接著凍幹48小時。將凍幹蛋白質溶解於2ml去離子水中。對於下一純化步驟，使用平衡 緩衝液 B (25mM Tris-HCl (pH 7. 0)和 IOOmM NaCl)在流速 lml/min 下使預裝填的 S-200 凝 膠過濾管柱平衡。接著將來自陽離子交換的LEDGF1I^*縮溶液裝載於S-200管柱上。使 用緩衝液B在流速lml/min下洗脫LEDGF^ 26。在約100分鐘時獲得尖銳峰，收集Iml洗脫 份。使用SDS-PAGE分析收集的洗脫份。將含有純LEDGFh 26的洗脫份匯合在一起。接著在 4°C下以三次緩衝交換在透析緩衝液（25mM Tris-HCKpH 7.0)和0. 1%蔗糖）中充分透析 純化LEDGF^dS小時以移除過量鹽和其它雜質。在-80°C下冷凍並凍幹透析的LEDGFp32f^S 小時。將凍幹的LEDGFn6等分且儲存在-80°C下以達成所有未來目的。
[0104] 紫外光譜術：準確稱重12mg凍幹的LEDGFm26且接著溶解於Iml去離子水中。使 用 Spectramax M5(Molecular Devices，Downingtown，PA)自 200nm至 400nm記錄紫外吸收 光譜。使用去離子水連續稀釋樣本直至獲得280nm下的吸光度小於1。這個吸光度用於基 於摩爾消光係數計算樣本中存在的純化蛋白質的量。
[0105] 物理表徵
[0106] 通過 SDS-PAGE、SEC-HPLC 和 MALDI-T0F 來測定 LEDGF1J2f^ 白的分子量和純度。
[0107] SDS-PAGE :簡要來說，將5 μ g LEDGFp32f^ SDS-PAGE樣本緩衝液（含有β -巰基乙 醇）中煮沸10分鐘。將蛋白質樣本裝載於4-15% SDS-PAGE膠凝（Bi〇-Rad，Hercules，CA) 上且在30mA下進行電泳90分鐘。膠凝接著用考馬斯亮藍（coomassie brilliant blue) 染色且使用GelDoc? XR(Biorad，Hercules，CA)在白光下觀察。對於非還原性SDS-PAGE， 將LEDGFh26稀釋於非還原性樣本緩衝液（無 β-巰基乙醇）中且避免煮沸。
[0108] SEC-HPLC :將凍幹蛋白質溶解於去離子水中以達到最終濃度500μ g/ml且經 0. 22um(PVDF)過濾器過濾。利用Agilent Bio SEC-3管柱，在25°C下使用25mM含有ImM CaCljA Tris緩衝液（pH 7.0)以流速lml/min評估蛋白質。用分子量標準物（Invitrogen) 校正管柱。在214nm下測量紫外吸光度。
[0109] MALDI-T0F :通過用 4800Plus MALDI T0F/T0F?(AB Sciex，Framingham，MA)測定分 子量來確認蛋白質均質性和身份。將蛋白質樣本溶解入標準MALDI基質芥子酸的溶液中， 點樣且乾燥於金屬靶板上。自5900強度的1000次雷射照射以總離子流（TIC)形式收集數 據。
[0110] DLS :使用 zetasizer Nano ZS (Malvern，Westborough，MA)分析 LEDGF卜326蛋白 的均質性和尺寸。簡要來說，將凍幹蛋白質樣本溶解於去離子水中以得到最終蛋白質濃度 2. 5mg/ml。使用動態光散射技術，在173°反向散射角下進行數據收集來以數目、強度和體 積平均值量度尺寸。測量結果是13次掃描的平均值。
[0111] 生物物理學表徵
[0112] 對於生物物理學表徵，在25mM磷酸鹽緩衝液（pH 7.0)中充分透析蛋白質以移除 Tris-HCl和蔗糖，並且經0. 22 μ m PVDF注射器過濾器過濾。使用Origin? 8. 5 (OriginLab Corp., Northampton, MA)或 SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc, Chicago, IL)分 析獲得的光譜。使用如下由Scholtz等定義的等式I和2擬合數據以確定AG、m值和 [脲]1/2[62]。

【權利要求】
1. 一種包含晶狀體上皮源性生長因子（L邸G巧的胺基酸序列的膚，其中所述膚包含 LEDGF N末端應激相關的結合結構域。
2. 如權利要求1所述的膚，其中所述膚還包含TAT結合結構域。
3. 如權利要求1所述的膚，其中所述膚具有約40kDa的分子量。
4. 如權利要求1所述的膚，其中所述膚具有胺基酸序列SEQ IDN0;2,或與SEQ ID NO: 2具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %或至少95 %序列同一性的氨基 酸序列。
5. -種核酸序列，其編碼如權利要求4所述的膚。
6. -種載體，其包含如權利要求5所述的核酸序列。
7. -種組合物，其包含如權利要求1至4中任一項所述的膚。
8. 如權利要求7所述的組合物，其還包含藥物載體、稀釋劑、賦形劑或其組合。
9. 如權利要求7所述的組合物，其中所述膚與膠態金屬納米顆粒結合或締合。
10. 如權利要求9所述的組合物，其中所述膠態金屬納米顆粒是金、銀、鉛、釘、鋒、鐵、 媒、巧、裡、軸、鎮、鍾、築、鐵、飢、鉛、猛、鑽、銅、嫁、餓、魄、鋼、把、鋼、錫、鶴、練、笛或亂膠態 金屬納米顆粒。
11. 如權利要求10所述的組合物，其中所述納米顆粒是鋒納米顆粒。
12. 如權利要求9至11中任一項所述的組合物，其還包含藥物載體、稀釋劑、賦形劑或 其組合。
13. 如權利要求7所述的組合物，其中所述膚結合或囊封於內部顆粒中，並且其中所述 內部顆粒被裝載在多孔外部顆粒中。
14. 如權利要求13所述的組合物，其中所述內部顆粒是由在超臨界二氧化碳中不膨脹 的顆粒材料製得。
15. 如權利要求13所述的組合物，其中所述內部顆粒材料是聚合物材料。
16. 如權利要求15所述的組合物，其中所述內部顆粒聚合物材料選自由W下組成的 組；聚交醋（PLA)、聚（己醇酸）（PGA)、乳酸和己醇酸的共聚物（PLGA)、纖維素衍生物和殼 聚糖。
17. 如權利要求16所述的組合物，其中所述內部顆粒聚合物材料是聚交醋（PLA)。
18. 如權利要求13所述的組合物，其中所述外部顆粒是由在超臨界二氧化碳中膨脹的 顆粒材料製得。
19. 如權利要求18所述的組合物，其中所述外部顆粒是聚合物材料。
20. 如權利要求19所述的組合物，其中所述聚合物材料是選自W下的材料；聚醜胺、聚 碳酸醋、聚亞焼基二醇、聚亞焼基氧化物、聚己帰醇、聚己帰離、聚己帰醋、聚己帰化咯焼麗、 聚己交醋及其共聚物、焼基纖維素、輕焼基纖維素、纖維素離、纖維素醋、硝基纖維素、丙帰 酸醋和甲基丙帰酸醋的聚合物、甲基纖維素、己基纖維素、輕丙基纖維素、輕基-丙基甲基 纖維素、輕下基甲基纖維素、己酸纖維素己酸下酸纖維素、己酸鄰苯二甲酸纖維素、駿己基 纖維素、纖維素聚（甲基丙帰酸甲醋）、聚（甲基丙帰酸己醋）、聚（甲基丙帰酸下醋）、聚 (己帰醇）、聚（己酸己帰醋）和聚己帰化酪焼麗。
21. 如權利要求20所述的組合物，其中所述外部顆粒材料是丙交醋-共聚-己交醋。
22. -種治療蛋白質聚集介導的疾病的方法，其包括向有需要的患者施用如權利要求 7至21中任一項所述的組合物。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述聚集介導的疾病是眼病。
24. 如權利要求23所述的方法，其中所述眼病是視網膜變性疾病。
25. 如權利要求24所述的方法，其中所述視網膜變性疾病是老年性黃斑變性（AMD)或 視網膜色素變性（RP)。
26. 如權利要求22所述的方法，其中所述聚集介導的疾病是神經退變性疾病。
27. 如權利要求26所述的方法，其中所述神經退變性疾病是阿爾茨海默病（AD)、帕金 森氏病（PD)、亨廷頓氏病（皿)、肌萎縮性側索硬化或化病毒疾病。
28. -種降低蛋白質聚集介導的疾病中蛋白質聚集的方法，其包括向有需要的患者施 用如權利要求7至21中任一項所述的組合物。
29. 如權利要求28所述的方法，其中蛋白質聚集是由內質網應激、氧化應激或兩者引 起。
30. 如權利要求28所述的方法，其中所述患者患有視網膜變性疾病。
31. 如權利要求30所述的方法，其中所述視網膜變性疾病是AMD或RP。
32. 如權利要求28所述的方法，其中所述患者患有神經退變性疾病。
33. 如權利要求32所述的方法，其中所述神經退變性疾病是AD、PH、皿、肌萎縮性側索 硬化或化病毒疾病。
【文檔編號】A61K38/18GK104470534SQ201380038504
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月21日 優先權日:2012年5月21日
【發明者】烏達伊·B·康佩拉, 林庫·拜德, 阿倫·K·烏帕德亞伊, 薩拉·揚德拉普 申請人:科羅拉多大學董事會