B型肝炎病毒多表位融合蛋白及其製備方法和應用的製作方法

2023-09-19 05:35:15 2

專利名稱：B型肝炎病毒多表位融合蛋白及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥領域，涉及一種融合蛋白，特別涉及一種B型肝炎病毒 (Hepatitis B ViruS，HBV)多表位融合蛋白，還涉及該融合蛋白的製備方法，及其在製藥領域的應用。
背景技術：
HBV是嚴重危害人類健康的肝炎病毒之一，是重要的肝臟疾病致病因子。我國約有 3000萬人為慢性HBV感染患者，每年因此死亡的患者近50萬。慢性HBV感染患者主要表現為肝損傷以及與脂肪變性和纖維化相關的代謝紊亂，長期感染患者還有可能發展成為肝硬化和肝細胞癌。目前治療慢性HBV感染主要採用以抗病毒藥物和細胞因子為主、中醫藥為輔的治療方法，雖然取得了一定療效，但存在不能有效清除HBV、復發率高等缺點。因此，研究慢性HBV感染的新型治療方法和治療藥物，已成為我國當前亟待解決的重大課題之一。隨著B肝病毒學和現代免疫學的快速發展，細胞毒性T淋巴細胞(CTL)在HBV清除過程中的關鍵作用得到深刻認識。利用CTL抑制HBV的複製並進一步將其清除，已成為極富前景的慢性HBV感染治療方法。HBV表達多種抗原，包括表面抗原(HBsAg)、核心抗原 (HBcAg)、e抗原(HBeAg)、χ抗原(HBxAg)和多聚酶(po 1)，每種抗原都發現了多種MHC限制性CTL表位，其中部分CTL表位為超型表位，即同一表位具有不同MHC限制性，這種表位在 HBsAg、HBcAg和pol上均存在。研究發現，HBsAg、HBcAg和pol特異性CTL過繼療法可以有效降低患者體內的病毒載量，抑制HBV複製，提示這三種抗原可能是利用CTL治療慢性HBV 感染的理想靶標。但是，如何在體內同時激發這三種抗原泛MHC限制性的特異性CTL反應， 則是感染病學家和免疫學家共同關心的挑戰性課題。現有文獻已報導了一些以激發特異性CTL反應為目標的B肝疫苗，包括多肽疫苗、蛋白疫苗和DNA疫苗等。但這些疫苗並不完善，例如多肽疫苗多數是由單一抗原單一 MHC限制性的單一表位或多表位串聯而成，存在表位單一、宿主限制性、免疫原性差等缺點； 蛋白疫苗可以多次免疫，但由於單一蛋白抗原表位的免疫原性差，在體內不能有效激發特異性CTL反應；DNA疫苗雖然在體內可以有效激發特異性CTL反應，但由於質粒DNA的轉染具有非特異性，對體細胞的轉染可導致T細胞對該抗原耐受，存在多次免疫效果差的問題， 難以適應慢性HBV感染患者長期治療、多次免疫的要求。因此，迫切需要開發一種適應廣泛人群MHC限制性的更高效的B肝疫苗。

發明內容
有鑑於此，本發明的目的之一在於提供一種HBV多表位融合蛋白，免疫原性強，能夠有效激發特異性CTL反應，高效抑制和清除HBV，同時能夠適應廣泛人群MHC限制性。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案
HBV多表位融合蛋白，是在B型肝炎病毒核心蛋白(HBc)的第78位和第79位胺基酸之間插入由 HBsAg313-321、HBsAg335_343、Pol 150-159、Pol455_463 和 Padre 表位通過連接肽(linker)串聯而成的HBV多表位融合肽(胺基酸序列如SEQ ID No. 1所示)而得到。本發明的目的之二在於提供所述HBV多表位融合蛋白的製備方法，操作簡便，成本低。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案 HBV多表位融合蛋白的製備方法，包括以下步驟
a、重組質粒pET28a-HP的構建根據HBV多表位融合肽的胺基酸序列設計併合成其編碼基因序列使，PCR擴增，再將擴增出的使序列克隆入質粒pET28a中，獲得重組質粒 pET28a-HP ；
b、重組質粒pET28-HBc-HP的構建採用PCR法分別擴增HBc第1_78位胺基酸片段的編碼基因序列HBc卜78和第79-144位胺基酸片段的編碼基因序列HBc79-144,再將頒￠7-7^ 序列和HBc79-144序列分別克隆入步驟a所得重組質粒pET28a_HP中HP序列的上遊和下遊，獲得重組質粒pET28a-HBc-HP ；
c、HBV多表位融合蛋白的表達和純化將步驟b所得重組質粒pET28a-HBc-HP轉化大腸桿菌，用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導表達，收集菌體，超聲破碎，離心棄上清，沉澱用鹽酸胍溶解後，離心取上清，用M2+親和層析柱純化，即得HBV多表位融合蛋白。進一步，步驟a是先根據HBV多表位融合肽的胺基酸序列SEQ ID No. 1設計併合成核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的編碼基因序列使，再採用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下遊引物PCR擴增使序列，最後將擴增出的使序列經限制性核酸內切酶損ol和^雙酶切後，克隆入經同樣雙酶切的質粒pET28a中，獲得重組質粒 pET28a-HP。進一步，步驟b是先採用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的上、下遊引物PCR擴增HBc第1-78位胺基酸片段的編碼基因序列///^7-7義再將擴增出的頒C7-7S序列經限制性核酸內切酶AfcoI和損ol雙酶切後，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET28a- HP中，獲得重組質粒pET28a-HBcl-78-HP ；然後採用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的上、下遊引物PCR擴增HBc第79-144位胺基酸片段的編碼基因序列頒c79-7 ，再將擴增出的頒序列經限制性核酸內切酶命/ 1 和損al雙酶切後，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET28a-HBcl-78-HP中，獲得重組質粒 pET28a-HBc-HP。進一步，步驟C是將步驟b所得重組質粒pET28a-HBC-HP轉化大腸桿菌BL21(DE3) 感受態細胞，用終濃度為lmmol/L的IPTG於溫度37°C誘導表達6小時，收集菌體，超聲破碎，離心棄上清，沉澱用鹽酸胍溶解後，離心取上清，用M2+親和層析柱純化，即得HBV多表位融合蛋白。本發明的目的之三在於提供所述HBV多表位融合蛋白在製藥領域的應用，從而為臨床疾病的防治提供更多高效、安全的備選藥物，以滿足臨床治療的多方面需求。為達到上述目的，本發明提供如下技術方案
HBV多表位融合蛋白在製備B型肝炎治療性疫苗中的應用。本發明的有益效果在於①本發明的HBV多表位融合蛋白為包含有HBsiVg超型表位 HBsAg313-321 和 HBsAg335_343，pol 超型表位 Pol 150-159 和 Pol455_463，以及輔助性T細胞(Th)表位I^adre的HBc，共攜帶了三種HBV抗原HBsAg、HBcAg和Pol的超型表位，免疫原性強，能夠有效激發廣譜、特異的CTL反應，高效抑制和清除HBV ；上述超型表位的MHC 限制性包括A2、A3兩大超型，可以覆蓋90%以上的中國人群，因此由該融合蛋白製成的B肝治療性疫苗適用於廣泛的B肝患者；該融合蛋白攜帶的1 表位還能夠有效輔助特異性CTL 的產生；②本發明的HBV多表位融合蛋白為病毒樣顆粒(VLP)，其大小與天然病毒相近，在體內易於被樹突狀細胞(DC)捕獲，進而呈遞給T細胞，激活CTL反應；而且VLP在體內大部分被DC和巨噬細胞捕獲，對體細胞的影響小，可以解決多次免疫耐受的問題，能夠滿足慢性HBV感染患者長期治療、多次免疫的要求；③由於HBc中有核定位序列，本發明的HBV 多表位融合蛋白可以模擬HBV感染過程中B肝病毒核心顆粒的核轉運過程，從而進一步增強免疫效果。


為了使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將結合附圖對本發明作進一步的詳細描述，其中
圖1為HBV多表位融合肽編碼基因PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為 DNA分子量標準，泳道2為PCR擴增產物。圖2為重組質粒pET28-HBc-HP酶切鑑定的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中泳道1為DNA 分子量標準，泳道2為Hindlll酶切產物，泳道3為幻μI酶切產物。圖3為HBV多表位融合蛋白的SDS-PAGE電泳圖，其中泳道1為蛋白質分子量標準，泳道2為空質粒pEI^8a，泳道3為未經IPTG誘導的pET28-HBc-HP轉化菌，泳道4為經 IPTG誘導的pET28-HBc-HP轉化菌。圖4為HBV多表位融合蛋白的電鏡圖。圖5為HBV多表位融合蛋白免疫轉基因小鼠前後HBV DNA和HBcAg的變化，其中 A和B分別為HLA-A*0201轉基因小鼠免疫前後HBV DNA和HBcAg的變化，C和D分別為 HLA-A* 1101轉基因小鼠免疫前後HBV DNA和HBcAg的變化；VLP vaccine表示HBV多表位融合蛋白免疫組，HBcAg+Peptides表示HBc顆粒-HBV多表位融合肽混合免疫對照組，HBcAg 表示HBc顆粒免疫對照組，Peptides表示HBV多表位融合肽免疫對照組，Blank表示非治療對照組，Placebo表示安慰劑對照組。
具體實施例方式以下將參照附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。優選實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南(第三版，J-薩姆布魯克等著，黃培堂等譯，科學出版社，2002年)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。實施例1、HBV多表位融合蛋白的設計和製備一、HBV多表位融合蛋白的設計
首先，利用中國人民解放軍免疫學研究所建立的HBV抗原超型表位資料庫，篩選符合以下標準的超型表位①抗原為HBsAg、HBcAg或pol ；②MHC限制性為A2、A3超型；③表位長度為9肽或10肽；④體外誘導特異性CTL分泌細胞因子IFN- γ的能力高於對照表位 HBcAgl8-27。結果共篩選出以下4個超型表位，分別是HBsAg313-321 (胺基酸序列為IPIPSSWAF)，MHC限制性為A3超型(包括A0301、A1101、 A3301)；
HBsAg335-343 (胺基酸序列為WLSLLVPFV)，MHC限制性為A2超型(包括A0201、A0202、 A0203、A0206 和 A6802)；
Poll50-159 (胺基酸序列為TLWKAGILYK)，MHC限制性為A3超型(包括A0301、AllOU A310UA3301 和 A6801)；
Pol455-463 (胺基酸序列為GLSRYVARL)，MHC限制性為A2超型(包括A0201、A0202和 A0203)。其次，為了能更有效輔助特異性CTL的產生，本發明設計在上述4個超型表位串聯體中加入通用1 表位I^dre (胺基酸序列為AKFVAAWTLKAAA);為了有利於各表位在體內發揮各自的功能，便於抗原的加工呈遞，本發明還設計不同的連接肽來連接各表位。優選的連接肽及各表位的連接方式如下GAA- (HBsAg335-343) -GAAA- (HBsAg313_321) -KAA-Padre-G AAA-(Pol455-463)-NAAA-(Pol 150-159)-GAA (SEQ ID No. 1 )，即得 HBV 多表位融合肽。這些連接肽的優點在於，在體內能有效地被蛋白酶體剪切，有利於表位的加工和提呈。而這種交錯的表位連接方式可以實現不同抗原表位肽和不同表位限制性的交叉，能更有效地激發特異性CTL產生。最後，將HBV多表位融合肽插入到HBc的第78位和第79位胺基酸之間，即得HBV 多表位融合蛋白。HBc的第78位和第79位胺基酸位於HBc顆粒的表面，能有效地把插入此位置的HBV多表位融合肽暴露給蛋白酶體，而HBV多表位融合肽的插入也有利於打破HBc 顆粒的耐受。二、HBV多表位融合蛋白的製備
UHBV多表位融合蛋白重組質粒pET28-HBc-HP的構建
首先，為了便於HBV多表位融合肽的原核表達，根據上述HBV多表位融合肽的胺基酸序列，在http://WWW. jcat. de/網站上對其編碼基因的核苷酸序列進行優化，獲得如SEQ ID No. 2所示的優選核苷酸序列//Λ委託上海生工生物工程技術服務公司進行合成。然後， 以合成的使序列為模板，採用上遊引物HP-F :5，-gactcgagggtgcagcctggctg-3『 (SEQ ID No. 3)和下遊引物 HP-R :5，-gtggtaccggctgcaccaaaaacgc-3，(SEQ ID No. 4)進行 PCR 擴增，擴增條件為先94°C預變性2分鐘，再94°C變性30秒、65°C退火30秒、72°C延伸Imin, 共33個循環，最後72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖電泳電泳(圖1)鑑定後，切膠回收純化目的片段。將所得目的片段用損ol和幻Μ I雙酶切，再與經同樣雙酶切的質粒pET28a 在T4 DNA連接酶的作用下連接，獲得重組質粒pET28a-HP。其次，以提取的HBV基因組為模板，分別採用下述2對引物上遊引物 HBcl-78-F :5，-agccatggagatggacattgacc-3，(SEQ ID No. 5)禾口下遊弓I 物 HBcl-78-R 5，-tactcgagatc-ttccaaattacttc-3，(SEQ ID No. 6)；上遊弓| 物 HBc79_144_F 5，-atggtaccccagcatccagggaatt-3，(SEQ ID No. 7)和下遊引物 HBc79_144_R 5『-tgtctagaaacggaagtgttgataa-3『 (SEQ ID No. 8)PCR 擴增 HBc 第 1-78 位胺基酸片段的編碼基因序列頒C7-7S以及HBc第79-144位胺基酸片段的編碼基因序列頒c7^_7 ，擴增條件為先94 V預變性2分鐘，再94°C變性30秒、60 V退火30秒、72 °C延伸Imin，共33個循環，最後72°C延伸10分鐘。PCR產物經瓊脂糖電泳電泳鑑定後，切膠回收純化目的片段。將所得目的片段頒C7-7S用Afco I和煬ο I雙酶切，再與經同樣雙酶切的重組質粒pET28a-HP 在T4 DNA連接酶的作用下連接，獲得重組質粒pET28a- HBcl-78-HP ；再將所得目的片段 HBc79-144覓Kpn I和損a I雙酶切，再與經同樣雙酶切的重組質粒pET28a-HBcl_78-HP在 T4 DNA連接酶的作用下連接，獲得重組質粒pET28a- HBc-HP0其酶切鑑定的瓊脂糖凝膠電泳圖如圖2所示。2, HBV多表位融合蛋白的原核表達及優化
將重組質粒pET28a-HBc-HP轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，用含有濃度為 100μδ/πι1的氨苄青黴素的LB平板篩選陽性克隆。挑取一個陽性克隆，分別於溫度16、25、 37°C誘導目的蛋白表達，誘導劑IPTG的終濃度分別為0. 1,0. 3,0. 5,0. 7、lmmol/L，誘導時間分別為2、3、5、6小時。表達產物的瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在溫度37°C、誘導劑終濃度為lmmol/L、誘導時間為6小時的條件下，HBV多表位融合蛋白的表達量最高(圖3)。取凍存的pET28a-HBc-HP轉化菌菌液ΙΟΟμΙ，加入新鮮培養基10ml，37 °C培養過夜，再取新鮮菌液1ml，加入新鮮培養基100ml，37°C培養2. 5小時，再加入終濃度為lmmol/ L的IPTG，37°C誘導培養6小時，收集菌體，IOOOOrpm離心10分鐘，棄上清，向沉澱中加入細菌裂解液IOml和終濃度為lmmol/L的苯甲基磺醯氟(PMSF)，超聲至溶液變清澈，18000rpm 離心15分鐘，棄上清，沉澱用濃度為4mol/L的尿素溶液洗滌2次，再加入濃度為6mol/L的鹽酸胍溶解0. 5小時，ISOOOrpm離心15分鐘，取上清，過Ni2+親和層析柱，先用柱清洗液洗柱3次，再用含有濃度為200mmol/L的咪唑和濃度為6mol/L的鹽酸胍的上樣緩衝液洗脫， 收集洗脫液，用濃度為0. 01mol/L的PBS透析去除咪唑、鹽酸胍及鹽離子等，則HBV多表位融合蛋白復性形成VLP懸浮於PBS中(圖4)。實施例2、HBV多表位融合蛋白的免疫保護作用
取免疫A2、A3轉基因小鼠(購自Jackson實驗室)與HBV轉基因小鼠(購自廣州空軍醫院)的雜交後Fl代HBV+A2+、HBV+A3+轉基因C57小鼠60隻，平均分為6組HBV多表位融合蛋白免疫組、HBc顆粒-HBV多表位融合肽混合免疫對照組、HBc顆粒免疫對照組、HBV多表位融合肽免疫對照組、非治療對照組、安慰劑對照組。免疫方法如下HBV多表位融合蛋白免疫組HBV多表位融合蛋白IOOPg/次/只，1次/周；HBc顆粒-HBV多表位融合肽混合免疫對照組HBc顆粒和HBV多表位融合肽的混合物IOOPg/次/只，1次/周；HBc顆粒免疫對照組HBc顆粒IOOPg/次/只，1次/周；HBV多表位融合肽免疫對照組HBV多表位融合肽IOOPg/次/只，1次/周；免疫部位為尾部皮下，每組共免疫3次。利用定量PCR試劑盒 (吉瑪公司)檢測HBV DNA的拷貝數，利用免疫組化試劑盒(碧雲天)檢測肝細胞HBcAg表達。 結果顯示，在HLA-A*0201和HLA-A*1101轉基因小鼠中，HBV多表位融合蛋白免疫組與其它對照組相比，HBV DNA的拷貝數和HBcAg的表達量均明顯下調(圖5)，表明HBV多表位融合蛋白存在顯著的免疫保護作用，並存在廣譜性。最後說明的是，以上實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過參照本發明的優選實施例已經對本發明進行了描述，但本領域的普通技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權利要求書所限定的本發明的精神和範圍。
權利要求
1.B型肝炎病毒多表位融合蛋白，其特徵在於在B型肝炎病毒核心蛋白的第78位和第 79 位胺基酸之間插入由 HBsAg313-321、HBsAg3;35-343、Poll50-159、Pol455-463 和 Padre 表位通過連接肽串聯而成的B型肝炎病毒多表位融合肽而得到，所述B型肝炎病毒多表位融合肽的胺基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
2.權利要求1所述的B型肝炎病毒多表位融合蛋白的製備方法，其特徵在於包括以下步驟a、重組質粒pET28a-HP的構建根據B型肝炎病毒多表位融合肽的胺基酸序列設計併合成其編碼基因序列HP, PCR擴增，再將擴增出的HP序列克隆入質粒pET28a中，獲得重組質粒 pETWa-HP ；b、重組質粒pET28-HBc-HP的構建採用PCR法分別擴增B型肝炎病毒核心蛋白第1-78位胺基酸片段的編碼基因序列和第79-144位胺基酸片段的編碼基因序列HBc79-144，再將HBcl-78序列和HBc79-144序列分別克隆入步驟a所得重組質粒 pET28a-HP中HP序列的上遊和下遊，獲得重組質粒pET28a-HBc_HP ；c、B型肝炎病毒多表位融合蛋白的表達和純化將步驟b所得重組質粒 pET28a-HBc-HP轉化大腸桿菌，用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷誘導表達，收集菌體，超聲破碎，離心棄上清，沉澱用鹽酸胍溶解後，離心取上清，用Ni2+親和層析柱純化，即得B型肝炎病毒多表位融合蛋白。
3.根據權利要求2所述的B型肝炎病毒多表位融合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟a是先根據B型肝炎病毒多表位融合肽的胺基酸序列設計併合成核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示的編碼基因序列使，再採用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的上、下遊引物PCR擴增/F序列，最後將擴增出的/F序列經限制性核酸內切酶損ο I和 Kpn I雙酶切後，克隆入經同樣雙酶切的質粒pET28a中，獲得重組質粒pET28a_HP。
4.根據權利要求2所述的B型肝炎病毒多表位融合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟b是先採用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的上、下遊引物PCR擴增B型肝炎病毒核心蛋白第1-78位胺基酸片段的編碼基因序列/Sd-ZA再將擴增出的頒C7-7S序列經限制性核酸內切酶Afco I和損ο I雙酶切後，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET28a-HP中，獲得重組質粒pET28a-HBcl-78-HP ；然後採用核苷酸序列分別如SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 8所示的上、下遊引物PCR擴增B型肝炎病毒核心蛋白第79-144位胺基酸片段的編碼基因序列頒c79-7^，再將擴增出的頒c序列經限制性核酸內切酶^ot I和損a I雙酶切後，克隆入經同樣雙酶切的重組質粒pET28a-HBcl-78-HP中，獲得重組質粒 pET28a-HBc-HP。
5.根據權利要求2所述的B型肝炎病毒多表位融合蛋白的製備方法，其特徵在於步驟c是將步驟b所得重組質粒pET28a-HBc-HP轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，用終濃度為lmmol/L的異丙基-β _D_硫代吡喃半乳糖苷於溫度37°C誘導表達6小時，收集菌體，超聲破碎，離心棄上清，沉澱用鹽酸胍溶解後，離心取上清，用M2+親和層析柱純化，即得B型肝炎病毒多表位融合蛋白。
6.權利要求1所述的B型肝炎病毒多表位融合蛋白在製備B型肝炎治療性疫苗中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種B型肝炎病毒多表位融合蛋白及其製備方法和應用，該融合蛋白是在B型肝炎病毒核心蛋白的第78-79位胺基酸之間插入由HBsAg313-321、HBsAg335-343、Pol150-159、Pol455-463和Padre表位通過連接肽串聯而成的B型肝炎病毒多表位融合肽(序列如SEQIDNo.1所示)而得到；其製備方法是先構建B型肝炎病毒多表位融合蛋白表達質粒pET28-HBc-HP，再用大腸桿菌表達系統進行IPTG誘導表達，最後用親和層析純化即得；該融合蛋白攜帶了HBsAg、HBcAg和多聚酶的多個超型表位且為病毒性顆粒，具有免疫原性強、適應人群廣等優點，可用於製備B肝治療性疫苗。
文檔編號C12N15/51GK102199217SQ201110082078
公開日2011年9月28日 申請日期2011年4月1日 優先權日2011年4月1日
發明者劉 東, 吳玉章, 李霞, 王莉 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學