治療神經缺損的方法

2023-09-19 06:04:50

專利名稱：治療神經缺損的方法
該申請要求1997年8月4日提交的暫定申請系列號為60/055,383的優先權，其全部內容被引入本文作為參考。
本發明領域是治療由影響中樞神經系統的損傷、疾病或發育障礙引起的神經缺損。
背景技術：
神經營養因子是多方面地支持神經細胞生存、增生、分化、大小和功能的肽類(綜述，見Loughlin和Fallon，神經營養因子(Neurotrophic Factors)，學術出版社(Academic Press)，San Diego，化學文摘(CA)，1993)。隨著識別的營養因子或生長因子的數量不斷增加，基於其結構或結合親和力多數能被分到一個或另一個確定的家族中。來自各家族的生長因子，包括表皮生長因子(EGF)家族，已被證明支持黑質紋狀體系統(按照本發明方法可治療的一個區域)的多巴胺神經元(綜述，參見Hefti神經生物學雜誌(J.Neurobiol.)251418-1435，1994；Unsicker，生長因子研究進展(Prog.Growth Facter Res.)573-87，1994)。
作為EGF家族的基本成員，EGF在25多年前被鑑定(Savage and Cohen，生物學化學雜誌(J.Biol.Chem.)2477609-7611，1972；Savage等，生物學化學雜誌(J.Biol.Chem.)247；7612-7621，1972)。此後，其它成員也已被識別；它們包括牛痘病毒生長因子(VGF；Ventatesan等，病毒學雜誌(J.Virol.)44637-646，1982)、粘液瘤病毒生長因子(MGF；Upton等，病毒學雜誌(J.Viroi.)611271-1275，1987)、休普氏纖維瘤病毒生長因子(SFGF；Chang等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)7535-540，1987)、雙調蛋白(AR；Kimura等，自然(Nature)348257-260，1990)，和肝素結合EGF樣生長因子(HB-EGF；Higashiyama等，科學(Science)251936-939，1991)。這些因子的一個共同特徵是含有六個半胱氨酸的胺基酸序列，其中這些半胱氨酸形成三個二硫鍵交聯並維持一個使它們共同具有結合EGF受體能力基礎的保守結構。
EGF是迄今研究最多的家族成員，並是第一個被定位在腦組織中在發育期成人前腦和包括蒼白球、腹側蒼白球、腳內核、黑質和海馬回的中腦區域，發現有EGF樣免疫反應活性(IR)(Fallon等，科學(Science)2241107-1109，1984)。
EGF族的另一個成員TGFα，也被定位於腦組織中。它與EGF受體結合(Todaro等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA775258-5262，1980)，激活受體的酪氨酸激酶活性，並在廣泛的各種細胞類型中，引發相似的促有絲分裂反應(綜述，見Derynck，癌症研究進展(Adv.Cancer Res.)，5827-52，1992)。TGFα也可能結合於其它未識別的受體(這可有助於解釋它在某些細胞內的不同作用)。早已證明，TGFα-IR不均一地分布在整個成年大鼠中樞神經系統神經元的核周體和前腦星形膠質細胞亞群上(Code等，腦研究(Brain Res.)421401-405，1987；Fallon等，生長因子(Growth Factors)2241-250，1990)。利用核酸酶保護分析(Weickert和Blum，腦研究進展(Devel.Brain Res.)86；203-216，1995)和核酸原位雜交技術(Seroogy等，神經報導(Neuroreport)6105-108，1994)，在齧齒動物整個腦部(Lee等，分子細胞生物學(Mol.Cell.Biol.)53655-3646，1985；Kudlow等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)2643880-3883，1989)和紋狀體及其它腦區域(Weickert and Blum，腦研究進展(Devel.Brain Res.)86203-216，1995)已經檢測到TGFα mRNA。
TGFα和EGF mRNA在出生後早期達到其相對最高豐度(與總RNA相比)，此後下降，提示其在發育中起作用(Lee等，1985，見上文；Lazar和Blum，神經科學雜誌(J.Neurosci)121688-1697，1992)。在全腦，下降超過50％(Lazar和Blum，1992，見上文)，而在紋狀體，相對TGFα mRNA下降峰水平的2/3(Weickert和Blum，1995，見上文)。在整個發育期進行檢測，全腦TGFαmRNA超出EGF mRNA水平在1個數量級以上(Lazar和Blum，1992，見上文)。
通過免疫細胞化學方法表明，EGF受體被定位在大鼠腦的星形膠質細胞和皮質與小腦神經元的亞群，在人解剖腦標本的神經元中(Gomez-Pinilla等，腦研究(Brain Res.)438385-390，1988；Werner等，組織化學和細胞化學雜誌(J.Histochem.Cytochem.)3681-86，1988)。在用放射標記EGF的放射自顯影研究中，在大鼠皮質和包括紋狀體的皮質下區域發現EGF結合位點(Quirion等，突觸(Synapse)2212-218，1988)。原位雜交研究證明，EGF受體mRNA在紋狀體和腹側中腦核細胞中(Seroogy等，1994，見上文)及在發育和成年大鼠腦的增生區域中(Seroogy等，腦研究(Brain Res.670157-164，1995)。相對於EGF和TGFαmRNAS，紋狀體和腹側中腦核的EGF受體mRNA在發育期最豐富，隨著動物成熟而逐漸下降(Seroogy等，1994，見上文)。
在生理上，TGFα作用於全身眾多細胞類型，包括許多神經起源的細胞類型(綜述，見Derynck，1992見上文)。它支持培養的中樞神經元存活(Morrison等，科學(Science)23872-75，1987；Zhang等，細胞調節(Cell.Regul.)1511-521，1990)，以及與EGF不同，增強脊神經節感覺神經元的存活和軸突向外生長(Chalazonitis等，神經科學雜誌(J.Neurosci.12583-594，1992)。它也刺激發育和成年腦的神經元和神經膠質祖細胞的增生和分化(Anchan等，神經元(Neuron)6923-936，1991)。
近年來已研究了EGF-家族肽對培養物的中腦多巴胺神經元的營養作用。EGF增強在混合的中腦培養物中E16多巴胺神經元的存活(Casper等，神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)30372-381，1991)，但是它僅輕度刺激多巴胺攝取(Knusel等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)10558-570，1990)。TGFα也支持游離細胞培養物的中腦多巴胺神經元的存活，但它的作用較EGF更具選擇性(Ferrari等，神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)30493-497，1991；Alexi和Hefti，神經科學(Neurosci)55903-918，1993)。
EGF-家族生長因子的另一重要特徵是，它們具有保護中腦多巴胺細胞免受神經毒損害的能力。已經證實EGF保護多巴胺神經元免遭游離細胞培養物中的穀氨酸鹽和使君子酸鹽的細胞外毒素的侵害(Casper和Blum，神經化學雜誌(J.Neurochem.)651016-1026，1995)。也證實它保護培養的多巴胺細胞免受選擇性多巴胺神經毒1-甲基-4-苯基吡啶的損害(MPP+；Park等，腦研究(Brain Res.)59983-97，1992)，和在MPP+-處理的培養基中增加多巴胺攝取(Hadjiconstantinou等，神經化學雜誌(J.Neurochem.)57479-482，1991)。
EGF在體內的研究結果與在培養物中獲得的結果一致；EGF在兩種情況下均有神經保護作用。例如，腦室內(ICV)輸注EGF減少苯丙胺-誘導的旋轉，增加SN中酪氨酸羥化酶免疫活性(TH-IR)細胞的存活數量，及在PD大鼠模型中增加切斷黑質紋狀體通路後紋狀體的TH-IR纖維數(Pezzoli等，運動障礙(Movement Disord.)6281-287，1993；Ventrella，神經外科科學雜誌(J.Neurosurg.Sci.)371-8，1993)。將EGF ICV輸注至1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)損傷的小鼠腦中，增加多巴胺與3，4-二氫-zy苯乙酸(DOPAC)的含量和紋狀體酪氨酸羥化酶的活性(Hadjiconstantinou等，1991，見上文；Schneider等，腦研究(Brain Tes.)674260-264，1995)。
相對於EGF，TGFα儘管在體外具有更強的活性，但它在體內-特別是在患神經缺損的動物，包括人的營養作用是未確定的。如在這裡描述的，本發明是根據正常和異常(損傷的)中樞神經系統細胞中輸注TGFα所新發現的作用。
發明概述本發明特徵是治療患神經缺損患者的方法和組合物。該方法可以這樣進行，例如，通過將患者中樞神經系統(CNS)的神經元祖細胞與結合表皮生長因子(EGF)受體的多肽接觸(在體內或培養基中)，並引導增生祖細胞的子代全部移行到CNS區域，其中它們在此區域駐留並以足以減輕神經缺損的方式發揮作用。該方法可包括另一個步驟使神經祖細胞的子代與刺激分化的化合物接觸。
通過下面的附圖簡述、發明詳述和操作實施例，本發明的其它目的、優點和新特性將變得更清楚。
附圖簡述

圖1是大鼠前腦的冠狀切面圖。示於右邊的注射吸管代表可輸注生長因子的部位，紋狀體(str)。(大腦皮質＝ctx；側腦室＝1v)。
圖2A-2D是貫穿成年大鼠中腦的腦冠狀切面的顯微照片，照片顯示EGF受體mRNA的分布。在圖2A中，「感覺」探針用作對照。在圖2B-2D中，貫穿黑質(sn)的切面顯示，在海馬(hip)、sna中部和腹側被蓋區(vta)的臂旁核與黑旁paranigral核的中等豐度表達。在中腦的最-尾側(圖2D)，腳間核(ip)標記強度最大。刻度棒＝5mm。
圖3是貫穿輸注了TGFα的成年大鼠腦紋狀體的冠狀切面的顯微照片，顯示EGF受體mRNA的分布。在輸注的一側，鄰接側腦室的紋狀體內側雜交密度顯著增加。
圖4是貫穿輸注了TGFα並有6-OHDA損傷的成年大鼠前腦的冠狀切面的顯微照片，顯示EGF受體mRNA的分布。進行原位雜交以定位EGF受體mRNA，顯示很強的嵴伸入紋狀體體部。
圖5是表示5組受試動物中(正常；aCSF輸注，沒有損傷；aCSF輸注，損傷；TGFα輸注，沒有損傷；TGFα輸注，損傷)每組在紋狀體中TGFαmRNA雜交的平均標準化密度的直方圖。成對的棒代表在處理的紋狀體同側和對側的密度。對接受黑質6-OHDA損傷處理的兩組，同側平均雜交密度以四分之一程度顯著減小。紋狀體輸注TGFα肽對此減小沒有影響。均值±S.EM.(學生t-檢驗，同側-對側成對比較；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
圖6是表示在實施例5所述相同的5個受試組動物中，在側腦室邊界的沿紋狀體邊緣的室管膜下區TGFα mRNA雜交的平均標準化密度的直方圖。成對的棒代表在處理的紋狀體同側和對側的密度。接受T TGFα紋狀體輸注的兩組，在同側室管膜下區平均雜交密度大約增倍。均值±S.EM.(學生t-檢驗，同側-對側成對比較；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
圖7是表示在紋狀體嵴、紋狀體非-嵴部和所有動物紋狀體嵴室管膜下區TGFα mRNA雜交的平均標準化密度的直方圖。成對的棒代表在處理的紋狀體同側和對側的密度。在處理同側的紋狀體嵴中，TGFα mRNA雜交的平均標準化密度最高。在對側紋狀體沒有出現紋狀體嵴。TGFα輸注。均值±S.EM.(學生t-檢驗，同側-對側成對比較；P值，*P＜0.005，**P＜0.001)。
圖8A和8B是接受黑質6-OHDA損傷和TGFα輸注14天的成年大鼠腦貫穿紋狀體的冠狀切面的顯微照片。圖8A，處理同側的尾狀核-豆狀核銀染色顯示在嵴的背部有大量細胞，許多細胞呈現細長的形態學並正常朝室管膜下區方向定向。沿側腦室(1v)部位細胞數量也增加。在對側紋狀體(圖8B)中，紋狀體或沿側腦室部位的細胞群均未擴展。
圖9A-9D是用6-OHDA損傷和TGFα輸注不同時間期限的成年大鼠腦硫素-染色的冠狀切面的顯微照片。圖9A，輸注4天後，室管膜下區的細胞擴展僅在背景染色基礎上可檢測到。圖9B，輸注6天後，靠近側腦室集合的硫素-染色的細胞非常粗大。圖9C，輸注9天後，在細胞擴展的腹側末端，相對於室管膜下區輕度外側處顯示濃厚地染色的細胞區域。圖9D，輸注14天後，濃密的形成良好的嵴明顯地伸進紋狀體的體部。
圖10A和10B是6-OHDA損傷和TGFα輸注14天的成年大鼠腦冠狀切面的顯微照片。圖10A，nestin免疫組化顯示強的紋狀體嵴。圖10B，接近-交界切片的硫素染色證實nestin-IR細胞和紋狀體嵴之間的標記。
圖11A-11C是6-OHDA損傷和在距側腦室不同距離處TGFα輸注14天的成年大鼠腦硫素-染色的冠狀切面的顯微照片。圖11A，輸注插管插入遠-腹側紋狀體，嵴與室管膜下區平行並較在中-紋狀體輸注時所見的密度小。圖11B，輸注插管插入中-紋狀體，嵴特徵性地呈S-形狀，腹側部分伸向遠處進入腹側紋狀體。圖11C，緊緊靠近側腦室輸注，紋狀體嵴是L-形狀並通常顯示出非常濃厚的硫素染色。
圖12是描述用6-OHDA損傷黑質和中-紋狀體TGFα輸注14天後成年大鼠腦冠狀切面紋狀體嵴的最大外側位移(從側腦室；單位為mm)的直方圖。根據「方案A」(左-最大棒)處理的動物，首先接受損傷，然後用TGFα輸注4～5周。根據「方案B」處理的動物，開始輸注14天TGFα後接受損傷2天。均值±S.EM.(學生t-檢驗，P值，*P＜0.01)。
發明詳述I.紋狀體和黑質紋狀體系統A.解剖學、連接和神經化學在腦中，紋狀體、蒼白球、黑質、被蓋區(VTA)、下丘腦核和杏仁核共同稱為基底神經節。紋狀體包含背側和腹側部分，每一部分進一步細分為其它解剖結構。人的背側紋狀體由尾狀核和豆狀核組成。C-形尾狀核沿著側腦室的弧度。其尾部伸出超過下角末端並在雙顳側與杏仁核連接。尾狀核的頭從前角的前端轉向腹側並與豆狀核融合。儘管人腦的解剖學差異很大，但在齧齒動物中，它們結合成共同結構，尾狀核-豆狀核或尾狀豆狀核。
腹側紋狀體由聽神經核、嗅結節和有關的紋狀體細胞橋構成。蒼白球包括球蒼白球、腳內核(entopeduncular nucleus)、網狀黑質部分(SNr)和腹側蒼白球。腳內核和SNr具有非常相似的傳入和傳出聯繫。腹側核包含既與蒼白球相似又與腳內核相似的混合聯繫區域。黑質的其它部分，緻密部分(SNc)，包括跨越黑質-腹側蓋區(SN-VTA)的多巴胺神經元以及在SNr中的多巴胺細胞叢。基底節環路相當複雜，但在大鼠和人是非常相似的(Fallon和Loughlin，大腦皮質(cerebral cortex)，E.G.Jones和A.Peters編著，第6卷，第41-127頁，Plenum出版，紐約，1987；Alheid和Heimer，腦研究進展(Progr.Brain Res.)107461-484，1996)，這使得大鼠成為研究哺乳動物腦中該系統的聯繫、神經化學、藥理學、功能和臨床相互關係的非常有用的模型。
紋狀體，與基底節的其它核一起參與運動和情緒的調節。影響該系統或其神經支配的許多疾病與運動神經元損傷嚴重有關，經常伴有情感障礙。
尾狀核和豆狀核是基底節的初級傳入神經核，並接受來自大腦皮質和丘腦中央核及丘腦板內核的興奮性投射。皮質紋狀體的傳入纖維是穀氨醯能神經。丘腦的傳入纖維也被認為是穀氨醯能神經。黑質部紋狀體(SNc)通過黑質紋狀體通路提供緻密多巴胺能傳入纖維到紋狀體(對大鼠此系統的綜述，見Fallon和Loughlin，大鼠神經系統(The Rat Nervous System)，G.Paxinos，編著，第215-237頁，學術出版社，聖地牙哥，1995)。腹側紋狀體和聽神經核接受大量來自中腦腹內側VTA的多巴胺細胞的多巴胺能神經支配。來自杏仁核的邊緣傳入纖維和來自中腦或中縫核的5-羥色胺能纖維也終止在腹側紋狀體。
紋狀體傳入纖維的分布和終止並不是簡單地代表它們的起始區域。紋狀體構成埋入功能和化學上均與其不相同的周圍基質中的斑或帶狀體。這種結構最初應用乙醯膽鹼酶(AChE)組織化學法得到證明，此AChE選擇性地使基質著色(Graybiel和Ragsdale，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，755723-5726，1978)。自那以後，組織化學酶、免疫細胞化學、原位雜交、放射標記配體結合受體、順行變性和其它方法已被用於識別許多其它在兩個隔室中不同分布的標誌物。基質標誌物包括鈣結合蛋白、生長抑素和多巴胺攝取([3H]馬吲哚結合)位點(Gerfen，J.Comp.Neurol.236454-476，1985；Voorn等，J.Comp.Neurol.289189-201，1989)。帶狀體能通過其相對較高豐度的腦啡肽、伴有黑質紋狀體損害的5』-核苷酸酶活性、酪氨酸羥化酶、mu opoid結合受體和P物質而被識別(Graybiel等，神經科學(Neurosci.)6377-397，1981；Schoen和Grabiel，J.Comp.Neurol.322566-576，1992)。然而，象可能預料的那樣，這些標誌物中許多有種屬間變異和發育變異，而且某些僅在紋狀體特定區域是有用的。
斑或基質隔室中許多紋狀體通路的選擇性起始和終止使得化學標誌物的多相性進一步複雜化。例如，從運動原、扣帶回、軀體感覺和基質中皮質末端視覺區域的傳入纖維(Gerfen，自然(Nature)311461-464，1984；Donoghue和Herkenham，腦研究(Brain Res.)365397-403，1986)。大多數來自邊緣皮質深處V層和VI層的皮質紋狀體傳入纖維終止於斑，而大多數來自較淺的V層和II、III層的傳入纖維終止於基質(Gerfen，科學(Science)246385-388，1989)。來自VTA和SNc背層的傳入纖維提供多巴胺能傳入神經進入基質。斑接受來自SNc腹層的多巴胺神經分布和SNr中的多巴胺細胞叢(Schoen and Graybiel，J.Comp.Neurol.322566-576，1992)。在背側紋狀體，來自丘腦內側部核的傳入纖維終止於斑，而來自外側部的傳入纖維(包括前、後板內核和rostral ventral tier nuclei)主要分布於基質組織(Ragsdaleand Graybiel，J.Comp.Neurol.311134-167，1991)。此外，發自杏仁核基底外側核的紋狀體杏仁核纖維，選擇性地分布於斑隔室(Ragsdale和Graybiel，J.Comp.Neurol.269506-522，1988)。
紋狀體傳出纖維對於斑-基質組織來說也是特異分布的。已經證明，發自紋狀體兩個主要通路之一的紋狀體黑質通路由兩個不同的投射組成。來自斑隔室神經元的纖維終止在腹側SNc多巴胺神經元周圍和SNr多巴胺細胞群上。基質神經元引起局部圖解式排列的投射到SNr，包括非-多巴胺能區域和樹突位於SNr的多巴胺神經元(Gerfen，1984，見上文；Jiminez-Castallanos和Graybiel，神經科學(Neurosci.)32297-321，1989)。
其它主要傳出投射，即紋狀體蒼白球通路，投射到蒼白球。尚未表明它的分布與斑-基質組織有關；然而，它在神經化學上不同於紋狀體黑質系統。大多數紋狀體蒼白球纖維表達腦啡肽而非強啡肽或P物質。相反，很少的紋狀體黑質投射含有腦啡肽，但多數表達強啡肽和P物質(Gerfen和Young，腦研究(Brain Res.)46061-167，1988)。在靈長類，兩個系統起源的解剖學區域也不同紋狀體蒼白球的傳出纖維主要來源自豆狀核，而紋狀體黑質的傳出纖維主要源於尾狀核(Parent等，腦研究(Brain Res.)303385-390，1984)。
除了紋狀體連接的多相性分布外，在紋狀體還發現了幾種形態上和化學上不同類型的神經元(Albin等，神經科學趨勢(Trends Neurosci.)12366-375，1989；Groves，腦研究回顧(Brain Res.Rev.)5234-238，1983)。基於它們的樹突形態，把它們傳統地分為棘狀或非棘狀神經元。紋狀體中有兩類普遍認識的棘狀神經元，它們含有γ-氨基丁酸(GABA)、P物質、腦啡肽和強啡肽的多種聯合，但主要是GABA能。中等棘狀神經元(棘狀I型)是迄今最豐富的，包含所有紋狀體神經元的90-95％。它們有光滑的細胞體並且在它們樹突的遠端部分密集地積聚著棘突。其樹突的分枝範圍距離細胞體大約200μm。中等棘神經元是SNc中多巴胺能神經元的主要終極靶，主要在棘樹突莖上形成突觸。棘狀II型神經元非常大，伴有可變異的延伸出距離細胞體高達約600μm的樹突。
棘神經元是紋狀體的投射神經元。在含有GABA和P物質基質中的那些，主要投射到蒼白球內部片段(GPi)和SNr，另一方面，含有腦啡肽的棘狀GABA能基質神經元，神經分布於蒼白球外部片段(GPe)。斑隔室的棘神經元將大多數傳出纖維傳送到SNc(Albin等，1989，見上文)。
兩個主要傳出通路的紋狀體投射神經元通過其多巴胺受體亞型也能被辨別。投射到黑質的P物質/強啡肽神經元主要表達D1多巴胺受體，而腦啡肽能紋狀體蒼白球神經元主要表達D2受體，然而，在每一種投射中，沒有一種受體類型是特異性的表達(Besson等，神經科學(Neurosci.)26101-119，1989；Gerfen等，科學(Science)2501429-1432，1990)。
三種確認類型的棘神經元組成了紋狀體中間神經元群(Groves，1983，見上文；Carpenter，在神經科學核心教材(Core Text of Neurosciences)，325-360頁，Williams和Wilkins，巴爾蒂莫(Baltimore)，1991)。它們一起佔紋狀體神經元總數的10％或略少。棘狀I型神經元是三種神經元中最常見的，有略微小於中等神經元的光滑的樹狀樹突。它們大部分是GABA能，但許多含有生長抑素和神經肽Y。棘狀II型神經元通過其大的細胞體和AChE與膽礆乙醯轉移酶(ChAT)染色來識別。該類型細胞與中等棘神經元形成對稱的突觸。中等棘狀III型神經元特徵最少，但認為它含有GABA。除了已經識別的神經元亞型之外，可能還有其它化學上定義和連接上定義的這些類型神經元的亞型。
B.局部解剖圖和發育在中腦多巴胺系統的紋狀體投射中用順行性和逆行性跟蹤劑進行實驗，揭示成年齧齒動物精細的局部解剖圖(Fallon和Moore，J.Comp.Neurol.180545-580，1978)。背側紋狀體接受來自腹側和中間SN及VTA神經元的多巴胺能神經支配。腹側紋狀體及聽神經核接受來自背側VTA和中間SN的多巴胺能傳入纖維(Fallon，Ann.NY Acad.Sci.5371-9，1988)。
發育系統神經發生的梯度與成熟系統投射的局部解剖圖排列相平行。在大鼠胚胎期之前15天(E15)，胚胎中SN的背外側部分是最早產生的(Altman和Bayer，J.Comp.Neurol.198677-716，1981)。來自該區域的投射支配紋狀體的外側和腹側區域(Carter和Fibiger，神經科學(Neurosci.)2569-576，1977；Veening等，神經科學(Neurosci.)51253-1268，1980)，這也是最早產生的紋狀體區域(Bayer，神經科學(Neurosci.)4251-271，1984)。由於較年輕的神經元以腹外側到背內側的梯度在紋狀體聚集，所以來自SN的更多腹內側(及以後產生的)部分(E15後產生)的傳入纖維分布於這些以後產生的紋狀體區域。這樣，最年輕的(腹內側)黑質多巴胺神經元使神經分布於最年輕的(背內側)紋狀體神經元，而較老的(背外側)黑質多巴胺神經元使神經分布於較老的(腹外側)紋狀體神經元。該模式也在GABA能紋狀體黑質投射中進行了重複(Bunney和Aghajanian，腦研究(Brain Res.)117423-435，1976)。
紋狀體神經元是從出生前和出生後早期腦中的圍繞側腦室的神經上皮衍生而來。一個室區域最初排列腦室，以後與正好在其下方的室下(或室管膜下)區域聯繫。當腦成熟時，室區域消失，但室管膜下區域繼續形成一薄層細胞，該區域含有神經幹細胞和祖細胞，這些祖細胞沿著一個限定的和受限制的通路移行到嗅球充滿易變中間神經元的細胞群(Luskin，神經元(Neuron)11173-189，1993；Lois和Alvarez-Buylla，科學(Science)2641145-1148，1994)。
C.病理學紋狀體及其多巴胺能神經支配易受許多疾病的傳染，包括神經變性疾病(Albin等，1989，見上文)如亨廷頓病(HD)和帕金森病(PD)。HD是一種常染色體顯性遺傳性疾病(4號染色體)，其特點是紋狀體進行性變性。它與四肢和面部不隨意的舞蹈樣不自主(choreathetotic)運動及隨意運動障礙有關(綜述，見Purdon等，精神病學神經科學雜誌(J.Psychiatr.Neurosci.)16359-367，1994)。在基質隔室中的中等棘狀GABA能神經元最易受影響，特別是投射到GPe的GABA/腦啡肽能神經元(Albin等，1989，見上文)。也在基質隔室中發現的大的非棘狀膽礆能中間神經元和含有生長抑素、神經肽Y和NADPH-黃遞酶的小的非棘狀中間神經元則相對地被閒置(Ferrante等，科學(Science)230561-563，1985；Reiner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855733-5737，1988)。然而，在HD更進一步的發展階段，神經元變性包括各型紋狀體神經元和蔓延到基底神經節、大腦皮質、下丘腦和小腦的其它核。
帕金森病(PD)的特點是靜止性震顫、強直、不能初始運動(不能運動)和運動緩慢(運動遲緩)(Marsden，Lancet 335948-952，1990)。與運動缺損有關的是多巴胺能黑質紋狀體通路的進行性變性，和不同程度的聽神經核多巴胺神經支配的缺失以及藍斑去甲腎上腺素能細胞和縫的5-羥色胺能神經元變性有關(Javoy-Agid等，神經病學進展(Adv.Neurol.)40189-198，1984；Agid，Lancet 3371321-1327，1991)。在明顯的運動缺損出現以前，高達80％的黑質多巴胺神經元可能缺失。
在神經變性性疾病的治療中，使用已知為神經營養因子的肽類作為治療劑的主要策略之一是抑制變性過程和提高殘餘細胞的功能。在下面實施例中的研究將闡明本發明如何開拓除了以前已經提示之外的神經營養因子的應用。
II.神經缺損的治療如下面的實施例證實的那樣，成人前腦室管膜下區的神經元前體可能對輸注結合EGF受體的多肽(例如，TGFα；這裡使用的術語「多肽」是指任何胺基酸殘基鏈，而不考慮長度或翻譯後修飾)反應，而被刺激增生並且全部移行進入中樞神經系統(CNS)(例如，進入紋狀體)。另外，人們可以把增生細胞作為緻密嵴定向移行。如下面所述，定向移行可按不同方式完成。例如，它通過被靶區域的去神經(它可通過神經化學或機械力來達到)、通過使用多肽生長因子(例如，TGFβ，它增加細胞粘附分子(如纖連蛋白和層粘連蛋白)的區域性表達)，和通過將細胞沿著所需移行的通路與對抑制移行的自然發生信號具有抑制作用的化合物進行接觸來進行(即，通過抑制一種抑制劑而創造一個許可的微環境)。
此外，移行嵴的形狀可通過改變輸注位置加以控制(例如，通過變更輸注套管或含有本發明活性成分的生物降解性膠囊的位置)。相似地，嵴內的細胞數目可以通過改變活性成分的劑量來控制(例如，TGFα的劑量)，或者通過改變釋放化合物相對於室管膜下區域神經前體細胞群的距離。如下面所述(如表10A，10B，11A，11B和11C所說明的)，當動物接受了中紋狀體或中層紋狀體輸注時，移行細胞在它們到達輸注插管以前即停止，產生S-型或L-型嵴。這樣，不僅可能促進細胞的移行而且可能控制移行的終點。調節生長因子(和也許其它的成分)釋放的劑量和部位可以使受影響的區域限制到一個相對局限的靶區域。
在成年哺乳動物腦中神經系統前體細胞的增生和移行是可以獨立控制的不同的過程。沒有傳入神經阻滯的TGFα或EGF腦室內(ICV)或紋狀體內輸注能誘導增生，但是變性的、損傷了的(例如，因傳入神經阻滯或其它損傷)，或者其它異常的(即，機能不良)細胞一定表現出促進移行的程度至少足以影響神經缺損的修復。如下面進一步所述，人們可以模仿藥物對變性的、損傷的或其它異常細胞的促進作用。例如，通過給藥一種誘導化合物刺激紋狀體中細胞粘附分子的短暫表達。例如，在小腦星形膠質細胞培養物中，轉化生長因子β(TGFβ)使纖連蛋白強有力地上調(Baghdassarian等，Glia 7193-202，1993)。在過度表達TGFβ的轉基因小鼠中，纖連蛋白和層粘連蛋白在中樞神經系統也大大增加超過了正常水平(Wyss-Coray等，美國病理學雜誌(Am.J.Pathol.).14753-67，1995)。這樣，用刺激細胞外基質分子或細胞粘附分子表達的任何化合物來指導移行，特別是沿著所需移行通路的定向移行也認為是在本發明的範圍之內。
前腦神經幹細胞，即引起移行的祖細胞，據信停留在沿著腦室壁的適當位置(Morshead等，神經元(Neuron)131071-1082，1994)。在下面描述的實驗中，在移行嵴進入紋狀體之後，強的EGF受體雜交區域繼續沿著側腦室停留。此外，在嵴和側腦室之間總能發現伸長的細胞。這樣，儘管整個細胞團移行離開室管膜下區域，但幹細胞本身可能不是移行嵴的部分。這些神經幹細胞提供新神經元和神經膠質細胞的可再生來源。因此可刺激神經祖細胞的多個波以移行進入受損的、或者已變性的或者其它與神經缺損有關的腦區域。這些細胞的持續性也提示成年前腦中的幹細胞的正常功能--目前認為是為嗅球提供新神經元--不應該被治療不可逆地打斷。
TGFα(及其mRNA)的紋狀體大量表達和多巴胺能神經支配的缺乏也是發育早期紋狀體的特性(Weickert和Blum，腦研究進展(Devel.Brain Res.)86203-216，1995；Bayer，Intl.J.Devel.Neurosci.2163-175，1984)。相似地，在TGFα-輸注動物中室管膜下區域EGF受體mRNA表達的增加，擬似在發育期腦室周神經上皮中所見到的大量EGF受體mRNA雜交(Seroogy等，腦研究(Brain Res.)670157-164，1995)。編碼可以促進神經祖細胞移行的粘連蛋白、其受體和其它細胞粘附分子的信使RNAs也被發育性調節(Pesheva等，神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)20420-430，1988；Prieto等，細胞生物學雜誌(J.Cell Biol.)111685-698，1990；Pagani等，細胞生物學雜誌(J.CellBiol.)1131223-1229，1991；Linnemann等，國際神經科學進展雜誌(Int.J.Devel.Neurosci.1171-81，1993)。這樣，如在本研究中輸注TGFα和6-OHDA損傷的動物中觀察到的效果概念化的一種方式是如對胚胎神經發生的選擇性概括那樣。即，成年哺乳動物腦中的神經幹細胞可以對增生信號作出反應，它們的子代細胞可以對移行信號作出反應，就象它們在發育期動物中所進行的那樣。
近來，在成年齧齒動物CNS整個室管膜下(Weiss，Soc.Neurosci.Abstr.25101，1995；Ray等，Soc.Neurosci.Abstr.22394.5，1996)和在成年人前腦的室管膜下(Kirschenbaum等，腦皮質(Cerebral Cortex)4576-589，1994)已經發現了神經幹細胞。按照本文中描述的方法，可以利用這些細胞為腦和脊髓不同區域的病態的、受損的、或其它損傷的或機能不良的CNS神經元提供一種新的神經元來源。
A.本發明的優點如下面進一步所述，提出的治療神經病缺損的技術之一涉及從有此類缺損的病人中取出神經前體並使這些前體在培養基中生長以產生大量神經祖細胞。然後應用本領域普通技術人員已知的技術將這些祖細胞重新植入同一病人(例如，見Stein等，在腦修復(Brain Repair)第87-103頁，牛津大學出版社，紐約，1995，或leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.22505，1996)。很顯然，該技術對於那些目前需要使用來自流產胎兒胚胎細胞的技術來說是先進的；它完全避免了由於需要使用流產胎兒作為組織供體而引發的倫理問題。另外，由於它不會刺激引起較高移植排斥發生率的免疫反應，所以它更可能會成功。
在體內刺激神經前體的增生和移行還有另外的優點；體內刺激降低了攻擊性神經外科操作的程度和可能的數量。不進行幹細胞切除手術，使用胚胎的或培養細胞移植物時通常需要的多樣移植細胞栓將不再是必需的。此外，不會有由於移植過程引起的未分化神經祖細胞的大量消亡。通常，使用人胎兒的多巴胺能細胞移植，90％到超過99％的植入細胞在它們在宿主腦內建立以前死亡(Freed等，Soc.Neurosci.Abstr.22481.3，1996)。
本發明提供的另一個優點是神經祖細胞不通過瘢痕組織從宿主腦分離出來。移植細胞栓被包封在膠質疤痕組織與反應性星形膠質細胞的殼內。除了緻密膠質組織的物理屏障外，疤痕組織內反應性星形膠質細胞釋放抑制軸突自然伸長的因子(Mckeon等，1995)。在體內產生的神經祖細胞不是通過疤痕組織從腦的其它部位分離的。因而，其軸突的自然生長不會因為反應性星形膠質細胞大量增生而受到限制。因此，本發明提供的定向移行允許大量新細胞選擇性地在CNS特定損害區域再集聚(其在程度上可以不同)而不幹擾未損害區域。
本發明的技術也較以前在體內進行的刺激前腦神經幹細胞的單一研究有了進步。在那項研究中，成年大鼠接受EGF的ICV輸注6天，接著高達7周的後輸注(Craig等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。在本研究中，TGFα輸注14天，接著輸注小於3個月結束輸注。其差別是關鍵的，因為僅在本研究中室周擴展的細胞以整體移行進入下覆的紋狀體中。神經祖細胞團定向移行進入選擇的靶區域代表一個非常優選使新神經元再集聚在變性的腦區域的方法。
近來非常感興趣的一個領域是控制神經幹細胞分化。一旦幹細胞已經分化，細胞的最後定位和神經化學表型則是最重要的並且在下面將進一步討論。
當神經前體細胞從成年齧齒動物腦中取出並在體外分化時，可見到免疫化學性地識別為星形膠質細胞、少突神經膠質細胞和神經元的細胞(Reynolds和Weiss，科學(Science)255.1707-1710，1992；Reynolds等，J.Neurosci.124565-4574，1992；Lois和Alvarez-Buylla，Proc.Natl.Acad.Sci.USA902074-2077，1993)。許多識別為神經元的細胞對於在紋狀體發現的兩種正常細胞類型的神經化學標誌物-GABA和P物質，也存在免疫反應。從成年人腦中移植的前體細胞也表達神經元的標誌物並顯示與神經元有關的神經元電生理特性(Kirschenbaum等，腦皮質(Cerebral Cortex)4576-589，1994)。
這些實驗提示當紋狀體嵴細胞在體內自發分化時，其中許多將變成具有紋狀體神經元典型表型的細胞。最近一些數據提示它們的表型可通過暴露於不同聯合的神經營養蛋白而被改變(Lachyankar等，Soc.Neurosci.Abstr.22394.7，1996)。接受不同處理的前體細胞一旦分化，它們表達不同的神經化學免疫標誌物，包括乙醯膽鹼酯酶、GABA、，酪氨酸羥化酶(TH)和鈣結合蛋白。TH的表達特別令人感興趣，因為增生、移行和定向分化為多巴胺細胞的聯合可以提供一種新方法來替代帕金森氏病(PD)中喪失的紋狀體多巴胺。
在PD病人中，大量新的功能性產生多巴胺的紋狀體細胞有助於逆轉運動缺損，其方式類似於用流產胎兒的腦組織移植。在亨廷頓氏病(HD)病人中，神經前體會受到刺激而使新的中等棘狀GABA能和其它神經元在紋狀體處再集聚，而在該疾病時中等棘狀GABA能和其它神經元喪失。近來某些來自不同研究領域的證據指出紋狀體蒼白球通路本身的重建也許是可能的。移植進入紋狀體的在條件控制下不死的神經前體細胞分化並且把突起從紋狀體發送到蒼白球(Lundberg等，1996)。
B.可治療的神經缺損由於本發明建立在多潛能前體細胞受到刺激而在腦內分化和移行的發現上，所以它被用來治療由各種各樣的疾病、障礙和損傷引起的神經缺損。這些損傷包括，但不限於，下列所述(本領域技術人員可以對下面所列的不同疾病和障礙進行分類；然而歸類的有關神經缺損按照本發明方法是可以治療的)。
1.變性疾病按照本發明方法可以治療的變性疾病包括阿耳茨海默氏病(AD)、帕金森氏病(PD)、亨廷頓氏病(HD)、匹克氏病、進行性核上麻痺(PSP)、紋狀體黑質變性、皮質-基底節變性、兒童期分裂症、橄欖體腦橋小腦萎縮症(OPCA；包括可遺傳的類型)、萊內氏病(Leigh disease)、嬰兒壞死性腦脊髓病、亨特氏病(Hunter’s disease)、粘多糖病、各種腦白質營養不良(如克臘伯氏病(Krabbe’s disease)、家族性腦中葉硬化(Pelizaeus-Merzbacher disease)等等)、黑蒙性(家族的)白痴(amaurotic(familial)idiocy)、庫福斯氏病(Kuf’sdisease)、家族黑蒙性白痴(Spielmeyer-Vogt disease)(少年型)、家族黑蒙性白痴(Tay-Sachs disease)、巴氏病(Batten)、Jansky-Bielschowsky病、Reye氏病、小腦共濟失調、慢性酒精中毒、腳氣病、哈斯二氏症候群(Hallervorden-Spatz syndrome)、小腦變性等等。
2.中樞神經系統外傷和神經毒損傷按照本發明方法治療的外傷和神經毒損傷包括槍擊傷、鈍傷、穿透傷(如刺傷)、手術操作過程中造成的損傷(例如，從中樞神經系統中切除腫瘤或膿腫或治療癲癇)、中毒(例如，MPTP或一氧化碳引起的中毒)、嬰兒顫抖症候群、藥物的不良反應(包括特應性反應)、藥物過量(例如，苯丙胺過量)、創傷後腦病等等。
3.局部缺血神經系統供氧和血流的任何中斷均可能損傷或殺死其中的細胞，包括神經元和神經膠質細胞。按照本發明方法可以治療這些損傷和包括發作(包括全身發作(如可能起因於心臟驟停、心律失常或心肌梗塞)或病灶發作(如可能起因於血栓、栓子、出血或其它的動脈阻塞))引起的損傷、缺氧、低氧、不完全淹溺、肌陣攣、嚴重吸菸、張力障礙(包括遺傳性張力障礙)、後天性腦積水等等。
4.發育障礙本發明方法可以治療的發育性障礙包括精神分裂症、某些嚴重的精神發育遲緩、大腦性癱瘓(不論引起的原因是否是感染、缺氧、早產、血型不合等等和不論表現是否為視覺缺失、聾、遲緩、精細運動不能等等)、先天性腦積水、影響CNS的代謝障礙、嚴重的孤獨症、Down症候群、LHRH/下丘腦障礙、脊柱裂等等。
5.影響視覺的障礙本發明方法可以治療影響視覺的障礙，特別是那些因視網膜細胞缺失或衰竭引起的障礙。這些障礙包括糖尿病性視網膜病、嚴重的視網膜脫離、與青光眼有關的視網膜損害、視網膜創傷性損傷、視網膜血管閉塞、黃斑變性、遺傳性視網膜營養不良、視神經萎縮和其它視網膜變性疾病。
6.脊髓損傷和疾病本發明方法也可以治療影響脊髓的損傷和疾病。這種損傷或疾病包括脊髓灰質炎後遺症、肌萎縮性側索硬化、非特異性脊髓變性、外傷損傷(如機動車或運動事故引起的損傷，包括擠壓、部分離斷、完全離斷的任何損傷、或者影響脊髓細胞功能的其它有害方式)、脊髓手術引起的損傷(例如，切除腫瘤)、前角細胞疾病、麻痺性疾病等等。
7.脫髓鞘或自身免疫性疾病本發明方法可以治療由脫髓鞘或自身免疫反應引起的神經缺損。該缺損可能由多發性硬化、狼瘡和其它原因引起。
8.感染性或炎症性疾病本發明方法可以治療由感染性或炎症性疾病引起的神經缺損。能夠引起可以治療的缺損的感染性或炎症性疾病包括痙攣性假硬化和其它慢性病毒感染性疾病、AIDS性腦病、腦炎後帕金森氏症候群、病毒性腦炎、細菌性腦膜炎和由其它微生物引起的腦膜炎、靜脈炎和顱內靜脈竇血栓靜脈炎、梅毒性帕金森氏症候群、CNS結核等等。
9.其它本領域普通技術人員能很好地認識無論什麼原因的神經缺損，並且能應用本發明方法治療有這種缺損的病人。除了上面所列的病症外，本發明方法還可以治療下述原因引起的神經缺損施萊奈恩二氏症候群、重症肌無力、各種痴呆、大量由寄生蟲引起的疾病、癲癇等等。本發明方法可以很方便地用於減輕由這些和其它疾病、障礙或損傷引起的神經缺損。
C.與EGF受體結合的多肽1.EGF家族EGF家族中的多肽在某種程度上似乎是獨立的。例如，TGFα和EGF僅有30％結構同源性(Marquardt等，科學(Science)2231079-1082，1984)。然而，它們顯示相似的結合動力學，並刺激分子量為180,000的EGF膜受體酪氨酸-特異性磷酸化(Cohen等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)2554834-4842，1980；Reynold等，自然(Nature)292259-262，1981)。兩種生長因子功能上的等同，部分與六個半胱氨酸殘基的相對位置相同有關，在共有序列CX7CX4，5CX10CXCX8C中用」C」表示半胱氨酸殘基。這些保守殘基產生類似的二硫鍵-介導的結構約束，並因此形成相關的三維結構(Twardzik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 825300-5304，1985)。本領域普通技術人員能夠很好地將已知的任何胺基酸序列與EGF-家族共有序列進行比較以決定一個多肽是否有可能與EGF在功能上相等(如果如此的話，則適用於本發明方法)。(參見例如，Blomquist等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817363-7367，1984，描述了揭示半胱氨酸和甘氨酸殘基在EGF、TGFα和牛痘病毒19kDa早期蛋白的序列中的相似模式的計算機檢索)。
除EGF、TGFα和牛痘病毒(VGF)以外，已知EGF家族包括雙調蛋白(AR)、β-動物纖維素(BTC)、(epiregulin)(ER)、肝素-結合EGF-樣生長因子(HB-EGF)、神經鞘瘤-衍生的生長因子(SDGF)、HUS 18878、粘液瘤病毒生長因子、休普氏纖維瘤病毒和畸胎瘤-衍生的生長因子-1(TDGF-1；也稱為Cripto-1(CR-1))。
2.測定EGF受體結合的方法本領域普通技術人員能夠方便地測定任何已知的多肽是否與EGF受體結合。這裡使用的術語「結合」指多肽和EGF之間任何特異性相互作用，其中這種相互作用導致足夠信號傳導以引發生物反應，優選是導致減輕神經缺損的反應。優選地，適用於本發明方法的任何已知多肽將與EGF受體結合，其中親和力至少為EGF本身結合親和力的50％，更優選至少70％，最優選至少90％(見Twardzik等，見上文，VGF、TGFα和EGF在EGF受體結合方面的生物活性比較)。
如果在進行EGF受體結合試驗中需要指導，本領域技術人員可查閱描述適宜方法的多種出版物中的任何一本(與該主題有關的5本出版物在此全面引用)。例如，可以參閱Cohen和Carpenter，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 721317-1321，1975)或者，它們的修訂版，Twardzik等，見上文。類似地，對於EGF受體，包括特異性結合和序列信息、信號和受體拓撲學，可以參閱例如，McInnes和Sykes(生物聚合物(Biopolymers)43339-366，1997)，Boonstra等，(國際細胞生物學(Cell Biol.Intl.)19413-430，1995)，或Gill(分子生殖發育學(Mol.Reprod.Dev.2746-53，1990)。
D.定向移行下面的實施例也提供神經前體細胞成功地定向移行的證據，特別是在成年齧齒動物前腦。在下面的操作實施例中使用的免疫組化和其它技術(和其中詳細描述的)，以及本領域普通技術人員常用的可比技術，可用於確定任何生長因子輸注或任何其它用於引導細胞移行的刺激物的作用。的確，可以追蹤細胞移行的某些細節(即，可測定神經系統內細胞數量、它們的大小、形狀和位置)。
在體內，各種刺激可用於細胞以定向引導全部細胞的移行(術語「全部」，在這裡用於描述細胞移行時，是指細胞群基本上向相同方向移動足夠時間被看成一團(正如圖9、10和11所顯示的那樣))。廣義地，可以按一種或兩種方式定向移行(1)助長(conducive)方式，即，使用正向吸引移行細胞的刺激物(如增加細胞粘附分子或細胞外基質分子(例如粘連蛋白、層粘連蛋白或神經細胞粘附分子)表達的化學吸引劑、神經營養因子或化合物(如TGFβ))，或者(2)允許方式，即，通過使用抑制那些會抑制移行細胞的信號的刺激物。
定向移行的刺激包括在靶區域(可以是細胞已被破壞的部位，例如，紋狀體或黑質，在這些部位已知多巴胺能細胞毀損與大量衰弱性神經變性疾病有關；大腦皮質，此處神經元和神經膠質毀損是由血栓或栓塞發作後引起的局部缺血所致；或者脊髓，此處運動神經元由於例如創傷而被毀損；或者由於發育障礙使細胞形成異常聯繫的任何部位)中組織損傷。另一方面，可以在從神經祖細胞發源地向其所需移行終點伸出的通道內或沿著此通道損傷組織。
組織可以下列方式受損傷物理力(例如，腐蝕或切除神經元，或切斷一種或多種由神經細胞體伸出的突起)、使用化學物質如毒素或神經毒素(例如，蓖麻毒或6-OHDA)、腐蝕性化學製劑(例如，酸或鹼溶液)、誘導細胞程序性死亡的化合物(參見例如，Leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.22505，1996)、或者誘導脫髓鞘作用的化合物(參見例如，Leavitt等，Soc.Neurosci.Abstr.231689，1997)、或能夠抑制細胞活性的化合物，例如反義寡核苷酸(如抑制編碼細胞主要神經遞質基因的轉錄)、抗體或多肽。許多此類化合物為本領域技術人員所熟知，並且包括那些與細胞表面受體結合但未能激活受體的化合物，例如metabotropic受體通常被穀氨酸鹽結合的。例如，在下面描述的研究中，利用6-OHDA(與輸注TGFα一起)的去多巴胺神經作用對細胞移行的影響是顯然的。
本領域普通技術人員使用上述任何一種化學物質能夠很好地將細胞定向移行到神經系統的靶區域，特別是現在可以用例如核磁共振成像或計算機斷層掃描生成的異常清晰和精確的病人腦和脊髓的圖像而確定靶部位。
此外，下面描述的研究可以看出，改變與定向移行所用化合物有關的一種或多種變量(變量包括性質、部位、濃度和使用時間)來影響細胞沿著更精確的途徑定向移行並確定細胞要到達的位置。
E.分化因子儘管一些神經前體細胞在給予足夠長的時間內可以自發地進行分化，但是通過控制什麼時候和在哪裡發生分化將會極大地受益；對此加以控制使得人們可以把神經「再生」(再生可以是部分或全部，只要它足以減輕神經缺損即可)限制在其需要的CNS區域。因此，在神經祖細胞與結合EGF受體的多肽接觸之前、期間或之後，可給予各種刺激。
廣義地說，誘導分化的刺激可包括「普通」分化或「定向」分化。普通分化刺激是刺激細胞以其天然方式進行分化，在通過刺激細胞表達其天然表型即可以減輕神經缺損的情況下使用。例如，本領域已知，一旦暴露於普通分化信號，紋狀體室管膜下區細胞分化成GABA能神經元。這樣，通過使用普通分化因子刺激這些細胞分化將會減輕與亨廷頓氏病(Huntington’s disease)有關的神經缺損；此疾病患者中，GABA能介質棘狀神經元選擇性喪失。
本領域普通技術人員能夠很好地使用刺激普通分化的已知方法來刺激細胞增生和移行。例如，已知將細胞與成視網膜細胞瘤蛋白接觸以使細胞退出細胞周期，退出細胞周期這是分化所必需的(參見最新研究，Slack等，細胞生物學雜誌(J.Cell Biol.)1401497-1509，1998)，和將細胞與細胞周期有關的激酶抑制劑-p21接觸，可以使細胞保持在有絲分裂後期(即，分化的)(Berger等，Soc.Neurosci.Abstr.22505；1996)。在本文方法中可用於刺激分化的另一刺激是細胞周期蛋白D細胞周期調節劑(Ouaghi等，Soc.Neurosci.Abstr.221706，1996)。如果希望刺激少突神經膠質細胞前體分化，則可以使用整聯蛋白(參見例如，Buttery等，Soc.Neurosci.Abstr.221723，1996)。眾所周知腦衍生神經營養因子(BDNF)和視黃酸(RA)刺激細胞分化的能力(參見例如，Ahmed等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)155765-5778，1995)。
如果神經前體細胞在定向移行之前被培養，則它們可被移植入能夠影響它們分化的腦區域。例如，當位置靠近室下區時，與移植到更外側位點(僅有0-8％細胞分化)的神經前體細胞相比，高百分比的移植神經前體細胞分化成神經元(高達35％)(Catapano和Macklis，Soc.Neurosci.Abstr.23345，1997)。類似地，當將小腦前體細胞移植進海馬時，小腦前體細胞表達海馬神經元的標誌物(Vicario-Abejon等，神經科學雜誌(J.Neurosci.156351-6363，1995)。因此，本領域普通技術人員將理解到，作為增生性神經祖細胞的子代與刺激祖細胞分化的化合物接觸的另一種方法，可通過將細胞移植入能夠誘導其分化的腦區域內或者足夠近的區域來完成本發明。
定向分化刺激是刺激細胞分化，但表型與其天然表達的不同的刺激。當可通過刺激細胞表達非天然表型而減輕神經缺損時，可使用定向分化因子。此種情況的一個例子是帕金森氏病，紋狀體細胞分化成產生多巴胺的細胞替代黑質中多巴胺能神經分布的喪失。類似地，人們設法刺激膽鹼能表型在中隔區的表達，此區細胞在阿耳茨海默氏病時選擇性喪失；在脊髓運動神經元的表達，肌萎縮性側索硬化和創傷性脊髓損傷後脊髓運動神經元喪失；以及在少突神經膠質細胞的表達，少突神經膠質細胞在諸如多發性硬化等脫髓殼疾病中喪失。
衍生自神經膠質細胞株的GDNF/營養因子(TGFβ)家族的因子，可誘導神經細胞分化(而且，被RA增強)(Hishiki等，癌症研究(Cancer Res.)582158-2165)，在大鼠中腦培養基中，GDNF刺激運動神經元分化。BDNF和睫狀神經營養因子(CNTF)也促進運動神經元分化(它們的作用對於GDNF的作用似乎是相加或協同作用)(Zurn等，神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)44133-141，1996)。另外，使用在神經管腹側區表達的球聯蛋白(Martinez-Morales等，發育(Development)1245139-5147)和聲刺蝟(sonic hedgehog)編碼的蛋白質(Tanabe等，現代生物學(Curr.Biol.)565l-658，1995)可以誘導運動神經元分化。聲刺蝟家族的成員之一，印度刺蝟，在發育和成熟視網膜中表達並促進視網膜祖細胞增生和光感受體發育(Levine等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)176277-6288，1997)。
皮質神經祖細胞採用受EGF、TGFα和生長所基於的底物類型影響的區域特異性表型。將EGF或TGFα放到生長因子缺乏的MatrigelTM或IV型膠原上，使得衍生自非-邊緣區域祖細胞的邊緣神經元的百分比加倍(Ferri等，發育(Development)1211151-1160，1995)。
已知胰島素影響胎兒神經細胞培養物的分化，甚至超過IGF-1(Abboud等，Soc.Neurosci.Abstr.231425，1997)。鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)和神經營養蛋白可用於海馬細胞的定向分化(Vicario-Abejon等，神經元(Neuron)15105-114，1995)。
在一實施方案中，本發明方法可用於修復退行性疾病喪失的神經通路。例如，基於其分化，分化的紋狀體GABA能神經元可修復紋狀體蒼白球投射。本領域普通技術人員能夠很好地認識到，本發明方法能夠使大量神經通路重建。
F.藥物組合物適宜在本發明使用的多肽(即，那些與EGF受體結合或促進分化的多肽，這裡也稱作「活性化合物」)可摻入到適於給藥的藥物組合物中。這些組合物通常包含一種或多種多肽和「藥學上適用的載體」，藥學上適用的載體是指在包括與給藥的藥物相容的任何和所有的溶劑、分散介質、包衣、抗菌劑、抗真菌劑、等滲劑和吸收延緩劑等等。使用的介質和試劑是本領域所熟知的。除了任何常規介質或試劑的範圍內與活性化合物不相容外，考慮了它們在組合物中的應用。
本領域普通技術人員將藥物組合物按它們打算給藥的途徑(可以包括腸外，如靜脈、皮內或肌內注射；口服給藥；或直接用於受影響區域)進行配製。設想本方法是這樣進行的把多肽用於從腦部採集並放入培養基中的神經元前體中或直接體內用於前體細胞中(例如，通過注射小管或分流器輸注，或者通過裝入一個載體如生物降解膠囊內而植入)。但是其它給藥途徑，特別是胃腸外(優選靜脈內)給藥，也包括在本發明範圍之內。
適用於本發明藥物組合物的溶液或懸浮液(例如，在包含與EGF受體結合的多肽和促進神經元前體分化的化合物的組合物中)可以包括無菌稀釋劑如水、生理鹽水、不揮髮油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗菌或抗真菌劑如苯甲醇、對羥基苯甲酸酯(如對羥基苯甲酸甲酯)、氯丁醇、苯酚、抗壞血酸、硫汞撒等；抗氧劑如抗壞血酸或硫酸氫鈉；交聯劑如EDTA；緩衝液如乙酸、檸檬酸或磷酸；和調節張力的物質如氯化鈉或葡萄糖。pH可用酸或鹼來調節，如鹽酸或氫氧化鈉。
適於注射的藥學組合物包括無菌水溶液(其中活性化合物是水溶性的)或分散劑和為臨時配製無菌注射溶液或分散劑的無菌粉末。對於靜脈內給藥，適宜的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF；Parsippany，NJ)或磷酸緩衝鹽液(PBS)。所有情況下，組合物必須是無菌的，而且應當為容易通過注射器的流體(可以保持適當的流動性，例如，通過使用包衣如卵磷脂，在為分散劑時通過維持一定粒度和通過使用包括表面活性劑)。如上所述的組合物必須在製備和貯存條件下穩定，並且必須進行抗微生物如細菌和真菌汙染的防腐處理。許多情況下，在組合物中優選包括等滲劑，例如，糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化鈉。在組合物中包含延緩吸收物質，如單硬脂酸鋁和明膠，可以實現延緩注射組合物吸收的目的。
將活性化合物(如，結合EGF受體的多肽)按其所需的量摻入到適宜溶劑及如所需的上述列舉的一種或聯合的配合劑中，然後過濾滅菌，可以製得滅菌注射組溶液。通常，通過將活性化合物摻進包含基本分散介質和上述列舉配合劑中所需的其它組分的滅菌載體中而製得分散劑。在為配製滅菌注射溶液的滅菌粉末形式時，優選的製備方法是真空乾燥和冷凍乾燥，它產生活性化合物加上得自前述滅菌過濾溶液的任何其它所需的組分的粉末。
在一實施方案中，活性化合物是與保護它不被機體快速清除的一種或多種載體一起製備，如控釋製劑，包括植入體和微囊釋放系統。可使用生物降解、生物相容性聚合物，例如乙烯基醋酸乙烯酯、聚酐類、聚乙醇酸、膠原、聚原酯和聚乳酸。製備此類製劑的方法對於本領域技術人員是顯而易見的。材料可通過商業渠道獲得，例如，購自Alza Corporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂質體懸浮液也可用作藥學適用載體。這些可按照本領域已知的方法製備，如在美國專利4522811中所描述的方法。
將本發明組合物製成方便給藥的劑量單位形式和均一劑量是尤為有利的。這裡所說的劑量單位形式是指適合接受治療者作為單位劑量使用的物理獨立的單位形式；每一單位包含為產生期望治療效果而計算出的預定量的活性化合物和相關的所需藥學載體。對本發明劑量單位形式的說明由下面因素決定或直接依賴於它們活性化合物的獨特的特性、要達到的特定治療效果和合成該用於治療個體的活性化合物的現有技術中的固有局限性。
作為直接應用結合EGF受體或促進細胞分化的多肽的替代，可將編碼這些多肽的核苷酸分子插入到載體中並用作基因治療載體。基因治療載體可通過例如靜脈注射、局部給藥(美國專利5328470)或通過立體定位注射(參見例如，Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 913054-3057，1994)輸送給個體。基因治療載體的藥學製劑可以包括在可適用稀釋劑中的基因治療載體，或者包括包埋在緩釋基質中的基因治療載體，例如，在腦和脊髓中。另一方面，如果完整基因釋放載體能夠從重組細胞完整無缺地產生的話，例如逆轉錄病毒載體，則藥學製劑可以包括已知或多種產生基因釋放系統的細胞。
藥物組合物可與給藥說明書一起裝入容器、包裝盒或分散器中。
G.治療方案通過實施例(本領域普通技術人員從一個模型(無論是體內還是體外模型)能夠很好地推導到另一模型，朝著對患者最適劑量進行)，對於齧齒動物腦，刺激神經元前體細胞增生的輸注至少持續2周的期間。結果是沿著腦室交界的未分化祖細胞數量明顯增加。下面的工作實施例中，連續輸注TGFα也支持放射狀細胞移行，但在某些動物觀察到，靠其自身尚不足以刺激大量放射狀移行。根據本發明方法，所進行的任何治療的期間可依所期望的結果不同而異。例如，在下面工作實施例中，在細胞團從腦室移行開之前的一周多的期間細胞數量大大增加。另外，靶區的去神經支配(神經化學的或機械的方法)促進遲延移行，並且同時輸注的因子如另一神經營養因子-TGFβ也可藥理學地促進遲延移行，TGFβ增加細胞粘附分子區域性表達，所述細胞粘附分子被認為是放射狀移行(如上所述)的基礎。移行細胞嵴的移行模式和最終定位可以通過改變輸注位置來控制。
本領域普通技術人員能夠很好地決定在本發明中施用的化合物的所需劑量。優選地，無論輸注還是從緩釋載體中釋放，活性化合物或組分(例如，TGFα或上述任何因子)的給藥劑量範圍為1～100ng/kg/天；更優選施用1～50ng/kg/天；最優選1～10ng/kg/天。
實施例實施例1在正常發育和成年黑質紋狀體系統中TGFα和EGF受體mRNAS的表達正如在發明詳述中所述，在黑質紋狀體系統中編碼EGF-家族神經營養因子的mRNA被發育性調節。在下述研究中，檢測TGFα和EGF受體mRNA在正常發育和成年齧齒動物系統中的表達。
A.動物和組織準備成年雄性和雌性Sprague-Dawley孕鼠(250-350g)購自Simonsen(Gilroy，CA)。在這些實驗中和這裡描述的所有其它實驗中，動物保持在室溫和溼度控制的動物園中。依照國立衛生研究院的準則，所有實驗過程中動物的使用均得到加利福尼亞大學Irvine動物研究協會的批准。
新生(P0)、生後1天(P1)和P4動物低溫麻醉並用斷頭術處死。P10，P21和成年動物用斷頭術處死。快速取出它們的腦，在-20℃異戊烷中冷凍並貯存於-70℃。在低溫恆溫器上切下20μm的冠狀面切片，並按由前-到後排的順序融解-粘附到VectabondTM(Vector Labs，Inc.)覆蓋的載玻片上。將切片用0.1M磷酸緩衝液(pH7.4)配製的4％低聚甲醛後固定1小時，磷酸緩衝液洗滌，空氣乾燥。切片與乾燥劑一起在-20℃貯存待用。
B.雜交探針用大鼠TGFα 5』末端550個核苷酸的XbaI/BamHI cDNA片段製備TGFαmRNA探針，並亞克隆進pGEM 7zf(Promega，Inc.)。反義和正義探針分別用SP6和T7聚合酶轉錄。在pGEM 7Zf中，用來自該基因5』末端長度為718鹼基對的插入片段製備大鼠EGF受體mRNA探針。使用亞克隆進pGEM 7Zf的1.2kbBamHI/EcoRI片段製備大鼠TH的探針。用T7聚合酶轉錄EGF受體和TH的反義亞克隆。用SP6聚合酶轉錄EGF受體和TH的正義亞克隆。在存在[35S]UTP時，所有探針轉錄時被標記(NEN Research Products，Inc.)。
C.原位雜交和分析按照Simmons等(組織學技術雜誌(J.Histotech.)121169-181，1989)描述的方法進行原位核苷酸雜交，除開發育腦用0.0001％蛋白酶K溶液和0.05M EDTA處理外。切片在65℃與濃度為107cpm/ml的正義或反義探針雜交過夜。取自同一動物的相鄰切片與每一個探針雜交，以便於直接比較它們的解剖學分布。
取自發育和成年動物的玻片按組放置並放在14C-標記的腦漿標準品的近處以使BetaMax Hyperfilm(Amersham，Inc.)放射自顯影6到7天。在成功地顯影放射自顯影膠片後，將玻片浸入Kodak NTB-2乳液，曝光4周。放射自顯影單張膠片和NTB-2乳液用D-19顯影劑顯影並快速定影(Kodak，Inc.)。然後用硫素復染並加蓋玻片。半定量分析浸泡和染色的切片並在明和暗視野顯微鏡下照相。
自出生後初期發育到成年期選擇時間點跟蹤TGFα和EGF受體mRNA在黑質紋狀體系統的表達。發現TGFα mRNA雜交在出生後初期的紋狀體中非常豐富，然後逐漸降低，到P21時接近成年水平。在胼胝體的表達於出生後發育期增加到與在紋狀體中可比的水平。在發育期或成年黑質中未檢測到明顯豐富的TGFαmRNA。
紋狀體EGF受體mRNA在生後發育初期達高峰，到P21又下降。EGF受體在側腦室周圍的神經上皮中含量最高，但在紋狀體體部也發現有中等水平。在發育期腹側中腦，EGF受體mRNA僅在出生後初期的腦中能夠檢測到，但逐漸增加，到P21天時達中等水平。
在成年動物，TGFαmRNA在紋狀體中度表達，在腹側紋狀體和聽神經核低-到-中度表達。發現EGF受體mRNA在紋狀體體部雜交水平低，而在聽神經核有遍布分散的較高的點狀表達，在緊靠側腦室邊緣的紋狀體區域保持中等水平。
在成年腹側中腦，在黑質(SN)，特別是中部緻密區(medial parscompacta)，及腹側蓋區(VTA)的黑質旁(paranigral)和鰓旁核(parabranchial)發現EGF受體mRNA雜交。
前述研究表明，TGFα和EGF受體mRNA在黑質紋狀體系統個體發育過程中被強烈調節，它們在成年的表達主要代表發育模式的繼續(Lazar和Blum，神經科學雜誌(J.Neurosci.)121688-1697，1992；Weickert和Blum，Devel.Bain Res.86203-216，1995)。發育和成年動物的TGFα和EGF受體mRNA雜交與這些早期報導的發現極為相似。它們在成年紋狀體和中腦的持續性與其在成熟黑質紋狀體系統的支持作用是一致的。
EGF受體mRNA在成年動物沿著前腦室外側室管膜下區的適當表達表明在此區域維持作用或細胞功能(Seroogy等，腦研究(Brain Res).670157-164，1995；Weickert和Blum，1995，見上文)。已表明TGFα(或EGF)支持來自此區域而在體外移植和生長的「EGF-敏感」細胞的存活和分化(Reynolds和Weiss，科學(Science)2551707-1710，1992；Reynolds等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)124565-4574，1992)。在體內發育期，它可能起著類似功能。
實施例26-羥多巴胺損傷和紋狀體TGFα輸注對TGFα和TGF受體mRNA表達的調節。
原位雜交用於測定黑質紋狀體TGFα或EGF受體mRNA是否受到紋狀體內輸注TGFα的影響。此外，也檢測了單側6-OHDA損傷對輸注和未輸注動物受體表達的影響。
A.治療組體重250-300克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠購自Simonsen(Gilroy，CA)，分配到五個治療組中的每一組(1)紋狀體TGFα輸注，黑質6-OHDA損傷(此後稱「損傷」)；(2)TGFα輸注，沒有損傷；(3)人工腦脊液(aCSF)輸注，損傷；(4)aCSF輸注，沒有損傷；(5)無輸注，無損傷。每個實驗組用4至8隻動物。每次手術後監測動物直至完全康復，其它所有時間動物在溫度和溼度得到控制的動物園中餵養。
B.6-羥多巴胺損傷用每公斤體重8mg賽拉嗪和100mg氯胺酮將大鼠麻醉。注射前立即用0.9％鹽水和0.01％抗壞血酸配製4.8mg/ml 6-羥多巴胺鹽酸冷溶液(6-OHDA；Sigma Chemical Co.)。使用滅菌技術，用耳間調零作參照，以1μl/分的速度定向注入左側黑質(+3.7A/P；+2.1M/L；+2.0D/V)8μl(Paxinos和Watson，The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates，Academic Press，San Diego，1986)。通過酪氨酸羥化酶(TH)mRNA在中腦的原位雜交監測6-OHDA損傷的成功和程度。TH是多巴胺合成通路的限速酶，並且是多巴胺產神經元的通用標誌物。一隻具有不完全損傷的動物(保留相當數量的黑質TH-IR細胞)排出在此研究之外，也未包括在總動物數量中。
C.輸注損傷後4～5周植入滲透微型泵(型號2002，Alzet，Inc.)。對於實驗動物，微型泵充有大約200μl人工腦脊液(aCSF)配製的0.05μg/ml TGFα，而對照動物，微型泵僅僅充有aCSF；在植入前於37℃孵育過夜。如上進行麻醉，在無菌條件下，利用前囟(Bregma)作參照，將聯在微型泵上的5mm小管(腦輸注工具箱，Alzet，Inc.)定向植入左側尾-豆狀核(+1.2A/P；+2.7m/l)(Paxinos和Watson，1986，見上文)，並用羧化物粘固粉固定到顱骨上(圖1)。微型泵本身埋在肩胛間區的皮下。輸注液在2周期間以0.5μl/小時的速度直接釋入紋狀體。
D.組織製備在輸注期末，斷頭處死動物。快速取出它們的腦，在-20℃異戊烷中冷凍並貯存在-70℃。按20μm切下冠狀面切片，並按由前-到後排的順序融解-粘附到VectabondTM(Vector Labs，Inc.)覆蓋的載玻片上。用0.1M磷酸緩衝液(pH7.4)配製的4％低聚甲醛後固定1小時，用磷酸緩衝液洗滌，空氣乾燥。切片與乾燥劑一起在-20℃貯存待用。
E.雜交探針用大鼠TGFα5』末端550個核苷酸的XbaI/BamHI cDNA片段製備TGFαmRNA探針，並亞克隆進pGEM 7zf(Promega，Inc.)。反義和正義探針分別用SP6和T7聚合酶轉錄。在pGEM 7Zf中，用該基因5』末端長度為718鹼基對的插入片段製備大鼠EGF受體mRNA探針。使用亞克隆進pGEM 7Zf的1.2kbBamHI/EcoRI片段製備大鼠TH的探針。用T7聚合酶轉錄EGF受體和TH的反義亞克隆。用SP6聚合酶轉錄EGF受體和TH的正義亞克隆。在存在[35S]UTP時，所有探針轉錄時被標記(NEN Research Products，Inc.)。
F.原位雜交和分析按照Simmons等(1989，見上文)描述的方法進行原位核苷酸雜交。除發育腦用0.0001％蛋白酶K溶液和0.05M EDTA處理外。來自實驗和對照動物的平行切片在65℃與濃度為107cpm/ml的正義或反義探針雜交過夜。取自同一動物的相鄰切片與每一個探針雜交，以便於直接對比它們的解剖學分布。
取自實驗和對照動物的玻片按組放置並放在14C-標記的腦漿標準品的近處以BetaMax Hyperfilm(Amersham，Inc.)放射自顯影6到7天，玻片浸入Kodak NTB-2乳液，曝光4周。放射自顯影單張膠片和NTB-2乳液用D-19顯影劑顯影並快速定影(Kodak，Inc.)。然後用硫素復染並加蓋玻片。
G.分析和定量檢測浸泡和染色的切片並在明和暗視野顯微鏡下照相。使用MCID系統(Microcomputer Imaging Device，Imaging Research，Inc.)定量分析放射自顯影。在感興趣區域的每一解剖區域內多位點取樣，讀取密度計讀數並進行平均。然後，從得自14C腦漿標準品的數據而用計算機-生成的三維多項式標準曲線中，可以估算TGFα和EGF受體雜交的相對濃度。接著，將每個治療組的每個區域的估算值平均並計算標準誤。實驗處理的同側腦區與相同切片的相應對側區進行比較，或者與大致相同部位的對照腦的相應區進行比較。使用學生t-檢驗檢測對比的顯著性。
H.正常表達和控制輸注在接受aCSF紋狀體輸注的對照動物中，TH、TGFα和EGF受體mRNA在紋狀體、紋狀體室管膜下區和SN的表達，與正常動物均無顯著差異(見實施例1中正常發育和成年鼠的表達)。在整個SN-VTA，TH mRNA雜交顯著。在SN未測到TGFαmRNA。然而，EGF受體mRNA在中腦黑質緻密部(SNc)、paranigral、臂旁核和VTA的腳間核顯著(圖2)。
TGFαmRNA雜交在尾-豆狀核和聽神經核(NA)表達，在NA的密度稍低。發現在紋狀體的整個體部EGF受體雜交水平低，而NA高的點狀表達分散在整個低水平背景中，在沿著側腦室的紋狀體增生區是中等水平。
I.6-OHDA損傷的效果單側黑質6-OHDA損傷使同側紋狀體TGFαmRNA雜交降低達25％，但不影響對側TGFαmRNA雜交(圖5)。損傷動物與正常動物比較，紋狀體和室管膜下區EGF受體雜交沒有變化(圖6)。在中腦，6-OHDA損傷使同側SN-VTAEGF受體雜交消失。
J.TGFα輸注的作用在接受TGFα輸注的未損傷動物，與對側紋狀體或正常動物紋狀體相比，輸注紋狀體中的TGFαmRNA雜交沒有變化(圖5)。接受TGFα或aCSF輸注的少數動物，在緊緊圍繞輸注插管疤痕處顯示出TGFαmRNA雜交輕度增加。輸注沒有使TGFαmRNA雜交在黑質增加到可測到的水平。
在所有接受TGFα輸注的動物，EGF受體mRNA雜交在同側室管膜下區顯著增加，但在紋狀體其它區域沒有增加(圖6)。單獨輸注TGFα，在SNcEGF受體雜交與正常沒有變化。
K.TGFα輸注與6-OHDA損傷結合接受TGFα輸注與黑質6-OHDA損傷的動物中的黑質TGFαmRNA雜交與僅損傷的動物沒有區別(圖5)。類似地，EGF受體雜交在TGFα輸注/6-OHDA損傷動物的中腦與僅損傷動物沒有區別。
除了室管膜下區雜交增加，前腦EGF受體mRNA雜交在同側紋狀體體部顯示非正常的緻密雜交嵴(圖4，6和7)。在TGFα輸注/損傷聯合組的6隻大鼠中有5隻發現有嵴，但在TGFα輸注/未損傷組6隻大鼠中僅有1隻有嵴。紋狀體周圍EGF受體雜交沒有變化。
L.討論上述結果允許能分析黑質6-OHDA損傷或紋狀體輸注TGFα，或者二者聯合對編碼TGFα和EGF受體的mRNA在成年齧齒動物黑質紋狀體系統表達的調節作用。結果清楚地顯示，表達的變化與每種單獨處理相關，而且當兩種處理結合時有獨特的紋狀體表達模式。
1. 6-OHDA損傷的作用在損傷後數周內，6-OHDA損傷中腦降低黑質TGFαmRNA雜交達25％。如果在該系統中TGFα肽的水平與TGFαmRNA的表達平行，那麼TGFαmRNA的降低可能是齧齒動物損傷模型有別於原發性人PD的一個方面TGFα在PD病人紋狀體中大大增加(Mogi等，Neurosci.Lett.180147-150，1994)。已經證實TGFα在體外增強大量測量多巴胺神經元的功能(Alexi和Hefti，神經科學(Neurosci)55903-918，1993)。因而，TGFα(和EGF及其它營養因子)的增加可能反映了對多巴胺神經元及其紋狀體傳出纖維的繼續變性的反應，和可能與中腦的殘留多巴胺細胞代償紋狀體多巴胺能神經支配的損失有關(Mogi等，1994，見上文)。這樣，部分-或者或許慢性-損傷模型可能能夠更好地代表人PD的這一方面。
多巴胺細胞損失時程的不同也有助於解釋6-OHDA齧齒動物模型和人PD之間的顯然差異。在大鼠模型，單劑量注射神經毒殺死中腦多巴胺神經元相對較快。而在人PD，中腦多巴胺神經元的慢性、進行性變性發生許多年。本研究中，動物在中腦多巴胺細胞變性後即被殺死。在這些動物中可能已經發生在我們的實驗中不明顯的紋狀體TGFαmRNA表達的早期變化。在大鼠模型損傷後的更短期間，多巴胺神經元正在變性過程中時，測定TGFαmRNA表達如何變化將會是令人感興趣的。
TGFαmRNA在尾-豆狀核的中度表達，與它作為中腦多巴胺神經元靶-衍生的生長因子的推測作用是一致的。中腦損傷後它在同側紋狀體降低的原因不明。已證明多巴胺受體結合影響TGFαmRNA在下丘腦的表達(Borgundvaag等，內分泌學(Endocrinol)1303453-3458，1992)，但是在紋狀體已證實沒有這種相互作用。TGFαmRNA在正常成年齧齒動物紋狀體的神經元亞群和神經膠質中表達(Seroogy等，神經化學雜誌(J.Neurochem)601777-1782，1993)。紋狀體多巴胺變性對TGFαmRNA在突觸後神經元、星形膠質細胞或者二者的表達具有潛在的影響。
6-OHDA損傷對於對側紋狀體TGFαmRNA表達沒有明顯改變。這一發現也與多巴胺變性-介導的TGFαmRNA表達下降一致。僅有少量百分比的中紋狀體(mesostriatral)多巴胺投射是對側的(Loughlin和Fallon，Neurosci.Lett.3211-16，1982)，因此可以預見，與損傷同側的作用相比，損傷引起的任何對側調節作用都很小。
DA-去神經的紋狀體中的EGF受體mRNA雜交與對側CP或未損傷對照紋狀體沒有顯著差異。還有，由於中腦損傷或輸注插管的植入，損傷後數周或植入後2周也許已存在不明顯的表達早期變化。損傷的SNc中EGF受體mRNA雜交消失證實了中腦前腦束6-OHDA損傷後所見到的類似結果(Seroogy等，神經報導(Neuroreport)6105-108，1994)。此前把損傷-誘導的減少引證為黑質多巴胺神經元表達EGF受體的證據(Seroogy等，1994，見上文)，但是由於受到周圍黑質多巴胺神經元損傷或死亡的調節從而致使黑質產生EGF受體mRNA的可能性是存在的。有趣的是，對PD病人屍體剖檢發現，其中腦EGF受體結合與正常人無異(Villares等，腦研究(Brain Res.)62872-76，1993)。所以，損傷後EGF受體mRNA表達消失是齧齒動物損傷模型與人PD之間的另一差異。由於TGFα在紋狀體表達，部分-損傷模型的大鼠腦可能能夠更好地模擬在帕金森氏病患者觀察到的變化。
2.TGFα輸注的作用在未損傷動物，輸注TGFα或aCSF對中腦或紋狀體TGFαmRNA雜交的正常水平沒有顯著影響。儘管有在其它組織或細胞類型自動刺激TGFα表達的報導(Coffey等，自然(Nature)328817-820，1987；Barnard等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)26922817-22822，1994)，本研究結果沒有提供在該系統中具有此活性的證據。早些研究中的自動刺激作用是在數個小時的程度上產生。本研究中腦組織是在連續暴露於生長因子兩周之後取出的。這樣，在後來消退的於一開始輸注時的早期上調作用便不明顯。
由於TGFα和EGF受體只在損傷動物轉錄，在實驗處理一開始後的早期時間點檢測調節時程將會是有趣的。TGFα-和aCSF-輸注的紋狀體中，在少數動物中發現緊靠輸注疤痕處的TGFαmRNA輕度增加。因而，可能是輸注插管本身而不是輸注造成了繼續的機械損傷和神經膠質增生。
TGFα輸注顯著增加同側室管膜下區EGF受體雜交，對紋狀體其它區域沒有影響。在其它組織，EGF受體mRNA可受到數種化學或機械方式的調節。在體外，EGF肽增加大量哺乳動物細胞類型的EGF受體mRNA(Earp等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)2614777-4789，1986；Kesavan等，腫瘤基因(Oncogene)5483-488，1990)。在正常齧齒動物成纖維細胞(Thompaon和Rosner，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)2643230-3234，1989)和轉移的大鼠肝臟細胞株中(Raymond等，細胞生長分化(Cell.Growth Diff.)1393-399，1990)，視黃酸引起類似的增加。自身或與EGF一起暴露於環己醯胺刺激培養的人細胞滋養層增加並穩定EGF受體轉錄，由此提供除增加轉錄方式之外的增加EGF受體mRNA總量的機制(Kesavan等，1990，見上文)。
橫切大鼠坐骨神經引起切斷末端EGF受體mRNA逐漸增加(Toma等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)122504-2515，1992)。用魚精蛋白處理在體外增加小鼠和人細胞株中125I-EGF結合和細胞表面受體數量(Lokeshwar等，生物化學雜誌(J.Biol.Chem.)26419318-19326)。TGFα可能模擬這些作用並增加未毀的室管膜下區細胞EGF受體轉錄產生和/或壽命。它也可能刺激並不正常表達相當量的EGF受體mRNA的細胞中的轉錄。用本領域普通技術人員已知的常規技術可以很方便地在體內研究這兩種作用。
另一種可能是，TGFα刺激室管膜下區細胞增生並增加表達EGF受體mRNA的細胞總數量。EGF和TGFα是由室管膜下區分離的培養「EGF敏感」細胞的潛在的促細胞分裂劑(Reynolds和Weiss，1992，科學(Science)2551707-1710)。紋狀體TGFα輸注對室管膜下區EGF受體mRNA雜交的強大的誘導作用可能表明體內未損傷大腦的增生細胞類似地與這些細胞反應。
3.TGFα和6-OHDA損傷聯合紋狀體TGFαmRNA雜交在接受損傷和TGFα聯合的動物與接受損傷和aCSF聯合的動物是不同的。儘管TGFα在其它組織具有潛在的自動刺激作用，但在本研究中它對紋狀體TGFαmRNA雜交的減少沒有明顯改變。6-OHDA介導的中腦EGF受體mRNA的消失同樣不受TGFα輸注的影響。在後面這種情況，進行中腦損傷，在開始輸注前數周將同側多巴胺細胞神經元破壞。這樣，生長因子將沒有機會阻止它們的消除。
有一些證據表明，多巴胺細胞自身表達EGF受體mRNA(Seroogy等，1994，見上文)，以及如果TGFα與神經毒損傷同時施用，則TGFα可以調節紋狀體多巴胺能神經支配標誌物的消失。因而，神經毒損傷和給予TGFα之間的時間間歇可以解釋為什麼TGFα輸注對中腦EGF受體mRNA消失沒有影響。
在人帕金森氏病腦中，中腦EGF受體結合與在正常人腦所見無異(Villares等，1993，見上文)。PD紋狀體TGFα(和其它神經營養因子)大量增加(Mogi等，1994，見上文)可能通過提高殘留神經元表達水平而掩蓋了表達EGF受體的多巴胺細胞數量的減少。另一方面，體外實驗表明TGFα對中腦多巴胺神經元的許多營養作用至少部分是通過黑質介導的(Alexi和Hefti，1993，見上文)。因而，TGFα可能通過旁分泌(直接)和順序轉運(間接)方式影響多巴胺神經元。
TGFα-損傷動物室管膜下區EGF受體mRNA雜交模式與在TGFα-未損傷動物所見相似。這些動物同側紋狀體的最顯著特徵是紋狀體體部向外伸出的緻密雜交嵴，較室管膜下區增強的雜交更緻密。該嵴與任何一種解剖結構均不相對應，而且顯然不是TGFα或TH探針。EGF受體mRNA雜交在非-嵴紋狀體和在所有其它組的紋狀體相似。
6-OHDA損傷的神經毒破壞和輸注插管的機械損傷可能刺激神經膠質細胞增生和活化。前面的研究已經證實神經膠質增生和星形膠質細胞EGF受體表達增加是損傷的結果(Nieto-Sampedro等，Neurosci.Lett.91276-282，1988；Fernaud-Espinoa等，神經膠質(Glia)8277-291，1993)。另外，TGFα可能在星形膠質細胞活動中起著一定作用(Junier等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)144206-4216，1994)。另一種可能是生長因子輸注和中腦損傷聯合使室管膜下區增生細胞離開腦室進入覆在其上面的紋狀體。TGFα是多種細胞類型的潛在的化學吸引劑(Reneker等，發育(Development)1211669-1680，1995)，但在大多數動物，它本身還不充足到能夠刺激嵴的形成。中腦損傷可能促進細胞嵴的形成。下面實施例將測定這些細胞的起源和特性。
實施例3紋狀體嵴的特性如上所述，紋狀體輸注TGFα與黑質6-OHDA聯合誘導大量表達EGF受體mRNA的紋狀體體部細胞嵴的形成，但TGFα並不比周圍組織多。嵴由大量厚密的細胞組成，使得它在使用簡單的硫素染色即很清晰地檢測。異常紋狀體嵴的身份尚不明確，但考慮到有三種可能性。
對損傷產生反應的神經膠質增生是損傷和神經毒損害腦組織的一個特徵。通常，兩種類型腦損傷促進星形膠質細胞增生和星形膠質細胞與小神經膠質細胞對損傷組織的浸潤(Fernaud-Espinoza等，神經膠質(Glia)8277-291，1993)。已證明星形膠質細胞表達EGF受體免疫活性，特別是在對腦損傷反應時(Gomez-Pinilla等，Neurosci.Lett.91276-282，1988)。此外，TGF本身刺激星形膠質細胞增生(Alexi和Hefti，神經科學(Neurosci.)55903-918，1993)。因此，認為紋狀體嵴可能是對神經毒和機械損害和生長因子聯合反應的膠質細胞群。
研究了與齧齒動物紋狀體的特有解剖結構有關的嵴的第二種可能來源。嵴與先前已確定的任何解剖結構不相對應。在齧齒動物，尾狀核和豆狀核解剖學結構不清楚。迄今，沒有鑑定出能把齧齒動物基底神經節的這兩個核區別開來的解剖學或神經化學標誌物。然而，出生前和出生後早期發育期間，發育期紋狀體不同區內神經發生的梯度與在解剖學上核呈不連續狀態的動物體內尾狀核和豆狀核的特性梯度對應((Bayer，Intl.J.Devel.Neurosci.)2163-175，1984)。在齧齒動物，新紋狀體神經元以外側-到-中側梯度加入喙前連合交叉，由此，後產生的神經元是那些最接近側腦室的神經元。在發育尾狀核系統觀察到相同模式，表明齧齒動物前紋狀體有更象「尾狀核樣」的區域。尾狀核到前聯合交叉，神經元以中-到-外側的梯度加入，與在尾狀核豆狀核解剖學不連續的動物中的發育期豆狀核相似。這樣，齧齒動物紋狀體後部可能更象「豆狀核」。認為是這種可能性，即紋狀體嵴可能代表大鼠紋狀體這兩個區域之間不曾被識別的邊界，它允許細胞密集堆積，可能是由於某些神經化學不同的結果。
對紋狀體嵴來源的第三種可能性也進行了檢測。發現從成年哺乳動物前腦側腦室的室管膜下區分離的細胞能夠增生和分化成新的神經元和膠質細胞，特別是當在含有EGF-家族神經營養因子(包括TGFα)進行培養時(Reynolds等，神經元(Neuron)131071-1082，1994)。最近，EGF或TGFα輸注側腦室刺激成年小鼠腦中「EGF-敏感」幹細胞和神經祖細胞增生(Craig等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。在本研究中，紋狀體嵴來源的可能性是TGFα輸注對大鼠腦具有類似的增生刺激活性。另外，考慮紋狀體嵴是從室管膜下區衍生的增生神經祖細胞大量移行的可能性。
下述實驗使用各種組織化學和免疫組化技術來鑑定異常紋狀體嵴的特性。通過檢測嵴在紋狀體形成的時程和通過手術和化學處理聯合幹預，對嵴的起源和其出現的影響因素也進行了研究。
A.實驗方案整個實驗中使用250-300克成年雄性Sprague-Dawley大鼠。24隻動物接受標準的大鼠TGFα中紋狀體輸注(0.5μg/天；Sigma Chemical Co.)。另外26隻動物或者接受人工腦脊液(aCSF)輸注或者不接受輸注。輸注開始後48小時，標準TGFα輸注組和對照組動物接受6-OHDA黑質定向注射。根據輸注-損傷聯合情況將此部分研究所用動物按如下分為6組TGFα輸注，損傷(n＝13)；TGFα輸注，未損傷(n＝11)；aCSF輸注，損傷(n＝12)；aCSF輸注，未損傷(n＝12)；未輸注，損傷(n＝1)；未輸注，未損傷(n＝4)。
其它動物接受TGFα輸注到紋狀體的其它區域、側腦室、大腦皮質或腦幹。另有4隻動物(每組兩隻)在紋狀體中部接受標準劑量的半量或十分之一的TGFα輸注。還有2隻動物在紋狀體中部接受表皮生長因子(EGF)輸注以代替TGFα。對這些大鼠的EGF標準給藥劑量是0.5μg/天。這些外加組的所有動物均被損傷。實驗中所有大鼠在損傷後1到16天進行通常的灌注(輸注3-18天)。為測定輸注停止後嵴是否仍存在，在2周末時取出TGFα輸注的4隻動物的微泵，但這些動物不進行灌注直到數天後。製備腦切片並使用各種免疫細胞化學和組織化學技術進行染色。
B.TGFα輸注用8mg/kg賽拉嗪和100mg/kg氯胺酮麻醉大鼠。使用Alzet滲透微型泵(2002)提供18天的TGFα輸注。微泵中填充約200μl的aCSF用於對照動物，或者填充含20μg TGFα的aCSF 400μl用於實驗動物。在無菌條件下，以前囟為參照，將輸注插管按定向性坐標安置(+1.2A/P；＝2.7M/L；-6.0D/V)(Paxinos和Watson，大鼠腦的定向性坐標(The Rat Brain in StereotaxicCoordinates)，學術出版社，聖地牙哥，1986)，並用牙用粘固粉固定到顱骨頂部。以大約0.5μl/小時的速度通過小管進行輸注。一些其它對照動物接受側腦室輸注或者覆蓋皮質或其它區域。
C.神經毒損傷微型泵植入後48小時，按上述方法將大鼠麻醉。注射前即時配製4.8mg/ml 6-羥多巴胺鹽酸冷溶液。使用無菌技術，用耳間為零作參照，將神經毒素定向注入同側黑質(+3.7A/P；+2.1M/L；+2.0D/V)。以1μl/分的速率注射6-8μl體積。
D.製備組織損傷後1～16天給動物灌注500ml 4％低聚甲醛的0.1M磷酸緩衝鹽液(PBS；pH 7.4)，動物的腦放入20％蔗糖溶液中。第2天，在-20℃異戊烷中冷凍動物腦。然後在冷凍切片機上切出40微米的冠狀面切片，放入2％低聚甲醛0.1M PBS。連續切出貫穿紋狀體和黑質-VTA的切片。通過腦其它部位的切出代表性切片。
E.尼氏染色將用於尼氏染色的切片機切下的腦切片放在明膠包裹的玻片上，過夜乾燥。然後通過乙醇浴進行脫水和再水化作用，在硫素溶液中放置大約4分鐘。通過系列乙醇浴將切片脫水，過量組織洗液洗淨，加蓋玻片。在光學顯微鏡下觀察切片，用Technical Pan Film(Kodak，Inc.)在ISO 100照相(HC-110進行6分鐘)。
F.銀染色使用與Fink-Heimer的方法I相似(Giolli和Karamanlidis，在神經解剖學研究技術(Neuroanatomical Research Techniques)，R.T.Robertson編著，第211-240頁，學術出版社出版，紐約，1978)的改良的Nauta染色方法，對變性纖維和嵴的細胞進行標記。簡要講，在用新鮮1％氫醌-1％草酸處理之前，將游離-漂浮的切片置入0.05％高錳酸鉀中。用濃度不斷增加的連續的硝酸鈾醯/硝酸銀溶液處理。再一次漂淨處理後，切片與氨銀反應，接著在乙醇/檸檬酸/低聚甲醛中還原，最後在硫代硫酸鈉中還原。染色後，切片放到玻璃玻片上，在玻片乾燥機上乾燥15分鐘。接下來用濃度不斷增加的連續的乙醇洗液脫水，在三種連續的組織洗液中脫脂，加蓋玻片。
G.免疫組織化學通過同側腹側中腦TH-IR的消失測定黑質損傷的質量和程度。抗黑質纖絲酸性蛋白(GFAP)(星形膠質細胞的標誌物)抗體、抗nestin(神經祖細胞的標誌物)抗體和抗波形纖維蛋白(放射狀神經膠質細胞的標誌物)抗體，用於嵴的神經化學特性研究。在游離-漂浮的切片上進行免疫組化研究。簡要講，0.1M PBS或Tris緩衝鹽液(TBS；3×10分鐘)洗滌腦切片，然後在由0.1MPBS或含250μl Triton TBS3％正常山羊血清組成的封閉溶液中孵育1小時。接著，室溫下在旋轉器上與封閉溶液稀釋的下列抗體溶液孵育過夜兔抗-TH抗血清(1∶500；Eigeme Tech Intl.，Inc.)、兔抗-GFAP(1∶6400；DakoCorp.)、小鼠單克隆抗波形纖維蛋白抗體(1∶50；Sigma Chemical Co.)或者小鼠抗-nestin上清液(1∶20；University of Iowa Hybridoma Bank)。
然後洗滌切片並用生物素化的山羊抗-兔抗血清(1∶200；Vector Labs，Inc.)孵育1小時以進行TH或GFAP免疫染色，或用生物素化的馬抗-小鼠抗血清(Vector Labs，Inc.)進行nestin或波形纖維蛋白免疫染色，然後洗滌並在抗生物素蛋白-生物素複合物(ABC Elite kit，Vector Labs，Inc.)中孵育1小時。使用二氨基聯苯胺(diaminobenzidine)(DAB)過氧化酶技術顯示初級抗體結合的定位。徹底洗滌切片，將切片放到明膠-包層的玻片上，過夜乾燥。最後，按上面所述的那樣將切片脫水、洗淨和加蓋玻片。
研究中沒有一隻動物對於微型泵植入體或損傷手術表現出不良反應。實驗過程中所有動物繼續進食和水。如果損傷、輸注或者二者不成功，則將這樣的動物(n＝6)從在起始實驗組中排出並分開進行檢測。損傷成功定義為引起同側黑質TH-IR完全或接近-完全消失。紋狀體輸注成功定義為輸注插管的頭部成功地固定在紋狀體的體部內。
對於原位雜交研究，接受6天或更多天紋狀體TGFα輸注的所有動物表現出沿著腦室的輸注同側大量細胞集聚，用硫素染色可見。與此相比，對側紋狀體未顯示這種增加，並且與aCSF-輸注的動物沒有差別。損傷動物EGF輸注誘導沿著腦室的細胞擴展，但不誘導紋狀體嵴的形成。低劑量TGFα誘導細胞擴展和嵴的形成，但是，定性地，兩種情況中細胞的數量均減少。
1.6-OHDA損傷的影響接受aCSF輸注的損傷動物，沒有顯示出沿著同側腦室的任何細胞擴展或任何紋狀體嵴的證據。接受TGFα輸注的損傷動物，的確均勻地顯示出沿著腦室的細胞集聚並通常表現外為紋狀體嵴。與未損傷動物相比，黑質損傷明顯增加嵴形成的發生率(表1)。
2.嵴的形態學和存留狀態中腦輸注引起特徵性S-狀嵴形成，嵴源自背內側尾狀核-豆狀核，反曲(sweeping out)進入紋狀體並在其腹側末端向中線方向輕度回彎。嵴的最背側部分與室管膜下區的集聚細胞相連。通常，嵴的背側部分硫素染色最厚密，與EGF受體mRNA雜交相似。通常發現細胞嵴遍及紋狀體喙-尾側區域的大部分。TGFα輸注泵移走後3個月，紋狀體中嵴仍很明顯。
3.GFAP免疫組織化學抗膠質纖絲酸性蛋白(GFAP)(星形膠質細胞的標誌物)抗血清，沒能使紋狀體嵴的細胞或沿著腦室的擴展細胞著色。發現著色的正常GFAP-IR星形膠質細胞在嵴的內側和外側，但幾乎排除嵴本身。
4.銀染色用改良的Nauta方法非特異標記細胞提供有關腦室細胞擴展和紋狀體嵴細胞的其它信息。一個非常顯著的特徵是，大量細胞構成室管膜下細胞集聚和嵴(圖8)。細胞厚密地集聚並主要呈梭形(圖8)。在嵴的腹側部分，伸長的細胞看來是圍繞內囊纖維束展開的，這表明細胞通過紋狀體移行。
5.嵴形成的時程嵴的細胞密度使得我們能夠使用簡單的硫素染色追蹤它的形成(圖9)。用於時程實驗的所有動物均接受6-OHDA損傷和中紋狀體TGFα輸注。6天輸注前的時間點中，在室管膜下區僅有非常小的細胞集聚和沒有顯示紋狀體嵴。輸注6天時，沿著腦室有清晰的細胞擴展。輸注9天時，嵴的腹側部分開始顯得從腦室位移。輸注12天時，嵴的腹側部分位於距離腦室壁400μm的部位。輸注16天時，嵴出現在紋狀體中部，它的腹側部分距腦室達2mm。這樣，嵴起源於腦室區並且隨著輸注時間增加而逐漸在下面的的紋狀體處放射狀位移。輸注12天和16天時，嵴的外側限與腦室壁之間距離的差距是大約1.6mm。
6.Nestin免疫組織化學抗神經上皮祖細胞標誌物nestin的單克隆抗體，使整個嵴的纖維束緻密地著色(圖10)。嵴的外側未見到nestin-IR纖維，但是在嵴的中部偶爾可觀察到著色纖維。纖維主要地與嵴呈直角定向。
7.嵴形態學變化在損傷動物中腦輸注TGFα，在冠狀切面上均勻地顯示出S-狀紋狀體嵴。在尾狀核-豆狀核其它區域輸注的大鼠中這種形態學明顯改變(圖11)。紋狀體中部輸注導致在尾狀核輸注位點附近產生L-狀嵴，「L」形的垂直部分沿著腦室，水平部分從腦室直角延伸進入紋狀體。紋狀體外側末端輸注刺激與側腦室壁平行的線狀嵴形成。
8.波形纖維蛋白免疫組織化學抗放射狀膠質細胞標誌物波形纖維蛋白的抗血清，不能使紋狀體、室管膜下區或輸注2周的紋狀體嵴的任何細胞染色。然而，該結果將進一步進行研究，因為對照是在胚胎動物中在不能確保排出假陰性的條件下進行的。
9.嵴位置控制與原位雜交實驗所用大鼠的嵴細胞相比，現在的一系列實驗中的嵴細胞自腦室向更遠處最大地發生位移(圖12)。這兩組實驗動物之間的差別是輸注時間表和損傷。
用於原位雜交實驗的動物接受損傷，然後在損傷後第2周左右開始進行一系列的行為測試以確定單側損傷的成功。通常，動物直到損傷後5周才接受輸注。這樣，多巴胺變性過程和紋狀體輸注TGFα是在時間上分開的事件。
現在的一系列實驗中，首先進行輸注；植入輸注泵後48小時進行損傷。在這些動物，黑質多巴胺神經元變性，引起黑質多巴胺能神經分別喪失，而且紋狀體施予生長因子是時間上同時發生的事件。
10.紋狀體之外的其它腦區域輸注接受紋狀體之外的其它腦區域輸注的所有動物，接受2周的TGFα輸注和黑質6-OHDA損傷。損傷同側的腦室內(ICV)輸注生長因子刺激鄰接腦室壁的細胞集聚，但不誘導任何動物紋狀體嵴的形成。
間隔和紋狀體輸注刺激與側腦室中層壁結合的間隔嵴的形成。間隔嵴，與紋狀體嵴一樣，用EGF受體mRNA原位雜交或硫素染色可以很方便地檢測到，但是在密度和細胞數量方面傾向於不那麼粗壯厚密。
背側皮層輸注，即輸注如此之淺以致於不能通透胼胝體，對於沿著側腦室的細胞密度沒有可辨別的影響。這些背側輸注也不誘導嵴的形成。可以輕度通透胼胝體的皮質輸注，刺激沿著側腦室的細胞擴展，但不誘導紋狀體嵴的形成。這些動物確實顯示出胼胝體處細胞密集，考慮後者可能是胼胝體嵴。
H.TGFα刺激細胞增生本實驗與上述實驗一起，證明TGFα對於細胞集聚和紋狀體嵴的形成是必要的。與輸注對側室管膜下區或正常動物相比，接受紋狀體aCSF輸注的動物，無論是否損傷，沒有一隻顯示出任何明顯的室周細胞擴展。很顯然，前腦細胞對TGFα紋狀體輸注敏感，沿著側腦室增生。
給小鼠ICV輸注EGF或TGFα6天的新近研究表明，腦室周圍細胞被細胞增生標誌物-5-溴-2』-脫氧尿苷(BrdU)或[3H]胸腺嘧啶核苷免疫標記上的數量大量增加(Craig等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)162649-2658，1996)。95％以上的這些細胞對EGF受體也呈免疫反應陽性。甲酚紫尼斯耳氏染色也顯示這些動物腦室周圍的細胞對施予生長因子有反應。
沿著側腦室的細胞群擴展的可能性首先考慮是前腦神經毒損害、機械損傷和輸注TGFα聯合刺激膠質細胞所致。已知星形膠質細胞通過增生和改變其形態學與功能特性來對腦損傷反應(綜述參見，Norenberg，J.Neuropath.Exper.Neurol.53213-220，1994)。另外，紋狀體星形膠質細胞具有EGF受體(Gomez-Pinilla等，1988，見上文；Nieto-Sampedro等，1988，見上文)並且受到TGFα刺激而增生(Alexi和Hefti，1993，見上文)。本研究中，星形膠質細胞的標誌物-纖性膠質細胞酸性蛋白(GFAP)的抗血清，不能證實輸注2周時腦室區或嵴處的星形膠質細胞增加。事實上，大部分GFAP-IR從此區域被清除掉。例如，在嵴的中部和外側可以見到正常星形膠質細胞著色，而在嵴本身很少觀察到GFAP-IR纖維。這些發現與ICV輸注EGF或TGFα 6天的實驗結果一致側腦室周圍GFAP和其它星形膠質細胞標誌物-S100β未見顯著增加(Craig等，1996，見上文)。反應的星形膠質細胞也表達波形纖維蛋白(Federoff等，神經科學研究雜誌(J.Neurosci.Res.)1214-27，1984)，但是在任何檢測的切片上未觀察到波形纖維蛋白-IR。也未發現小神經膠質細胞的標誌物(MAC-1)和少突神經膠質細胞的標誌物(MAG，CNP，O4和Rip)有明顯變化(Craig等，1996，見上文)。因此，免疫組織化學證據表明，TGFα誘導的沿腦室的細胞擴展和在紋狀體嵴不是神經膠質細胞增生的結果。
1.細胞形態學和定位銀染色和硫素染色清楚地顯示沿腦室的細胞聚集中有大量細胞。室管膜下區背側部和嵴處的細胞最緻密和最多。細胞主要是梭形的，與發育期腦中移行神經祖細胞相似，它們的長軸與腦室壁成直角(或與背側紋狀體邊界的室管膜下區的背側延伸成直角)。嵴的腦室段細胞銀染色顯得在內囊纖維束周圍展開，提示細胞穿越紋狀體移行。
為了測定細胞是否確實移行，進行時程實驗以檢測作為開始輸注生長因子後時間函數的嵴的發育和它的位置。
2.紋狀體嵴的細胞移行沿著側腦室的細胞進行性擴展和接下來這些細胞作為緻密嵴進行放射狀移行運動，證實細胞確實作為整體穿越紋狀體移行。這樣，嵴不可能是齧齒動物紋狀體的推定的「尾狀核-樣」和「豆狀核-樣」區之間的解剖輪廓。
3.神經前體細胞的刺激儘管腦室旁擴展的細胞或紋狀體嵴細胞沒有標記上成熟星形膠質細胞、神經元、小神經膠質細胞或少突膠質細胞的免疫標誌物，但是單克隆抗體識別的nestin使得嵴和沿著腦室的細胞突起濃密地染色，所述nestin是神經上皮前體細胞表達的內中間絲極(filament)。反應星形膠質細胞也表達nestin-IR，但是在嵴的細胞上GFAP-IR陰性，排除了嵴細胞的最顯著部分是由星形膠質細胞形成的可能性。近幾年來，nestin-IR被用於識別和標記體內和體外的神經前體細胞(Lendahl等，細胞(Cell)60585-595，1990；Craig等，1996，見上文)。紋狀體嵴上強的nestin-IR和缺少膠質細胞標誌物支持嵴細胞主要是神經前體細胞的結論。
至此，在成年哺乳動物腦中已經確定了能夠產生新神經元和膠質細胞的兩類不同的細胞群(Morshead等，1994，見上文)。一類是相對靜止細胞群，真正的多能神經幹細胞。另一類，組成型增生的細胞群，被認為是神經祖細胞，衍生於幹細胞。幹細胞群被認為停留在室管膜或室管膜下區並且在神經前體細胞死亡或移行開之後再重新補足神經前體細胞。這裡使用的術語「神經前體」，是描述在成年哺乳動物腦中能產生神經元和膠質細胞的未分化的增生細胞，無論這些細胞是神經幹細胞還是神經祖細胞。
先前的研究已經顯示許多神經祖細胞在它們從室管膜下區移行之前死亡(Morshead和Van der Kooy，神經科學雜誌(J.Neurosci.)12；249-256，1992)。然而，最近發現許多其它細胞確實存活著並沿著嚴格限定的通路移行到嗅球，在嗅球處細胞分化為嗅球中間神經元(Luskin，神經元(Neuron)11173-189，1993；Lois和Alvarez-Buylla，科學(Science)2641145-1148，1994)。在稱為「鏈移行」的過程中，細胞沿著側腦室壁的切線方向移行，其中移行細胞鏈被特異GFAP-IR星形膠質細胞包鞘(ensheathed)(Rousseleot等，1994；Lois等，科學(Science)271978-981，1996)。
然後，沿前腦側腦室的室管膜下區遠非胚胎期神經上皮殘餘的休眠狀態。在正常未處理腦，繼續產生向喙側(rostrally)移行的新成神經細胞並分化成神經元。在EGF-家族神經營養因子(包括TGFα)的影響下，體外室管膜下神經前體受到刺激產生大量新的神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞(Reynolds和Weiss，科學(Science)2551707-1710，1992)。從這些外植體研究可以更清楚地看出，在沿著尾狀核-豆狀核背側邊界的室管膜下區的背側部分神經前體細胞濃度最高。
甚至一些更近的證據表明，體內神經前體細胞可以在受到刺激後增加它們的數量並且產生新的神經元和神經膠質細胞(Craig等，1996，見上文)。發現ICV輸注EGF 6天後雙重標記上BrdU和成熟神經元與膠質細胞的標誌物的細胞彌散分布在整個紋狀體、中隔和皮質，一直殘存到輸注後7周。然而，在那個研究中沒有發現室管膜下區細胞整體移行進入毗鄰的紋狀體(與本發明方法的結果明顯不同)，並且細胞數量也較本發明在紋狀體嵴處所觀察到的緊密-壓緊的細胞團少許多。另外，在Craig等描述的動物中，沒有一隻接受足夠輸注以刺激本發明觀察到的細胞團移行，以及在該研究中沒有一隻動物接受黑質6-OHDA損傷，本發明第一次證實黑質6-OHDA損傷明顯增加移行的發生率。
4.神經表型的證據遺留下來的一個問題是沿著腦室的擴展細胞和移行到紋狀體嵴的細胞是否確實是神經祖細胞。表2總結的數據支持這些細胞確實是神經祖細胞的結論。神經化學證據顯示這些細胞不表達成熟神經元、星形膠質細胞、少突膠質細胞或小膠質細胞的標誌物，然而的確強烈表達未成熟神經祖細胞的標誌物。它們表達細胞增生的標誌物。它們從神經祖細胞在成年齧齒動物腦所位局的側腦室壁產生，向兩側擴展並輻射狀移行離開腦室。此外，它們的細胞形態呈梭狀及它們的突起與腦室和嵴呈直角定向，與胚胎腦中神經祖細胞的移行相似並且與它們從室管膜下區開始移行一致。下表(表2)中總結的數據表明室旁擴展的細胞和紋狀體嵴是發生自室管膜下神經幹細胞的神經祖細胞。
5.移行機制通過紋狀體多巴胺去神經支配和通過定位輸注插管的物質可以控制細胞團移行進入紋狀體，但是移行機制尚不清楚。嵴的形狀可以通過簡單改變輸注起始位點而被改變的事實提示有化學吸引作用。已知TGFα是不同細胞類型的可能的化學吸引劑(Ju等，J.Invest.Dermatol.100628-632，1993；Panagakos，Biochem.Mol.Biol.Int.33643-650，1994)。它在產期的尾狀核-豆狀核的豐富表達可能表明它在紋狀體發育中起著類似的作用。
正常腦的神經前體細胞位於側腦室壁的較薄區域。輸注進入中-紋狀體更接近該區域背側末端的細胞。推測細胞移行進入紋狀體將朝著推定的生長因子濃度較高的釋放TGFα的輸注插管的尖端方向移動。中-紋狀體輸注的動物中嵴呈S-狀的特性，可能是由於靠近輸注插管尖端的室管膜下區背側段細胞的受體已經飽和的結果。一旦細胞移動靠近輸注位點，EGF受體已經飽和的細胞可能就停止移行。估計靠近室管膜下區腦室末端的細胞遇到較低的生長因子濃度，在TGFα濃度增加到足以使細胞受體飽和以前不得不朝著輸注點移行更遠的距離。伴有受體飽和的不同移行可以解釋嵴的S-狀特性。
輸注進中部紋狀體產生L-狀嵴，也與神經化學梯度/受體飽和作用一致。在這種情況下，背側室管膜下細胞在它們從室管膜下區開始移行前可能已經使其受體飽和因而停止了移行。只是室管膜下區最腹側部分的細胞從腦室移行開。
最外側輸注可能呈現類似的推定濃度梯度，細胞沿著增生區域的距離最長。室管膜下細胞自腦室開始移行相似的距離，產生大致線狀的嵴，與化學吸引、神經化學梯度作用的想法一致。
然而，來自特性研究的免疫組織化學證據使人們不相信簡單的化學吸引作用的概念可以完全解釋細胞團的放射狀移行。移行細胞的nestin-IR突起不與推定生長因子濃度最高區域的輸注插管尖端排成直線，而是與腦室和嵴方向一致。這種定向提示細胞呈直角進入尾狀核-豆狀核--正如移行的神經祖細胞從胚胎紋狀體神經上皮移行時那樣--並不朝著輸注插管尖端傾斜。
另外兩種發現與紋狀體嵴移行的簡單化學吸引作用不一致。首先，細胞不是從其產生後開始移行；細胞沿著腦室在1周以上的期間增加數量，然後作為緻密細胞片整體移行。另外，同側黑質損傷大大增加移行發生率。這兩種觀察結果提示一套更複雜的因子影響細胞移行。這些資料不能徹底排除化學吸引在嵴移行中的作用，但是它們指出簡單的化學吸引本身不能解釋嵴的移行。
可能與成年紋狀體神經祖細胞放射狀移行有關的另一種機制是，由於神經毒損害、輸注插管手術植入造成的機械損傷或者兩者都有，引起放射狀神經膠質支撐框架重建。在發育腦的許多區域，放射狀神經膠質引導神經祖細胞移行。它們沿著腦室定位，而其突起放射狀伸進下覆的薄壁組織。在出生後早期，一旦成神經細胞移行完成，它們便轉化成GFAP-IR星形膠質細胞並停止表達波形纖維蛋白和nestin。
新生大鼠外板(cortical plate)的冷凍損傷，抑制放射狀神經膠質轉化並引起波形纖維蛋白和nestin在成年腦受損傷區域持續表達(Rosen等，發育腦研究(Dev.Brain Res.)82127-135，1994)。成年大鼠海馬的kainate損傷，誘導放射狀神經膠質細胞形態學和在海馬室管膜下區的星形膠質細胞表達nestin-IR和波形纖維蛋白-IR，提示腦損傷可以刺激星形膠質細胞表型回復到胚胎腦中所發現的表型(Clarke等，神經報導(Neuroreport)51885-1888，1994)。
本發明免疫組織化學實驗不支持這一現象。發現輸注第9天時沿著腦室的放射狀-定向的纖維中富含nestin-IR纖維，但在以後的時間點，這些纖維不再沿著腦室停留。由於嵴的細胞移行來自室管膜下區，所以nestin-IR纖維也是如此。另外，用放射狀膠質細胞的特異標誌物-波形纖維蛋白免疫染色，無論是在嵴處還是在室管膜下區均沒有顯示任何標記的纖維。這樣，不大可能是星形膠質細胞回復到其胚胎期放射狀膠質細胞表型或者是星形膠質細胞回復作用在神經祖細胞放射狀移行中發揮了作用。
新近描述的特定地用於成年哺乳動物腦神經祖細胞移行的模型闡明這些細胞從前腦室管膜下區朝著嗅球的切線運動(Lois等，1996，見上文)。喙性移行的成神經細胞是緻密壓緊並被沿著嚴格限定的移行通路的GFAP-IR星形膠質細胞包鞘的。移行細胞主要在特化的膠質導向細胞管內形成實心的移動細胞流。在我們的實驗中神經前體作為薄片穿越紋狀體神經纖維網而移行-不是沿著限定的通路--及與GFAP-IR細胞無關。事實上，增生的室管膜下區和細胞性嵴基本上排除了GFAP-IR。這樣，鏈移行機制不能解釋本發明所見的嵴移行。
神經祖細胞團移行的另一可能的機理是嵴細胞可能已經改變了它們對生長因子、細胞粘附分子或其它對損傷反應的物質的表達。在此情況，紋狀體受到刺激以提供其自己的促進放射狀移行的化學吸引劑或分子。或者，它也已經可被誘導減量調節表達抑制移行的物質。
新近檢測紋狀體和室管膜下區細胞粘附分子的研究提供特別有趣的觀點。高度多唾液酸化的神經細胞粘附分子(PSA-N-CAM)免疫活性在發育期齧齒動物紋狀體中強烈表達，但是隨著動物成熟而下降(Aaron和Chesselet，神經科學(Neurosci.)28701-710，1989；Szele等，神經科學(Neurosci.)60133-144，1994)。然而，PSA-N-CAM沿著成年前腦室管膜下區繼續表達(Rousselot等，1994；Szele等，1994，見上文)。部分皮質剝除術-誘導的紋狀體傳入神經阻滯顯著增加PSA-N-CAM和另一粘附分子-L1在室管膜下區的表達(Poltorak等，神經科學雜誌(J.Neurosci.)132217-2229，1993；Szele和Chesselet，J.Comp.Neurol.368439-454，1996)。人腦中PSA-N-CAM在正常紋狀體的表達低，而在亨廷頓病病人的紋狀體，特別是室管膜下區的表達增加(Nihei和Kowall，Ann.Neurol.3159-63，1992)。
特別有趣的是單側額的部分皮質剝除術後出現紋狀體纖連蛋白mRNA表達變化(Popa-Wagner等，神經報導(Neuroreport)3853-856，1992)。纖連蛋白是在體外已經顯示支持神經元移行的分子之一(Fishman和Hatten，神經科學雜誌(J.Neurosci.)133485-3495，1993)。創傷空穴正下方紋狀體部分的纖連蛋白mRNA雜交在72小時時增加到最高水平。早期增加被認為是短-期傷口癒合過程的成分。接下來是較長-期的纖連蛋白在較大的同側紋狀體的表達增加，大約於損傷後10天達高峰。繼發增加被認為是紋狀體對傳入神經阻滯的反應。跟隨的另外兩個編碼N-CAM和α微管蛋白的mRNAs表達增加僅僅是出現在傷口癒合早期的受空間條件限制的和暫時的現象。
傳入神經阻滯後第10天時紋狀體纖連蛋白mRNA表達高峰很好地對應了本研究中紋狀體去多巴胺神經支配後嵴移行的遲延。纖連蛋白mRNA表達高峰的遲延可以幫助解釋為什麼本發明祖細胞一開始不進行放射狀移行而是直到輸注第9天左右才開始，以及為什麼當它們最終移行時它們以整體移行。在輸注和損傷相隔數周進行的動物中，輸注2周時最大側移行距離明顯減少。該觀察結果也與紋狀體纖連蛋白表達的短暫高峰一致。在沒有接受黑質損傷的少數幾個有嵴的動物中，下覆皮質的機械損傷已經刺激足夠的纖連蛋白在紋狀體表達以促進移行。然後，纖連蛋白對同側紋狀體去多巴胺神經支配反應而可能被上調，反過來，短暫促進來自室管膜下區的神經祖細胞放射狀移行。
影響成年紋狀體中神經祖細胞放射狀移行的另一種可能是細胞粘附分子的繼發作用。N-CAM輸注進接受刺傷的成年大鼠腦的各個不同區域(包括紋狀體)，抑制星形膠質細胞增生(Krushel等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA924323-4327，1995)。星形膠質細胞釋放抑制軸突分枝的因子並由此抑制神經再生反應。因此，紋狀體去神經支配及相關的室管膜下PSA-N-CAM增加可能解除神經再生的抑制。
多巴胺-去神經支配的紋狀體中移行作用的增強也可能直接與多巴胺能神經支配的喪失有關。在紋狀體胚胎發育期，未成熟神經元起源於腦室區域並放射狀移行(Bayer，1984，見上文；Bayer和Altman，Prog.Neurobiol.2957-106，1987)。紋狀體神經元的發育性移行發生在來自中腦的多巴胺傳入纖維的神經支配之前。刺激下丘腦神經元上的D2多巴胺受體，顯著降低TGFαmRNA表達和腦垂體生長(Rorgundvaag等，內分泌(Endocrinology)1303453-3459，1992)。儘管沒有對室管膜下區多巴胺受體-介導的TGFα表達抑制進行研究，但是與非-損傷動物中移行發生率的降低一致。因此，隨著前腦多巴胺能神經支配的逐漸建立，發育期多巴胺神經支配可能抑制紋狀體細胞的移行。
隨著多巴胺能傳入纖維的建立，在出生後早期紋狀體多巴胺也可能參與紋狀體TGFα的下調作用。成年紋狀體的去多巴胺神經支配可能模擬紋狀體細胞的某些只是在發育期紋狀體才可見到的局部化學環境指令，例如，紋狀體神經元上表達的多巴胺受體的有效配體減少。紋狀體多巴胺神經支配也以相互聯繫的方式而與星型膠質細胞細胞外基質分子(ECM)的表達有關(Gates等，神經解剖化學雜誌(J.Chem.Neuroanat.)6179-189，1993)。有趣的是，PD患者的紋狀體中TGFα選擇性增高(Mogi等，Neurosci.Lett.180147-150，1994)，與胚胎期紋狀體的高表達相似。如果紋狀體TGFα受多巴胺神經支配調節，那麼這種增加可能與紋狀體多巴胺的下降以及隨後的TGFα表達抑制的解除有關。
無論什麼發生機制，實驗時程證實在成年大鼠腦中室管膜下區細胞可以被刺激而使細胞數量增加並作為整體放射狀移行進入相鄰的紋狀體。使用不同位置或劑量進行TGFα輸注的實驗顯示，紋狀體嵴的移動和涉及的細胞總數量可以得到控制。特性實驗提供了充分證據表明室管膜下細胞擴展和緻密紋狀體嵴是由神經祖細胞組成的。下面討論這些發現的重要性以及它們用於治療人神經變性疾病和創傷性腦損傷的潛在用途。
至此，結合參照具體實施例和實施方案已經介紹了本發明。在參閱本發明說明書基礎上，本領域普通技術人員可以建議其它的實施方案。
儘管為了清楚理解的目的，藉助於說明書和實施例詳細描述了本發明，但是很顯然可以在所附權利要求的範圍之內進行一定的變化和修改。
權利要求
1.一種治療神經缺損患者的方法，所述方法包括(a)將患者中樞神經系統(CNS)的神經祖細胞同可以與表皮生長因子(EGF)受體結合的多肽進行接觸，其中多肽的劑量要足以刺激神經祖細胞增生，和(b)引導增生祖細胞的子代整體移行到CNS的一個區域，其中子代細胞在所述區域駐留並以足以減輕神經缺損的方式發揮作用。
2.權利要求1所述方法，進一步包括將細胞與刺激增生神經祖細胞的子代進行分化的化合物進行接觸。
3.權利要求1所述方法，其中神經缺損由神經變性疾病、創傷損傷、神經毒損害、局部缺血、發育疾病、影響視覺的疾病、脊髓損傷或疾病、脫髓鞘疾病、自身免疫病、感染或炎症性疾病造成。
4.權利要求3所述方法，其中神經變性疾病是阿耳茨海默氏病、亨廷頓氏病或帕金森氏病。
5.權利要求3所述方法，其中局部缺血與休克有關。
6.權利要求1所述方法，其中與表皮生長因子受體結合的多肽是雙調蛋白(AR)、β-動物纖維素(BTC)、表皮生長因子(EGF)、epiregulin(ER)、肝素結合的EGF樣生長因子(HB-EGF)、神經鞘瘤衍生的生長因子(SDGF)、粘液瘤病毒生長因子、休普氏纖維瘤病毒生長因子、畸胎瘤-衍生的生長因子-1(TDGF-1)、轉移生長因子α(TGFα)或者牛痘生長因子(VGF)。
7.權利要求1所述方法，其中與表皮生長因子受體結合的多肽是轉化生長因子α。
8.權利要求1所述方法，其中神經祖細胞在體內與結合表皮生長因子受體的多肽進行接觸。
9.權利要求1所述方法，其中，神經祖細胞在培養物中與結合表皮生長因子受體的多肽進行接觸。
10.權利要求1所述方法，其中通過將細胞沿著、或者在移行所需通路的末端與增加細胞粘附分子或細胞外基質分子表達的化合物進行接觸，從而使移行定向。
11.權利要求10所述方法，其中化合物是轉化生長因子β。
12.權利要求10所述方法，其中細胞粘附分子是纖連蛋白。
13.權利要求10所述方法，其中細胞粘附分子是核纖層蛋白。
14.權利要求10所述方法，其中化合物沿著神經前體細胞和其子代細胞定向移行所到的位置之間的通路施用。
15.權利要求1所述方法，其中移行是通過將細胞沿著移行所需通路與抑制沿該通路自然產生信號的化合物進行接觸而被定向的，其中所述自然產生的信號是抑制移行的信號。
16.權利要求1所述方法，其中移行是通過機械毀損CNS中的組織而被定向的。
17.權利要求1所述方法，其中移行是通過神經化學阻斷CNS的細胞活性而被定向的。
18.權利要求2所述方法，其中刺激分化的化合物是視黃酸或腦衍生神經營養因子。
19.一種治療神經缺損患者的方法，所述方法包括(a)將患者中樞神經系統(CNS)的神經祖細胞同可以與表皮生長因子(EGF)受體結合的多肽進行接觸，其中多肽的劑量要足以刺激神經祖細胞增生，和(b)引導增生祖細胞的子代整體移行到CNS的第二個區域；(c)將已經移行的細胞與刺激分化的化合物進行接觸。
20.權利要求19所述方法，其中將刺激神經幹細胞增生的化合物和刺激分化的化合物依次給藥。
21.一種藥物組合物，包括結合表皮生長因子(EGF)受體的多肽和刺激神經祖細胞分化的化合物。
22.權利要求21所述組合物，其中結合EGF受體的多肽是轉化生長因子α。
23.權利要求21所述組合物，其中結合EGF受體的多肽是轉化生長因子α，刺激神經祖細胞分化的化合物是腦衍生的神經營養因子。
24.權利要求1所述方法，其中中樞神經系統損傷是脊髓損傷。
25.權利要求1所述方法，其中中樞神經系統損傷是視網膜損傷。
全文摘要
本發明涉及治療神經缺損患者的方法和組合物。該方法可以這樣進行,例如,將患者中樞神經系統(CNS)的神經祖細胞與結合表皮生長因子(EGF)受體的多肽進行接觸(在體內或在培養基中),並使增生祖細胞的子代整體定向移行到CNS的一個區域,其中子代細胞在所述區域駐留並以足以減輕神經缺損的方式發揮作用。該方法可進一步包括使神經祖細胞子代與刺激分化的化合物接觸的步驟。
文檔編號A61P25/28GK1273534SQ98809859
公開日2000年11月15日 申請日期1998年8月4日 優先權日1997年8月4日
發明者詹姆斯·S·裡德, 詹姆斯·H·法倫 申請人:加利福尼亞大學董事會