植物抗性相關基因edos1的克隆及其在植物抗病中的應用的製作方法
2023-09-18 17:56:15 1
專利名稱：植物抗性相關基因edos1的克隆及其在植物抗病中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體涉及到一種擬南芥基因EDOSl的克隆，功能鑑定和應用。包括該基因在調控植物對病原菌的抗性應答和調節乙烯誘導的葉片衰老中的應用，同時涉及該基因在調控mRNA核質運輸中的應用，以及該基因在創建抗病轉基因作物品種中的應用。
背景技術：
在自然界中，植物面對著各種各樣的病原菌的侵襲。這些病原菌大致可以分為兩類，一類是活體營養型，需要存活的植物細胞來完成生長周期；另一類是死體營養型，需要殺死植物細胞來獲取營養，完成生命周期。在漫長的進化過程中，植物演化出有效的抗病反應。其中植物激素水楊酸和乙烯，茉莉酸發揮著重要的作用，水楊酸主要在對活體營養型病菌的抗性中起著重要作用；乙烯和茉莉酸主要在對死體營養型病菌的抗性中發揮著重要作用。白粉菌是自然界中廣泛存在的一種真菌，可以侵染小麥、大麥、葡萄等重要農作物，在世界範圍內造成農業生產的重要損失。在我們先前的研究中，我們報導了擬南芥edrl突變體的表型和EDRl基因的功能(Frye and Innes, 1998 ；Frye et al.，2001)。EDRl 基因編碼一個fcif-like 蛋白激酶，EDRl蛋白具有激酶活性。edrl突變體表現出白粉菌誘導的細胞死亡表型和對白粉病菌的顯著抗性。雙突變分析實驗顯示edrl突變體的表型能夠被pad4，sid2, nprl等突變體抑制，表明edrl的表型需要水楊酸信號途徑的作用。同時，與野生型相比，edrl突變體表現出更明顯的乙烯誘導的葉片衰老表型。但是，目前我們對於EDRl介導細胞死亡和植物抗病反應的分子機制依然知之甚少。可以看出，EDRl是創建抗病性增強的轉基因作物和作物分子設計的優秀候選基因。研究EDRl調節植物抗病反應的分子機制，尋找EDRl信號通路的其他組分，具有重要的理論價值和廣闊的應用前景。
發明內容
本發明涉及到擬南芥EDOSl基因的克隆及應用，尤其涉及到EDOSl基因在mRNA核質轉運中的作用，同時也涉及到該基因在調控植物對病原菌的抗性和葉片衰老中的功能與應用。本發明通過突變體篩選和圖位克隆的方法，對EDOSl基因進行了分離和功能鑑定，確立了 EDOSl基因在植物對白粉病的抗性和病原菌誘導的細胞死亡中的作用，發現了EDOSl基因在乙烯誘導的葉片衰老中的作用及其分子機制，同時，確立了 EDOSl基因影響mRNA核質運輸的機制。本發明為理解植物mRNA核質運輸的分子機制提供了重要依據，為研究mRNA核質運輸如何影響植物的抗病反應和激素的信號轉導提供了新的線索，為探索植物激素水楊酸和乙烯的交叉網絡提供了新的節點。在農業生產上，本發明可以應用於增強植物的抗病反應和調控作物的成熟衰老時期等方面的轉基因作物的創製。為了尋找EDRl信號通路上的其它基因，我們進行了 edrl抑制子和增強子突變體的篩選。我們得到了其中一個突變體edosl，通過圖位克隆，我們得到了 EDOSl基因。通過對EDOSl的功能分析，我們發現EDOSl對植物抗病反應以及植物mRNA的核質運輸有著重要的調控作用。另一方面，作為真核生物，植物的RNA是在核內合成，而RNA翻譯成蛋白質是在細胞質中進行，RNA的核質運輸對植物的生長發育和逆境反應起著重要的調控作用，少數的幾個報導已經說明了影響mRNA核質運輸的突變體可以調節植物對病原菌的抗性。當然，目前對植物mRNA運輸的分子機制以及mRNA運輸調控植物抗病反應的具體機理的研究依然非常有限。通過對EDOSl的研究，可以幫助我們了解EDRl的信號通路。同時，通過對EDOSl的研究，我們可以深入探索mRNA核質運輸對植物抗病反應的影響。更為重要的是，EDOSl本身也是作物轉基因改良和作物分子設計的合適靶基因。綜上所述，對EDOSl基因的克隆和功能分析有著重要的理論和現實意義，而且EDOSl基因有著廣闊的應用前景。1. 一個擬南芥基因EDOSl的基因序列，全長基因組DNA序列4302bp，⑶S全長1800bp。其 CDS 序列見 SEQ ID No. 1。2. EDOSl的蛋白序列，編碼599個胺基酸，大小68. 3kD。其胺基酸序列見SEQ ID
No. 2。3. EDOSl突變之後，可以抑制edrl的抗病表型和白粉菌誘導的細胞死亡表型。4. EDOSl突變之後，可以增強edrl的乙烯誘導的葉片衰老表型。5. EDOSl突變之後，mRNA在細胞核內積累。6. EDOSl基因在高等植物中廣泛存在並且高度保守，可以應用到基因工程技術領域，調控作物的抗病反應和成熟時期。具體內容如下1. 一種擬南芥白粉病抗性相關基因ED0S1，其為下列核苷酸序列之一1) SEQ ID No. 1的核苷酸序列；2)與SEQ ID No. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。2. 一種蛋白質，其由以上1的基因EDOSl編碼。3.以上2的蛋白質，其為1)由SEQ ID No. 2的胺基酸序列所示的蛋白；或2)將(1)的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有與(1)相同的功能的由(1)衍生的蛋白。4.以上1的EDOSl基因的突變基因edosl，其核苷酸序列與SEQ IDNo. 1的核苷酸序列的區別在於在^79bp到^86bp的位置出現了 7bp的缺失。5.以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白質用於調控植物抗白粉病抗性、白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、乙烯熟化或mRNA核質運輸的應用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、葡萄、小麥，優選為擬南芥突變體edrl。
6.以上5的應用，其中抑制植物白粉病抗性、抑制白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、促進乙烯熟化或抑制mRNA核質運輸的應用通過在所述植物中抑制以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白質的表達來實現，其中抑制以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白質的表達可以通過使以上1的基因EDOSl發生缺失功能突變來實現；且增強植物抗白粉病抗性、促進白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、抑制乙烯熟化或促進mRNA核質運輸的應用通過在所述植物中過量或超量表達以上1的基因EDOSl或以上2或3的蛋白質來實現。7.以上4的突變基因edosl用於抑制植物抗白粉病抗性、抑制白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、促進乙烯熟化和抑制mRNA核質運輸的應用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、葡萄、小麥，優選為擬南芥突變體edrl。
圖1.生長5周的野生型Col-0，edrl, edosl/edrl接種白粉病菌8天後的表型(上)，和 Trypan Blue Staining 的結果(下)。圖2.生長5周的野生型，edrl, edosl/edrl在IOOppm乙烯氣體處理3天後的表型(上)，和葉綠素含量測量的結果(下)。圖3.通過圖位克隆的方法克隆EDOSl基因的略圖、edosl突變的位置與基因結構和互補結果。圖4.突變體的表型與Col-O表現的比較。圖5.擬南芥、水稻、玉米、苜蓿等植物中EDOSl蛋白序列的比對分析。圖 6. Col-O，edosl 和 edosl/edrl 中，mRNA 在細胞核內積累。
具體實施例方式實施例一 edosl能夠抑制edrl突變體的抗病表型(1)材料和方法把 edrl 突變體(Frye and Innes, 1998 ；Frye et al.，2001)種子用 0. 3 %EMS (Ethyl methanesulfonate，購自 SIGMA-ALDRICH，貨號 M-0880)浸泡 16 小時，用 ddH20洗12次。把種子播於土壤中，22°C，16小時光照生長7周。按20棵植株作為一個Pool收種子，共獲得240個Pool。每個Pool播種200棵，22°C，9小時光照溫室生長5周，尋找不出現edrl表型的個體，命名為edos系列突變體並將其中一株命名為edosl/edrl。Sf^M Col-O ( ^ g Arabidopsis Biological Resource Center), edrl, edosl/edrl突變體在土壤中，22°C，9小時光照溫室生長5周後，接種白粉病菌(Golovinomycescichoracearum) (Frye and Innes, 1998) 0該白粉病菌用擬南芥的一個對該白粉病菌易感的突變體pad4 (Jirage et al. , 1999)保存。接菌時將生長有大量白粉孢子的pad4的植株輕輕地刮在待接白粉的植物葉片上，接菌後，將接完菌的植物先用保鮮膜覆蓋M小時，後移去保鮮膜，繼續生長7天，進行抗病表型鑑定。對典型的葉片照相，並且對有代表性的葉片進行Trypan Blue Staining，標記白粉菌的菌絲生長和葉片的細胞死亡斑點。(2)結果與分析接種白粉菌8天後，野生型植株上生長出大量的白粉菌(圖1左上)；edrl突變體植株上只有非常微弱的白粉菌生長，並且有可見的細胞壞死的斑點(圖1中上)；edosl/edrl突變體的表型類似於野生型，即有明顯的白粉菌的生長，而沒有明顯的細胞死亡的斑點(圖1右上)。Trypan Blue Staining的結果更清楚地顯示了野生型，edrl，edosl/edrl對白粉菌的反應。野生型植株的葉片上可以看到大量的菌絲(圖1左下)；edrl植株上幾乎沒有可見的菌絲，卻有清晰地深藍色的壞死斑點(圖1中下)；edosl/edrl的表型與野生型類似(圖1右下)。實施例二 edosl可以增強edrl的乙烯誘導的葉片衰老表型1.在乙烯誘導下，edosl/edrl突變體表現出更嚴重地葉片黃化表型(1)材料與方法擬南芥植株Col-0，edrl和edosl/edrl在土壤中，22°C，9小時光照的溫室生長5周後，轉移到一個透明地封閉玻璃容器中，再注入乙烯氣體，濃度為lOOpprn。72小時後，觀察表型。同時，分別稱取0.2克葉片，用純乙醇萃取其中的葉綠素，再測量其中的葉綠素含量。同時，檢測未處理的植株作為對照。(2)結果與分析未用乙烯處理的植株都沒有明顯地黃化表型(圖2a，b，c)。乙烯處理後，野生型Col-O的葉片出現了黃化(圖2d) ；edrl突變體表現出更嚴重地黃化表型(圖加)；edosl/edrl突變體顯示出極其嚴重的黃化衰老表型(圖2f)。從葉綠素含量測定的實驗中也可以看出，沒有處理時，所有植株的葉綠素含量類似；而在乙烯氣體處理後，與野生型Col-O相比，edrl的葉綠素含量明顯降低；而與edrl相比，edosl/edrl的葉綠素含量急劇減少(圖2下圖)。實施例三ED0S1基因的圖位克隆及互補(1)材料及方法為克隆ED0S1基因，我們把edosl/edrl突變體與Lansberg生態型植株(購自Arabidopsis Biological Resource Center)雜交，獲得的 Fl 代自交產生 F2 代。從 F2 代植株中選擇與edosl/edrl突變體表型相似的80個單株，用粗定位標記(http //signal,salk. edu/genome/SSLP_info/SSLPsordered. html)進行基因型鑑定(Konieczny andAusubel，1993)。粗定位的結果表明ED0S1定位在5號染色體的前端。隨後，我們設計了精細定位的標記，對4000棵左右的F2植株進行基因型鑑定，把ED0S1定位到五號染色體前端的BAC，F17I14中的一個301Λ左右的區域(圖3a)。對該區域內所有基因進行測序，通過測序，我們在基因AT5G09860中發現了一段7bp的缺失(圖北)。為了驗證edosl的表型是有這個突變位點造成的，我們從野生型Col_0的基因組DNA中擴增到一個5. 7kb的基因AT5G09860片段，包括800bp的啟動子區、4. 3kb的基因組DNA，200bp 的相鄰序列。擴增弓I物是 LeftPrimer 5' -cagagcaaatcgaattacgtaacca-3『；Right Primer 5' -ggagatcggtggtgtttatgga-3，。退火溫度 56°C，延伸 6min，35 個循環。用 Kpn I 禾Π Hind III 酶切後，連接到 pCAMBIA1300 載體(GenBank 序列號 AF234296，(Heoet al.，1999))上。使用熱激法把質粒轉化到農桿菌GV3101 (Hajdukiewicz et al.，1994 ；Sambrook et al.，1989)中，鑑定正確後轉化edosl/edrl植株，得到TO代的種子。用含120mg/L潮黴素的MS培養基(4.33g MS鹽/L，1 %蔗糖，0. 8%瓊脂，pH = 5. 8)篩選TO代的種子，得到Tl轉基因植株。用乙烯氣體處理，進行表型鑑定，鑑定轉基因植株是否能否互補edosl/edrl的表型。(2)結果及分析通過對該基因的cDNA進行測序後，我們發現缺失位點的剪接發生了變化，突變體的cDNA出現了一段Ilbp的插入(圖3c)。對突變後的cDNA進行編碼蛋白序列的預測，當插入Ilbp的片段後，編碼序列在突變位點出現了兩個連續的終止密碼子，導致了突變體中，突變的EDOSl編碼一個截短的蛋白(圖3d)。EDOSl基因是一個具有多個外顯子的基因(圖:3e)。生長 4 周后，Tl 代互補植株(AT5G09860 in edosl/edrl)的表型與 edosl/edrl不同，而與edrl非常相似(圖3f)，說明基因AT5G09860的轉入可以互補edosl/edrl的表型，以及edosl/edrl的表型正是由於AT5G09860中第十四個外顯子末端的7bp缺失，即在2879bp到^86bp位置的7bp缺失造成的。因此ED0S1基因即為基因AT5G09860。實施例四edosl單突變的表型edosl單突變植株的表型(1)材料和方法為獲得edosl單突變體，我們用edosl/edrl與Col-O雜交，在F2代植株中尋找不帶有edrl背景的植株。檢測edrl背景用的是Derived CleavedAmplifiedPolymorphic Sequences (dCAPS)法(Neff et al.，2002)o 弓| 物為 LP 5，-AGGCTGAAAGGACAGATTCTTCATG-3，；RP :5，-TGTTGAGGAATTGTTCTCCAACTGA-3，。酶切所用的酶是HaeIII (購自大連TAKARA公司)。野生型Col-O和edosl突變體播種於土壤中。22°C，9小時光照生長5周後，注射接種丁香假單孢桿菌(Pseudomonas syringae) (Chisholm et al. ,2006 ；Weigel andGlazebrook, 2002)，濃度為OD6tltl = 5 X 10_4。3小時和72小時後，用打孔器取下葉片，用ddH20洗淨，磨碎葉片樣本，按梯度稀釋，分別塗平板，3天後計數。野生型Col-O，edrl, edosl/edrl和edosl突變體播種於土壤中。22°C，9小時光照生長5周後，放到一個封閉地透明容器中，注入IOOppm乙烯氣體。72小時後，取0. 2g葉片，用純乙醇萃取葉綠素，再測量葉綠素含量。同時，檢測未處理的植株作為對照。(2)結果與分析從圖4的上圖可以看出，注射接種丁香假單孢桿菌3小時後的葉片樣本中，edosl和Col-O的葉片中病菌的生長沒有明顯差異。在72小時後，edosl突變體中，病菌的生長略高於Col-0。從圖4的下圖中可以看出，在乙烯氣體處理72小時後，與Col-O和edrl相比，edosl單突變體和edosl/edrl雙突變體的葉綠素含量都顯著降低。而在未處理地對照中，Col-0, edrl, edosl/edrl, edosl的葉綠素含量非常接近。以上結果說明，與野生型Col-O相比，edosl單突變體對病原菌的抗性有小幅度地降低；同時，edosl單突變體對乙烯誘導的葉片衰老敏感度大幅提高。實施例五ED0S1的胺基酸序列在高等植物中高度保守ED0S1編碼的蛋白序列高度保守。與水稻(Oryza sativa，NP_001048715)，楊樹(Populus trichocarpa, XP_002299188),蓖麻(Ricinuscommunis, XP_002529986),葡萄(Vitis vinifera，XP_002^3874)，玉米(Zeamays, NP_001159168)中的同源基因的胺基酸序列比對，可以發現其序列的相似性達到80%以上。這個結果暗示了 ED0S1有著非常重要的功能，也表明在這些有經濟價值的植物中，EDOSl非常可能也與植物抗病和衰老密切相關，也說明了把EDOSl基因應用到植物基因工程中的巨大可能性。如圖5所示。實施例六在edosl/edrl突變體中，mRNA在細胞核內積累(1)材料與方法擬南芥植株Col-0，edrl和edosl/edrl在MS培養基上生長2周後，選取長度小於5mm 的葉片用 50% 固定液(120Mm NaCl, 7mM Na2HP04, 3mMNaH2P04, 2. 7mM KC1,0. 1% Tween20,80mM EGTA,5% formaldehyde, and 10% DMSO)固定。固定完成後用 50% 乙醇，50%甘露醇交替洗脫3次。把葉片加入到雜交緩衝液(購自Sigma-Aldrich，貨號H-7033)中，加入5』-螢光素標記的oligo dT，雜交過夜。再用超純水洗脫後，用雷射共聚焦顯微鏡觀察。激發光的波長為488nm。(2)結果與分析可以看出，野生型Col-O與edrl的細胞中都只有很微弱的細胞核內螢光信號(圖6a，b)。而在edosl/edrl突變體中，有明顯地細胞核內信號，表明mRNA在細胞核內積累(圖6c)。這個結果也說明ED0S1在mRNA核質運輸中起著重要的調控作用。參考文獻Chisholm, S. , Coaker , G. , Day, B. , and Staskawi cz , B. (2006).Host-microbeinteractions shaping the evolution of the plant immune response.Cell 124,803-814.Fr ye, C. , and Innes, R. (1998). An Arabidopsis mutant withenhancedresistance to powdery mildew. The Plant Cell Online 10,947.Frye, C. , Tang, D. , and Innes, R. (2001) . Negative regulation ofdefenseresponses in plants by a conserved MAPKK kinase.Proceedings oftheNational Academy of Sciences 98,373.Hajdukiewicz, P. , Svab, Ζ. , and Maliga, P. (1994) . The small,versatilepPZPfamily ofAgrobacterium binary vectors for plant transformation.PlantMolecular Biology 25，989-994.Heo, W. ，Lee, S. ，Kim, M. ，Kim, J. ，Chung, W. ，Chun, H. ，Lee, K. ，Park, C. ，Park,H. , and Choi, J. (1999). Involvement of specific calmodulin isoforms insalicylicacid-independent activation of plant disease resistance responses. Proceedingsof the National Academy of Sciences of the United States ofAmerica 96,766.Jirage, D. , Tootle, T. L. , Reuber, T. L. , Frost, L. N. , Feys, B. J. , Parker,J. Ε. , Ausubel, F. Μ. , and Glazebrook, J. (1999). Arabidopsis thaliana PAD4 encodesalipase-like gene that is important for salicylic acid signaling.Proc NatlAcadSci USA 96,13583-13588.Konieczny, A. , and Ausube 1, F. (1993) . A procedure for mappingArabidopsismutations using co-dominant ecotype-specific PCR-based markers. ThePlantJournal 4，403-410·Neff, M. ， Turk, E. ， and Kalishman, M. (2002). Web-based primer designforsingle nucleotide polymorphism analysis. TREND S in Genetics 18,613-615.Sambrook, J.，Fritsch, E.，and Maniatis，Τ. (1989). Molecular cloning :alaboratorymanual 2nd ed. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press.Plainview, NY.
Weigel, D.，and Glazebrook, J. (2002). Arabidopsis :a laboratorymanual (ColdSpring Harbor Laboratory Pr).
權利要求
1.一種擬南芥白粉病抗性相關基因ED0S1，其為下列核苷酸序列之一1)SEQ ID No. 1的核苷酸序列；2)與SEQID No. 1的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列。
2.一種蛋白質，其由權利要求1的基因EDOSl編碼。
3.權利要求2的蛋白質，其為1)由SEQID No. 2的胺基酸序列所示的蛋白；或2)將(1)的胺基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個胺基酸且具有與(1)相同的功能的由(1)衍生的蛋白。
4.權利要求1的EDOSl基因的突變基因edosl，其核苷酸序列與SEQIDNo. 1的核苷酸序列的區別在於在^79bp到^86bp的位置出現了 7bp的缺失。
5.權利要求1的基因EDOSl或權利要求2或3的蛋白質用於調控植物抗白粉病抗性、白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、乙烯熟化或mRNA核質運輸的應用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、葡萄、小麥，優選為擬南芥突變體edrl。
6.權利要求5的應用，其中抑制植物抗白粉病抗性、抑制白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、促進乙烯熟化或抑制mRNA核質運輸的應用通過在所述植物中抑制權利要求1的基因EDOSl或權利要求2或3的蛋白質的表達來實現，其中抑制權利要求1的基因EDOSl或權利要求2或3的蛋白質的表達可以通過使權利要求1的基因EDOSl發生缺失功能突變來實現；且增強植物抗白粉病抗性、促進白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、抑制乙烯熟化或促進mRNA核質運輸的應用通過在所述植物中過量或超量表達權利要求1的基因EDOSl或權利要求2或3的蛋白質來實現。
7.權利要求4的突變基因edosl用於抑制植物白粉病抗性、抑制白粉菌誘導產生的細胞程序性死亡、促進乙烯熟化和抑制mRNA核質運輸的應用，其中所述植物包括擬南芥、大麥、葡萄、小麥，優選為擬南芥突變體edrl。
全文摘要
本發明涉及一種擬南芥白粉病抗性相關基因EDOS1的分離克隆、功能驗證及應用。本發明還涉及所述EDOS1基因的突變基因、所述EDOS1基因編碼的蛋白及其應用。
文檔編號C07K14/415GK102586267SQ20111000726
公開日2012年7月18日 申請日期2011年1月13日 優先權日2011年1月13日
發明者唐定中, 潘懷榮 申請人:中國科學院遺傳與發育生物學研究所