表皮幹細胞在檢測化妝品及其原料細胞毒性中的應用的製作方法

2023-09-19 03:42:20

表皮幹細胞在檢測化妝品及其原料細胞毒性中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了表皮幹細胞在檢測化妝品及其原料細胞毒性中的應用。本發明用待檢測化妝品及原料處理人皮膚來源的表皮幹細胞，通過MTT比色法得出了處理後表皮幹細胞的存活率情況，結果表明：當待測化妝品或其原料的濃度為0.1ug/mL時，利用表皮幹細胞可以檢測待測化妝品或其原料的細胞毒性，靈敏度較高。因此，人皮膚來源的表皮幹細胞可作為MTT比色法檢測化妝品及原料安全性的新途徑。
【專利說明】表皮幹細胞在檢測化妝品及其原料細胞毒性中的應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物【技術領域】，具體涉及表皮幹細胞在檢測化妝品及其原料細胞毒性 中的應用。

【背景技術】
[0002] 自1983年Mosmann建立MTT比色法以來，由於其簡單、經濟、快速、無放射性汙染 等特點，已成為細胞生物學及相關研宄領域一種分析細胞活性、生長增殖的常用方法。傳 統通過MTT比色法檢測細胞活力方法以小鼠黑色素瘤B16細胞、永生化的人皮膚角質形成 細胞HaCaT、人黑色素瘤A375細胞、人早幼粒急性白血病細胞系（HL60)、PC23、BGC2823、 Bcap237細胞係為細胞材料，但通過以上細胞系建立的MTT方法在評價化妝品及其原料的 安全性方面還存在很大局限性。細胞的敏感性、細胞來源、細胞與藥物接觸方式及與人體皮 膚的一致性都會關係到化妝品及其原料檢測結果的真實與可靠性。
[0003] 皮膚表皮基底部具有不斷增殖和分化能力的幹細胞稱為表皮幹細胞（Epidermal stem cell, ESC)，或角質形成細胞幹細胞（Keratinocyte stem cell, KSC)。表皮幹細胞為 皮膚組織中的專能幹細胞，最顯著的兩個特徵是具有慢周期性和自我更新能力。慢周期性 體現在進行體內細胞周期標記試驗時表現為標記物保留細胞，增殖潛能則體現為體外培養 時呈克隆性生長。表皮幹細胞的自我更新能力表現為不僅能在體外長期傳代培養，並保持 其增殖分化潛能，而且在一定環境條件下還表現出與胚胎幹細胞相似的分化潛能。


【發明內容】

[0004] 本發明的一個目的是提供表皮幹細胞在檢測待測樣品細胞毒性中的應用；
[0005] 或，表皮幹細胞在製備檢測待測樣品細胞毒性的產品中的應用。
[0006] 本發明另一個目的是提供一種檢測待測樣品細胞毒性的方法。
[0007] 本發明提供的檢測待測樣品細胞毒性的方法包括如下步驟：將待測樣品與表皮幹 細胞混合培養，用MTT法檢測表皮幹細胞存活率，按照如下判別方法判斷所述待測樣品細 胞毒性：
[0008] (1)若細胞存活率為< 100%，則判定待測樣品對細胞有毒；
[0009] (2)若細胞存活率為多100%，則判定待測樣品對細胞無毒。
[0010] 上述方法中，所述混合中，所述待測樣品在混合體系中的濃度至少為0. lug/mL。
[0011] 上述方法中，在所述混合後，培養48h。
[0012] 上述方法及應用中，所述待測樣品為化妝品和/或化妝品原料；所述待測樣品具 體為紅景天提取物、餘甘子提取物、積雪草提取物、苦參提取物、乙醇、丙酮、DMSO、SDS或苯 酚。
[0013] 本發明提供了一種表皮幹細胞在檢測化妝品及其原料細胞毒性中的應用。本發明 用待檢測化妝品及原料處理人皮膚來源的表皮幹細胞，通過MTT比色法得出了處理後表皮 幹細胞的存活率情況，結果表明：當待測化妝品或其原料的濃度為〇. lug/ml時，依然能檢 測出細胞毒性，靈敏度較高。因此，人皮膚來源的表皮幹細胞可作為MTT比色法檢測化妝品 及原料安全性的新途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為陽性對照物細胞毒性結果圖。
[0015] 圖2為植物提取物細胞毒性結果圖。

【具體實施方式】
[0016] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0017] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0018] 本發明提供的細胞為黃種人皮膚的表皮幹細胞；
[0019] 表皮幹細胞的獲得方法：人皮膚組織經碘酊、75%酒精、PBS清洗後剪下脂肪組 織；將皮膚組織剪切成小塊，用Dispase II在4°C下消化22h，用鑷子將表皮和真皮組織分 開，取表皮；用Trypsin-EDTA在37°C水浴中消化lOmin ;吸取上清液，並在上清液中加入 2mL FBS終止消化，在4°C條件下，360g，離心8min，棄上清；用培養基將沉澱的細胞懸起，調 節密度為2X105個/皿，37°C，5% C02，飽和溼度下培養在含有KGM medium培養液的6孔 板中；待80%的細胞融合貼壁後，用胰蛋白酶Trypsin-EDTA將細胞消化；Integrin |3 1和 CD49f雙標記後用流式細胞儀分選，得到雙陽性的細胞為表皮幹細胞。
[0020] KGMmedium培養基的配製方法：100mL的KGMmedium培養基溶劑為體積分數為 90%的01^]?高糖培養基（6讓(3〇，11965)和10%的？85胎牛血清（辦(31〇116,51130084.03)，溶 質在培養基中的濃度：20mMHEPES緩衝液（Gibco, 15630106)、10〇n/mL的青黴素-鏈黴素 雙抗（Gibco, 15140163)、0? 18nM的腺嘌呤（Sigma，A9795 5g)、2mM的L-穀氨醯胺（Gibco， 25030-081)、2nM的三碘甲腺原氨酸（SigmaT2725lg)和InM的霍亂毒素（Sigmac9903 lmg) 〇
[0021] KGM+medium培養基的配製方法（現用現配）：lmL的KGM培養基中添加 Hydrocortisone(SigmaH4001) :0? 4yg、細胞生長因子EGF(SigmaE9644) :50ng、膜島 素Insulin(Sigma12643) :5yg、轉鐵蛋白Transfer;rin(Me;rckCB616420) :5yg、亞砸 酸鹽Selenite(SigmaS5262) :5yg、牛腦垂體提取物Bovinepituitaryextract(Sigma P1167) ：1yg〇
[0022] 實施例1、利用表皮幹細胞檢測化妝品及其原料細胞毒性的方法
[0023] 1、細胞傳代
[0024] (1)準備：將表皮幹細胞反覆混懸，並收集到50ml離心管；
[0025] ⑵洗滌：用PBS洗3?5次；
[0026] (3)酶處理：用11111的0.25%胰酶4014溶液對表皮幹細胞進行處理，371：，51^11 ;
[0027] (4)酶失活：待表皮幹細胞細胞飄起大於80 %時，用5mL的KGM medium培養液終 止消化，並移至50mL離心管中；
[0028](5)離心：lOOOrpm，4°C，離心 8min，小心棄上清；
[0029] (6)培養：用KGM+medium培養液旋起細胞，按照1:3傳代，將細胞平均分成三份， 裝入培養瓶/盤，加足KGM+medium培養液輕柔搖動，使細胞在培養瓶/盤分布均勻；將處 理好的細胞放入〇)2孵箱中，37°C，5% CO 2，飽和溼度下繼續培養。
[0030] 2、MTT法檢測對人皮膚表皮幹細胞增殖影響的基本過程
[0031] (1)收集對數期的表皮幹細胞，調整細胞好濃度後加入96孔培養板，每孔加 100 U 1，使表皮幹細胞的密度為5000個/孔，邊緣孔用無菌PBS填充，5 % C02, 37 °C孵育 12-16h ；
[0032] (2)棄去舊培養液，加入不同濃度梯度（300 yg/mL、1000 yg/mL、3000 yg/mL、 10000 yg/mL)的乙醇、丙酮、K0H、DMS0、SDS和苯酚用於檢測；加入不同濃度梯度（0. lyg/ mL、l y g/mL、10 y g/mL、100 y g/mL)的紅景天提取物、餘甘子提取物、積雪草提取物和苦參 提取物用於檢測（均購買於北京茂霖泰科貿有限公司），添加樣品前都通過PBS進行溶解稀 釋，過0. 45 y m的濾膜後再加入培養體系中，5% C02, 37°C孵育48h ;
[0033] (3)每孔加入20 y 1 MTT溶液（5mg/ml，即0? 5% MTT)，培養4h，使待測樣品與MTT 充分反應；
[0034] (4)終止反應，小心吸去孔內培養液；
[0035] (5)每孔加入150 y 1二甲基亞碸，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。 在酶聯免疫檢測儀0D值490nm處測量各孔的吸光值，每組取平均值計算細胞存活率（％ ) =0D實驗組/0D對照組X 100% ;
[0036] (6)同時設置調零孔（含有培養基、MTT、二甲基亞碸）和對照孔（含有表皮幹細 胞、相同濃度的藥物溶解介質、培養基、MTT、二甲基亞碸），每組設定2個復孔。
[0037] 4、待測物對細胞毒性的評價
[0038] 細胞存活率指反應後細胞量與反應前總細胞量的比例，當細胞存活率多100%，待 測物無細胞毒性；細胞存活率< 1〇〇%，待測物有細胞毒性。根據檢測結果表明：當乙醇、丙 酮、KOH、DMSO、SDS和苯酚濃度在300 y g/mL及以上，當紅景天提取物、餘甘子提取物、積雪 草提取物、苦參提取物的濃度在〇. lug/mL及以上時，細胞存活率均小於100%，所以利用 表皮幹細胞可有效的檢測出待測物質的細胞毒性（如圖1和圖2所示）。
[0039] 研宄表明：在利用U937細胞對細胞毒性進行檢測時，丙酮在濃度為10%時細胞毒 性仍然不明顯；乙醇濃度在大於3%時才有細胞毒性；DMS0濃度大於3%時才有明顯的細胞 毒性（王振斌，馬海樂，許文榮等，有機溶劑對腫瘤細胞的細胞毒作用，江蘇大學學報： 醫學版，2005 (3) : 201-204)，而本發明利用表皮幹細胞對細胞毒性進行檢測發現：丙酮、乙 醇和DMS0的濃度為0. 3% (300 y g/mL)時，仍能檢測出細胞毒性，如表1所示。結果說明： 相比於其他細胞，表皮幹細胞對化妝品及其原料有更好的敏感性，靈敏度高，可作為MTT比 色法檢測化妝品及原料安全性的新途徑。
[0040] 表1、待測物對不同細胞的敏感性比較
[0041]

【權利要求】
1. 表皮幹細胞在檢測待測樣品細胞毒性中的應用； 或，表皮幹細胞在製備檢測待測樣品細胞毒性的產品中的應用。
2. -種檢測待測樣品細胞毒性的方法，包括如下步驟：將待測樣品與表皮幹細胞混合 培養，用MTT法檢測表皮幹細胞存活率，按照如下判別方法判斷所述待測樣品細胞毒性： (1) 若細胞存活率為< 100%，則判定待測樣品對細胞有毒； (2) 若細胞存活率為多100%，則判定待測樣品對細胞無毒。
3. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於：所述混合中，所述待測樣品在混合體系中 的濃度至少為〇. lug/mL。
4. 根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於：在所述混合後，培養48h。
5. 根據權利要求1所述的應用或權利要求2-5任一所述的方法，其特徵在於：所述待 測樣品為化妝品和/或化妝品原料；所述待測樣品具體為紅景天提取物、餘甘子提取物、積 雪草提取物、苦參提取物、乙醇、丙酮、DMSO、SDS或苯酚。
【文檔編號】C12Q1/02GK104450856SQ201410730353
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月4日 優先權日:2014年12月4日
【發明者】鄭洪豔, 蘇寧, 李新實, 楊麗, 劉娟, 趙丹, 徐歌, 王昌濤 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院, 北京工商大學