兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶的製作方法
2023-09-18 17:53:55 1
專利名稱：兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶的製作方法
技術領域：
:本發明涉及兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶，屬於生物技術領域。
背景技術：
:木聚糖是植物半纖維素的重要組成之一，大約佔植物總糖的1/3，是自然界中僅次於纖維素的第二大最豐富的可再生物質資源。廣義的木聚糖酶是指能夠降解半纖維素木聚糖一組酶的總稱，包括內切β_1，4-木聚糖酶、外切β-1，4_木聚糖酶、木聚糖酶，還包括a-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、乙醯木聚糖脂酶、苯酚酸脂酶，其中以β-1,4-木聚糖酶和木聚糖酶最為重要。β-1,4-木聚糖酶是降解半纖維素最主要的酶，該酶以內切方式作用於木聚糖主鏈內部的β_ 1，4-木糖苷鍵，使木聚糖降解為短鏈的低聚木糖，並有少量木糖生成；β_木聚糖酶則作用於短鏈的低聚木糖，通過催化低聚木糖的末端來釋放木糖殘基，二者共同作用能將木聚糖降解成單糖。木聚糖酶能夠從微生物、植物和動物中獲得，其中微生物是木聚糖酶的主要來源。目前，已報導的分泌木聚糖酶的微生物有絲狀真菌、芽孢桿菌屬、麴黴屬、木黴屬、鏈黴菌屬、放線菌和其他一些微生物，如放線菌主要有Streptomyces lividans、Thermobifidafusca 等；細菌主要有 Bacillus subtilis、Pseudomonas fluorescents 等；真菌主要有Aspergillus niger、Aspergillus nidulans、Cryptococcus sp.S_2、Trichoderma reese1、Penicillium sp.40。目前國內外對木聚糖酶的研究已比較深入,包括菌種的篩選、產酶的誘導、酶的分離純化及易源表達、酶學性質研究等。由於極端微生物在某些苛刻條件下(如高溫、偏酸、偏鹼、高鹽等)生長穩定性好，並且在工業生產中與來自普通環境微生物相比不易被汙染。因此近些年來，來自極端環境如嗜熱、嗜酸、嗜鹼等特殊生境微生物引起越來越多的關注，而且研究的也已經較多。但是對嗜鹽這一特殊生境的微生物的研究相對還比較少，目前已經報導的僅有Halorhabdusutahensis (Wain0 and Ingvorsen 2003)、halophilic strain CL8 (ffejse et al.2003)、Nesterenkonia sp.(Govender et al 2009)、 Glaciecola mesophila KMM 241 (Guo etal 2009) Bacillus sp.NTU-06 (Wang et al.2010) > Chromohalobacter sp.TPSV 101(Prakasha et al.2012) >Bacillus halodurans PPKS-2 (Prakash et al.2012)。對嗜鹽微生物的研究，不僅在學術上能夠解釋酶耐受鹽的機制原理也為在分子水平上克隆新酶提供了理論和材料，而且由於嗜鹽微生物產生的木聚糖酶具有耐受高鹽、不易汙染、能耐受較廣的PH(6.0-10.0)範圍，並且在溫度高於60°C仍保持較高的酶活力，因此在含鹽量高的工業生產及汙水處理方面有著廣泛的潛在應用價值。不同來源微生物的木聚糖酶在分子量、等電點、pH耐受、溫度耐受等方面差異各不相同。一般而言，分子量在8KDa 145KDa、等電點為3 10之間均有分布。細菌和真菌來源的木聚糖酶，其最適作用溫度一般在40°C 60°C，多數細菌和放線菌所產木聚糖酶的最適反應溫度在50°C 60°C。不同微生物來源的木聚糖酶有比較廣泛的pH值範圍，pH值為
.3.0 10.0時基本都是穩定的，其最適作用pH值為4.0 7.0。一般來說，真菌來源的木聚糖酶屬於酸性木聚糖酶，最適pH值為4.0 6.0，細菌和放線菌木聚糖酶屬中性或鹼性木聚糖酶，其最適pH值為6.0 8.0。工業上，木聚糖酶作為生物試劑在食品飲料、飼料、造紙、醫藥、能源、生物轉化等工業中具有重要作用。如專利號為CN102732496A公開了一種木聚糖酶，在麵包烘烤中有很明顯的應用效果；CN102640858A公開了一種含有木聚糖酶的多功效複合酶製劑，能提高飼料的消化率和轉化率，減低黴素和毒素的有害作用，提高動物抗病能力。木聚糖酶已經廣泛的應用於造紙業，其重要性主要在於能部分取代有毒的化學物質(例如氯及含氯化合物)的使用，減輕對環境的汙染，也能夠縮短紙漿的處理時間，改善漂白效果。但由於目前大多數微生物產生的木聚糖酶存在著穩定性差、產量低、工業應用成本高等缺陷，限制了它的工業化應用，因而，對木聚糖酶的開發與研究就顯得十分必要了
發明內容
:本發明的目的在於提供兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶。本發明米用的鏈單抱菌屬 Μ 90494CStreptomonospora sp.YIM 90494),於 2012年12月28日保存於中國典型培養物保藏中心，保藏單位地址:中國武漢武漢大學，郵編430072，保藏號:CCTCC N0.M 2012556。本發明的兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶用保藏號為:CCTCC N0.M 2012556的鏈單孢菌屬 Μ 90494 (Streptomonospora sp.YIM 90494)經大量發酵、70% 硫酸銨沉澱、Hiprep26/60層析柱> Hiprep QXL 26/60層析柱、Hipr印FF 26/60層析柱四步純化步驟得到，其分子量分別為18KDa、50KDa ;酶活反應最適溫度均為55°C，最適反應pH值均為7.5，在PH4.0-11.0範圍內酶活穩定，且Ag+和SDS對兩種酶具有激活作用。本發明的兩種耐Ag+和SDS的木聚糖酶經如下分離純化方法得到:
1.粗酶液的製備:將Streptomonospora sp.YIM 90494接入液體 Μ 38#培養基中，在37°C的條件下振蕩培養4-5天作為種子液，以10%菌液轉接於液體發酵培養基中，在37°C培養15天，將發酵液離心，取上清，濾紙過濾，得粗酶液；2.在粗酶液中加硫酸銨至70%飽和度，4°C放置過夜；1200rpm/min離心30min取沉澱，溶解在pH8.0、50mM Tris-HCl緩衝液中；3.將酶液1200rpm/min離心IOmin,收集上清，上樣於已平衡好的Hiprep 26/60層析柱、強陰離子柱Hiprep QXL 26/60層析柱、弱陰離子柱Hiprep FF 26/60層析柱,收集有木聚糖活性的透過峰部分；4.將兩種有活性的酶液於pH8.0、50mM Tris-HCl緩衝液中透析過夜並離心取上清，分別上樣於用pH8.0、50mM Tris-HCl緩衝液平衡好的Hipr印QXL 26/60層析柱，用pH8.0,0.5M硫酸銨的50mM Tris-HCl緩衝液洗脫，收集木聚糖有活性的透過部分；5.將兩種有活性的酶液於pH9.0、50mM Tris-HCl緩衝液中透析過夜並離心取上清，分別上樣於用pH9.0、50mM Tris-HCl緩衝液平衡好的Hipr印FF 26/60層析柱，用pH9.0,0.5M硫酸銨的50mM Tris-HCl緩衝液洗脫，收集木聚糖有活性的透過部分，即為純酶液；在步驟I)中的所說的發酵培養基的組成:NaCl100g
Yeast extract4g
Malt extract 5g
Avicel 1g加水定容至1L，調節pH至7.2 ; 121°C滅菌30 min。本發明的兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶聚糖酶酶學性質如下:(一)、18KDa木聚糖酶酶學性質:1.鏈單孢放線菌 Μ 90494產木聚糖酶最適酶活溫度為55°C。2.鏈單孢放線菌YM 90494產木聚糖酶在60°C保溫I小時，還能保持70%以上的酶活力；當溫度超過70°C時，酶活力下降很快，在70°C保溫40min酶活力下降近80%，在80°C保溫60min，酶基本失活。3.鏈單孢放線菌屬YM 90494產木聚糖酶最適反應pH為7.5，在ρΗ4.0-10.0範圍酶活力仍保持在60%以上，說明了該酶具有較廣的pH適應性。4.Ag+、Ca2+、Na+、Al3+、Ba2+對鏈單孢放線菌YM 90494所產木聚糖酶有激活作用，Li+、K+、Mg2+、Ni2+、Zn2+、Fe3+和對酶作用不明顯，Cd3+、Co2+、Pb2+、Cu2+對酶有顯著的抑制作用。5.變性劑SDS對鏈單孢放線菌YM 90494所產木聚糖酶有明顯的促進作用，鰲合劑EDTA和絲氨酸蛋白酶專一抑制劑苯甲基磺醯氟化物(PMSF)對鏈單孢放線菌YM 90494所產木聚糖酶有明顯的抑制作用，表明了木聚糖酶對金屬離子有依賴性且其活性中心含有絲氨酸。DTT經常作為添加的保護劑使用，防止二硫鍵的形成，DTT對鏈單孢放線菌 Μ90494所產木聚糖酶有明顯的抑制作用。(二)、50KDa木聚糖酶酶學性質:1.鏈單孢放線菌 Μ 90494產木聚糖酶最適酶活溫度為55°C。2.鏈單孢放線菌YM 90494產木聚糖酶在60°C保溫2個小時，還能保持43%以上的酶活力；當溫度超過70°C時，酶活力下降很快，在70°C保溫40min酶活力僅剩近32%，在80°C保溫60min，酶活力下降了 95%。3.鏈單孢放線菌YM 90494產木聚糖酶最適反應pH為7.5，在pH小於4或大於11時酶活力較低，在ρΗ4.0-11.0範圍酶活力仍保持在57%以上。 4.Ag+、Ca2+、Li+、Mg2+、Ni2+、K+、Na+、Ba2+ 對鏈單孢放線菌 YM 90494 所產木聚糖酶有激活作用，Mn2+、Cd3+、Co2+、Pb2+對酶有一定的抑制作用，Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+對酶有明顯的抑制作用。6.變性劑SDS對鏈單孢放線菌YIM 90494產木聚糖酶有微弱的促進作用，DTT對酶有明顯的抑制作用，鰲合劑EDTA和絲氨酸蛋白酶專一抑制劑苯甲基磺醯氟化物(PMSF)對木聚糖酶有明顯的抑制作用，表明了木聚糖酶對金屬離子有依賴性且其活性中心含有絲氨酸。兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶的優點是:
1、鏈單孢放線菌 Μ 90494產生兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶最適溫度均為55°C，在60°C仍具有較高的酶活力。2、鏈單孢放線菌 Μ 90494產兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶在較廣的pH(4.0-11.0)範圍內具有較高的酶活力，且大部分金屬離子對兩種酶沒有明顯的抑制作用。綜合以上兩點，嗜鹽鏈單孢放線菌 Μ 90494產兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶在造紙、能源轉化、汙水處理等方面有很好的應用前景。
:圖1、18KDa木聚糖酶:圖Ι-a是鏈單孢放線菌YM 90494產木聚糖酶的反應溫度和相對活性的關係曲線。圖Ι-b是鏈單孢放線菌 Μ 90494產木聚糖酶的反應pH和相對活性的關係曲線。圖Ι-c是鏈單孢放線菌 Μ 90494產木聚糖酶的熱穩定性曲線。圖Ι-d是鏈單 孢放線菌YIM 90494產木聚糖酶的pH穩定性曲線。圖Ι-e是鏈單孢放線菌 Μ 90494產木聚糖酶的金屬離子耐受性曲線。圖Ι-f是鏈單孢放線菌 Μ 90494產木聚糖酶的有機試劑耐受性曲線。圖2、5OKDa木聚糖酶:圖2-a是鏈單孢放線菌YM 90494產木聚糖酶的反應溫度和相對活性的關係曲線。圖2-b是鏈單孢放線菌 Μ 90494產木聚糖酶的反應pH和相對活性的關係曲線。圖2-c是鏈單孢放線菌YIM 90494產木聚糖酶的熱穩定性曲線。圖2-d是鏈單孢放線菌YIM 90494產木聚糖酶的pH穩定性曲線。圖2-e是鏈單孢放線菌YM 90494產木聚糖酶的金屬離子耐受性曲線。圖2-f是鏈單孢放線菌YIM 90494產木聚糖酶的有機試劑耐受性曲線。
具體實施方式
:實施例1:木聚糖酶的最適反應溫度I準確稱取2g的樺木木聚糖，溶解於200mL的50mM pH8.0 Tris-HCl緩衝液中。2取上述底物溶液分裝於28個Eppendorf管中，每管80 μ I。其中7管為測定管，另外21管為對照管，分別置於25、35、45、55、65、75和85°C等11個不同的溫度下平衡30mino3加入20 μ I的稀釋酶液，以滅活的酶液為對照。4反應30min。反應結束後，迅速加入DNS終止反應。5沸水浴反應5min。6在波長為540nm處測其吸光度。以活力最高的那個溫度下所測得的酶活為參照，其餘溫度下所測得的酶活與其相對比，以相對酶活繪製酶催化溫度曲線。實施例2:木聚糖酶的最適反應pHI準確稱取0.50g的樺木木聚糖。溶解於50ml不同pH值的12種緩衝液中，所用到的緩衝液有:50mM的pH4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5,7.0,7.5的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩衝液，50mM 的 pH 7.5、8.0、8.5、9.0Tris-HCl 緩衝液、50mM 的 ρΗ9.0、9.5,10.0,10.5 的甘氨
酸-氫氧化鈉緩衝液。2取上述底物溶液分裝於64個Eppendorf管中(每種pH值4管),每管80 μ I。其中16管為測定管,另外48管為對照管,置於55°C水浴平衡20min。3加入20 μ I的稀釋酶液，以滅活的酶液為對照。4反應30min。反應結束後，迅速加入DNS終止反應。5沸水浴反應5min。6在波長為540nm處測其吸光度。以活力最高的那個pH下所測得的酶活為參照，其餘PH下所測得的酶活與其相對比，以相對酶活繪製酶催化PH曲線實施例3:金屬離子及有機試劑對酶活力的影響I準確稱取2g的樺木木聚糖，溶解於200mL的50mM pH8.0 Tris-HCl緩衝液中。2取上述底物溶液分裝於80個Eppendorf管中，每管80 μ I。其中60管為測定管，另外20管為對照管，置於55°C溫度下平衡30min。3 配置 50mM 的含有不同金屬離子的溶液(Al3+、Zn2+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Cd3+、Co2+、Pb2+、Ag+、Ca2+、Li+、Mg2+、Ni2+、K+、Na+、Ba2+)及 10% 的 SDS、DTT、PMSF、EDTA04取70 μ I ρΗ8.0 Tris-HCl緩衝液裝於若干個Eppendorf中，加入20 μ I的稀釋酶液，最後加入10μ I含有不同金屬離子和有機試劑的溶液(以等體積的緩衝液代替金屬離子為對照)，使金屬離子的終濃度為10mM，有機試劑終濃度為1%。5從每管中取20 μ I加入到在55°C溫度下平衡30min的木聚糖溶液底物，反應30min。反應結束後，迅速加入DNS終止反應。6沸水浴反應5min。7在波長為540nm處測其吸光度。以未處理所測得的酶活力為參照，含有不同金屬離子和有機試劑所測得的酶活力與其相對比， 以相對酶活力表示金屬離子和有機試劑對酶活力的影響。
權利要求
1.兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶，其特徵在於該兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶從保藏號為:CCTCC N0.M 2012556 的鏈單孢放線菌屬菌株(Sti^ptomonospora sp.)YIM 90494 發酵液中產生，其分子量分別為18KDa、50KDa ;酶活反應最適溫度均為55°C，最適反應pH值均為7.5，在pH4.0-11.0範圍 內酶活穩定，且Ag+和SDS對兩種酶具有激活作用。
全文摘要
本發明涉及兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶，屬於生物技術領域。該兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶從保藏號為CCTCC NO. M 2012556的鏈單孢放線菌屬菌株(Streptomonospora sp.)YIM 90494發酵液中產生，其分子量分別為18KDa、 50KDa；酶活反應最適溫度均為55℃，最適反應pH值均為7.5，在pH4.0-11.0範圍內酶活穩定，且Ag+ 和SDS對兩種酶具有激活作用。本發明提供的兩種耐Ag+和SDS木聚糖酶在造紙、洗滌劑、環保、食品、醫藥、能源轉化、飼料工業中將具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12N9/42GK103215240SQ20131005967
公開日2013年7月24日 申請日期2013年2月26日 優先權日2013年2月26日
發明者李文均, 任萬增, 楊心意, 張峰, 唐蜀昆 申請人:雲南大學