一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板的製作方法

2023-09-18 17:27:05 1

一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板的製作方法
【專利摘要】本實用新型公開了一種一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，包括多孔板、保護蓋和磁力架，磁力架內設有永磁體，磁力架的上緣設有用於固定多孔板的卡槽，多孔板的底部卡裝在卡槽內，多孔板的頂部蓋有保護蓋；多孔板內設有以陣列方式分布的若干陣列孔，所有陣列孔的陣列孔底部位於同一水平面內，且陣列孔的底部面積小於其頂部面積。該一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板製備簡單、成本低廉、使用方便，使磁珠法細胞分離和後續處理(培養、檢測)在同一容器內完成，杜絕了人工進行細胞轉移所造成的靶細胞丟失的缺陷，不僅可用於樣本中靶細胞的磁珠法分離(分選)、培養、檢測，也可用於其它生物靶分子的磁珠法分離和檢測及普通的細胞培養、檢測。
【專利說明】一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板

【技術領域】
[0001]本實用新型屬於生物【技術領域】，涉及一種用於靶細胞(分子)磁珠法分離、培養、檢測的裝置，具體涉及一種一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板。

【背景技術】
[0002]生物分子和細胞的分離、分選常被稱為大海撈針，而在20世紀7-80年代，多種生物分子分離技術不斷湧現出來，並很快從小分子分離發展到了實現完整細胞的分離、分選。
[0003]早已發現，磁性微粒(又稱磁珠)經過處理可與抗體偶聯，即可通過抗原-抗體反應與樣本中抗原物質或細胞表面抗原結合，結合後形成抗原-抗體-磁珠免疫複合物或細胞-抗體-磁珠免疫複合物，並在磁場作用下發生定向移動，從而使靶分子(或細胞)從複雜的環境中高效分離出來，達到從各種樣本中富集、分離、分選特異性靶分子(細胞)的目的。
[0004]自從1982年,Langenaur和Schachner利用包被抗少突膠質細胞表面抗原的單克隆抗體的磁珠從混合的細胞群體(少突膠質細胞約佔1.5% )中富集到純度達91 %的目的細胞以來。磁珠分離技術以其富集特異性好、檢測時間短等快速、高效的特點成為目前進行生物分子和完整細胞分離、分選的重要技術而被廣泛應用。
[0005]同時，由於磁式分選技術中，吸附和解離靶標的條件僅僅需要外加磁場和撤離磁場這種極為簡單的物理方法即可實現。同時，免疫磁珠也從抗體偶聯磁珠發展到生物素磁珠、二抗磁珠、Oligo dT磁珠等各類純化介質偶聯磁珠。目前,免疫磁珠已被廣泛應用高通量蛋白及抗體純化、核酸分離、細胞分選等領域，成為生物靶分子和細胞高通量分析的理想選擇。
[0006]尤其是其在細胞分選領域的應有更是突飛猛進。通常只需藉助偶聯在磁性微粒上的抗體高特異性識別並標記目標細胞表面抗原，再讓混有磁珠的細胞懸液通過磁場，結合了磁珠的細胞即可被吸附在磁場側壁上，而未結合的細胞被除去，得到純化的目標細胞，從而實現高效的分選和富集。磁式細胞分選高效快速，可在2-30分鐘內實現15到111個細胞的分選。
[0007]一般，磁式細胞分選可手動完成，簡單快速，不需要特別昂貴的設備，對實驗和技術要求較低，實驗流程對細胞損傷小，無菌和細胞狀態更有保證，且有極好的回收率和存活率，通常純度可達99%，回收率>90%。同時，分選得到的細胞可進行培養、血液回輸或者流式分析。目前，磁式細胞分選已經成為分離造血幹細胞、祖細胞、抗原特異性T或B細胞、腫瘤細胞等靶細胞的重要工具，也可作為對流式分選前樣本進行預處理。
[0008]目前，主要的磁式細胞分選產品品牌有德國美天旎(MACS)、Invitrogen旗下Dynal, BD公司、StemCell公司、R&D公司等等。其生產的磁珠雖大小各有不同，但多是由多聚糖和氧化鐵組成的超順磁化微粒。而用於磁珠分離的容器(分離管)多採使用試管式分離(tube-based)，一般可根據樣本體積選用常規的不同容量的試管或離心管作為分選容器(如普通的印pendorf離心管或者5ml或15ml離心管等)。而用於磁性分離的磁力架，也叫分選器(separator)就是為磁珠標記細胞提供分離磁場的一塊永磁鐵，均為配合相應磁性分離管和離心管而設計的。在使用時磁力架通常是吸附在特製鐵架的垂直面上，可根據分離柱和下面回收管高度隨意調整位置。磁珠標記靶細胞(分子)被吸附在管壁或者管底，經過幾次重複清洗即可完成分選。分選器可以手動或全自動方式完成單管、4聯管、8聯等不同的分離管完成不同數量樣本分選。
[0009]按照現有磁珠分選儀器設計策略和操作程序，在磁性分離完成之後，仍需採用吸管或移液器將分選的靶分子(細胞)轉移到相應的保存管、培養板或檢測管等容器內進行後繼處理或檢測(如流式細胞儀分析或分選、分子生物學研究、細胞培養、回輸給人或者動物，也可與螢光顯微鏡術、PCR或FISH等等)。而這一操作過程，無論是採用人工方式還是自動方式，均不可避免地會造成靶細胞(分子)不同程度的丟失，從而不同程度影響後續實驗結果，尤其是對於篩選低豐度靶細胞(分子)而言，這一缺陷的影響通常會是毀滅性的。因此，為彌補磁珠分離設備和操作方法的缺點，提供新的分選器和相應容器，優化分選操作步驟，最大程度減少靶細胞(分子)的丟失成為提高磁珠分選可靠性的關鍵，對於樣品中低豐度細胞的分離尤為重要。
實用新型內容
[0010]本實用的目的在於提供一種一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，以克服現有磁珠分離技術造成的靶細胞丟失的缺陷，提高磁珠分選的敏感性和可靠性。
[0011]為達到上述目的，本實用新型是通過以下技術方案來實現的:
[0012]一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，包括多孔板、保護蓋和磁力架，磁力架內設有永磁體，磁力架的上緣設有用於固定多孔板的卡槽，多孔板的底部卡裝在卡槽內，多孔板的頂部蓋有保護蓋；多孔板內設有以陣列方式分布的若干陣列孔，所有陣列孔的陣列孔底部位於同一水平面內，且陣列孔的底部面積小於其頂部面積。
[0013]所述的陣列孔上部的形狀為圓柱體形或稜柱體形，下部的形狀為相應的倒圓臺體形或倒稜台體形。
[0014]所述的陣列孔的深度為1.0cm?3.0cm，頂部面積為0.95cm2?9.5cm2，底部面積為 0.32cm2 ?2cm2 ο
[0015]所述的陣列孔底部透明，厚度為0.15?1.5mm。
[0016]所述的多孔板和保護蓋均採用透明材質通過一次成型技術製作而成。
[0017]所述的透明材質包括聚苯乙烯、聚丙烯和玻璃。
[0018]所述的磁力架採用橡膠或塑料製備而成，為平板式結構。
[0019]與現有技術相比，本實用新型具有以下有益的技術效果:
[0020]本實用新型提供的一體式靶細胞磁珠法分離、培養、檢測板構造簡單、便於製備、成本低廉、使用方便，非常適合於靶細胞(分子)的磁珠式分選，並且使細胞的磁珠分離和後繼處理(培養、檢測)在同一容器內完成，免除了採用吸管或移液器進行磁珠分選後靶細胞轉移的操作步驟，最大程度降低了現有技術在細胞轉移中造成的靶細胞丟失的缺陷，不僅可用於樣本中靶細胞的磁珠法分離(分選)、培養、檢測，也可用於其它生物靶分子的磁珠法分離和檢測及普通的細胞培養、檢測，能夠提高磁珠分選的陽性率、敏感性和可靠性，顯著節約實驗時間、人力、物力和試劑，尤其是對於低豐度靶細胞(分子)的分選和後繼處理更為重要。同時，該實用新型中由於採用陣列式結構的多孔板，因而可一次性同時對多種(個)樣本進行靶細胞(分子)的分離、後繼處理或直接檢測，尤其可直接使用倒置顯微鏡、正置顯微鏡、雷射共聚焦顯微鏡、數位化顯微鏡或掃描儀進行圖像攝取和觀察、分析。本實用新型可在醫學診斷、藥物開發、細胞生物學等領域推廣使用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1是一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板縱剖面結構示意圖；
[0022]圖2是一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板組合後縱剖面結構示意圖；
[0023]其中，1-多孔板、2-磁力架、3-保護蓋、4-陣列孔、5-陣列孔底部、6-永磁體、7-卡槽。

【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖對本實用新型做進一步的詳細說明，所述是對本實用新型的解釋而不是限定。
[0025]參見圖1和圖2，本實用新型提供的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，包括多孔板1、保護蓋3和磁力架2。
[0026]多孔板I上設有以陣列方式分布的若干陣列孔4，陣列孔4的上部形狀為圓柱體形或稜柱體形，下部形狀為相應的倒圓臺體形或倒稜台體形；陣列孔的底部面積小於其頂部面積，陣列孔深度為1.0cm?3.0cm，頂部面積為0.95cm2?9.5cm2,陣列孔底部5透明、面積為0.32cm2?2cm2、厚度為0.15?1.5mm,且所有陣列孔底部5位於同一水平面內。
[0027]保護蓋3可完全覆蓋於多孔板上，用於實驗操作和檢測過程中防止陣列孔內樣本不被汙染及保存。
[0028]多孔板I和保護蓋3採用聚苯乙烯、聚丙烯或玻璃等材質，按照上述設計要求，採用吹塑或注塑等一次成型技術分別製備，製備簡單，成本低廉，並在製作時可以根據需要放大和縮小。
[0029]磁力架2由橡膠或塑料製成平板式結構，表面平整，永磁體6位於由橡膠或塑料製成的磁力架2內，磁力架2上緣設置有用於放置和固定多孔板I的卡槽7，多孔板I的底部能夠卡裝在卡槽7內。磁力架2上的卡槽7大小與多孔板I相匹配，在製作時可以根據需要放大和縮小。
[0030]使用上述一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，使細胞的磁珠分離和後繼處理(培養、檢測)在同一容器內完成，因此，能十分方便、快速分選出目的細胞，並提高陽性細胞檢出率。其具體使用方法如下例所示:
[0031](I)離心收集待分離細胞，用少量PBE孵育液(0.5% BSA,0.08% EDTA pH7.2PBS，)充分混懸細胞(0.5ml/lX108細胞)，加入相應的一抗(10?20μ8/πι1終濃度)，4°C孵育30分鐘。離心後用適量PBE洗細胞一次，離心後再加PBE (0.3ml/l X 18細胞)充分混懸細胞後，轉移入多孔板I的陣列孔4中，並加入相應二抗包被的磁珠，混勻後置室溫孵育10?15分鐘。
[0032](2)將多孔板I安裝入相應磁力架2的卡槽7內，靜止並磁力吸附5?10分鐘，棄上清後將多孔板從相應磁力架2的卡槽7內取出，加入適量PBE重懸細胞後，再次將多孔板I安裝入相應磁力架2的卡槽7內，靜止並磁力吸附5?10分鐘。
[0033](3)重複⑵操作2?3次後將多孔板I從相應磁力架2的卡槽7內取出，進行後續試驗(直接培養或檢測等)。在實驗過程中加蓋保護蓋3以防止汙染。
[0034]本實用新型所提供的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，製備簡單、成本低廉、使用方便，使細胞的分離和後續處理(培養、檢測)在同一容器內完成，尤其適用於採用磁珠法進行靶細胞的分離和檢測，無需採用吸管或移液器進行靶細胞的轉移即可完成靶細胞的磁珠分選和後繼處理(培養、檢測或分析)，杜絕了人工進行細胞轉移所造成的靶細胞丟失的缺陷，提高目的細胞的陽性檢出率、敏感性和可靠性。此外，本實用新型所提供的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板除用於樣本中靶細胞的磁珠法分離(分選)、培養、檢測夕卜，也可用於其它生物靶分子的磁珠法分離、檢測，以及普通的細胞培養、檢測。
【權利要求】
1.一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，其特徵在於，包括多孔板(I)、保護蓋(3)和磁力架(2)，磁力架(2)內設有永磁體(6)，磁力架(2)的上緣設有用於固定多孔板(I)的卡槽(7)，多孔板⑴的底部卡裝在卡槽(7)內，多孔板⑴的頂部蓋有保護蓋(3);多孔板(I)內設有以陣列方式分布的若干陣列孔(4)，所有陣列孔(4)的陣列孔底部(5)位於同一水平面內，且陣列孔(4)的底部面積小於其頂部面積。
2.根據權利要求1所述的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，其特徵在於:所述的陣列孔(4)上部的形狀為圓柱體形或稜柱體形，下部的形狀為相應的倒圓臺體形狀或倒稜台體形。
3.根據權利要求1或2所述的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，其特徵在於:所述的陣列孔(4)的深度為1.0cm?3.0cm，頂部面積為0.95cm2?9.5cm2，底部面積為0.32cm2 ?2cm2。
4.根據權利要求1或2所述的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，其特徵在於:所述的陣列孔底部(5)透明，厚度為0.15?1.5mm。
5.根據權利要求1或2所述的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，其特徵在於:所述的多孔板(I)和保護蓋(3)均採用透明材質通過一次成型技術製作而成。
6.根據權利要求5所述的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，其特徵在於:所述的透明材質包括聚本乙糹布、聚丙糹布和玻璃。
7.根據權利要求1或2所述的一體式磁珠法細胞分離、培養、檢測板，其特徵在於:所述的磁力架(2)採用橡膠或塑料製備而成，為平板式結構。
【文檔編號】C12M1/00GK203923172SQ201420333907
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年6月20日 優先權日:2014年6月20日
【發明者】張明娟, 張澍, 張超英, 楊軍, 李宗芳 申請人:西安交通大學