瘧疾疫苗的製作方法

2023-09-10 20:40:15 1

專利名稱：瘧疾疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基於抗原的瘧疾疫苗，其含有衍生自與惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)富穀氨酸蛋白質(GLUPR)遺傳偶聯的至少一種其他惡性瘧原蟲來源的蛋白質(例如裂殖子表面蛋白3(MSP3))的融合蛋白；或者涉及含有編碼該融合蛋白的DNA的疫苗和這種疫苗的生產。
背景技術：
瘧疾侵襲世界人口的40％，估計每年有1.5-2.7百萬例死亡(57)。這給人類造成了巨大的苦難和負擔，阻礙受侵襲的地方社會的發展。瘧疾現在幾乎局限於非洲、亞洲和拉丁美洲最窮的熱帶地區，但是以前已經根除瘧疾的地區正被再次傳播。瘧疾是世界上最嚴重的公共健康問題之一。
越來越多的殺蟲劑抗性載體和藥物抗性寄生蟲的出現要求在新的和更好的控制工具方面進行投資。瘧疾疫苗具有極大地減輕瘧疾負擔的潛力。然而，由於我們對潛在的保護性免疫機制理解得還不完全，因此，仍然需要定義特定保護標記物。
有效的瘧疾疫苗需要誘導適當的體液和細胞免疫應答，以對抗在寄生蟲生命周期的不同階段表達的一些關鍵寄生蟲抗原。生命周期中的每一階段均為疫苗提供了機會。
兩條路線的證據表明可以得到瘧疾疫苗首先，已經非常明確地觀察到反覆暴露於瘧疾寄生蟲可導致形成堅固的臨床免疫(clinical immunity)——寄生蟲和保護性抗體共存的一種傳染病免疫狀態。臨床免疫個體通常具有較低的寄生蟲密度並且該免疫在降低死亡率方面十分有效。
其次，在人類和動物模型中的實驗已經確定免疫可誘導針對隨後的寄生蟲攻擊的免疫力，提示接種可成為控制瘧疾的一種現實的工具。
在現在的經典實驗中，Cohen和同事闡明從臨床免疫個體中純化的抗體的被動轉移可以在患有威脅生命的惡性瘧原蟲感染的非洲兒童中改善急性瘧疾發作(10)。Druilhe和同事證實了Cohen的結果(42)。他們證明來自臨床瘧疾免疫的西非人的IgG能夠以獨立於株系的方式實質性地降低患有藥物抗性惡性瘧原蟲瘧疾的無症狀泰國兒童的寄生蟲負荷。
這些突破性的被動轉移實驗已經證明抗體在減少/消除無性階段寄生蟲負荷中是關鍵的。
然而，使用相同的「保護性」IgG製劑的體外研究(42)闡明抗體自身不抑制寄生蟲生長，而是與血液單核細胞協同作用以控制寄生蟲繁殖(5)。該含有寄生蟲的機制被稱為抗體依賴的細胞抑制(ADCI)(5，26，31)。最近的研究進一步闡明嗜細胞抗體(如IgG1和IgG3)經由血液單核細胞的FcγIIa受體與血液單核細胞的結合引發殺傷因子(如腫瘤壞死因子-α)的釋放(6)。
免疫-流行病學研究通過證明臨床免疫力的獲得與IgG1和IgG3抗體(它們良好地結合單核細胞FcγRIIa受體)水平之間的相關性，而支持單核細胞依賴的、抗體介導機制的體內關聯性(1，41)。還發現FcγRIIa的等位基因多態性與對惡性瘧原蟲瘧疾的差別易感性有關，這也支持所推定的該受體參與臨床瘧疾免疫性的形成(45)。據報導，FcγRIIa-Arg131等位基因純合的肯亞嬰兒與具有雜合Arg/His131基因型的兒童相比高密度感染惡性瘧原蟲的危險較小(45)。由於FcγRIIa-Arg131基因型(而不是FcγRIIa-His131基因型)強烈結合IgG1和IgG3，所以該發現支持如下觀點單核細胞介導的惡性瘧原蟲殺傷是體內遏制寄生蟲的重要機制。此外，Aucan等人(2)發現特定IgG2抗體——而不是IgG3和IgG1——的水平與Bukina Faso群體中的臨床瘧疾保護有關。隨後對FcγRIIa的測序揭示70％的研究受試者有FcγRIIa-H131等位基因。該等位基因強烈結合IgG2(56)，表明IgG2在該群體中作為嗜細胞亞類起作用(2)。總之，這些觀察提示FcγRIIa基因型是產生臨床瘧疾免疫力的重要因子並對體外ADCI模型的有效性提供支持。
由於藥物抗性疾病發生率的不斷增加，瘧疾疫苗的開發已經日益被認為是世界範圍內首選的控制瘧疾的努力。因此需要新工具以便於候選疫苗的臨床評估，尤其是確證由接種提供的保護的體外關聯性。ADCI可提供一種這樣的工具(13)。當前最突出的血液階段疫苗候選者MSP1、MSP2、AMA1和RESA由於在臨床前動物模型中誘導生長抑制性抗體的能力而已經被初步選擇用於臨床試驗中(9，16，30，55)。然而，儘管最初有希望，但是它們已被證明通常在人類志願者中具有差的免疫原性(18，25，29，43)並且所誘導的抗體不能抑制惡性瘧原蟲的體外生長。因此，體外侵襲抑制試驗還不能作為免疫性的替代標記物。
由於人類保護中缺乏反映裂殖子侵襲抑制的適宜關聯物，從而已經促進了反映臨床免疫個體中可能的殺傷機理的其他體外模型的開發。Druilhe和同事推測抗體與人血液單核細胞協同作用以控制體內寄生蟲生長並且由此開發了該殺傷機理的體外關聯物——ADCI試驗。我們到目前為止已經鑑定了兩種抗原——GLURP和MSP3，它們是ADCI有效的人抗體的靶標。
惡性瘧原蟲富穀氨酸蛋白質(GLURP)和裂殖子表面蛋白3(MSP3)都是人IgG抗體的靶標，IgG抗體可以以依賴單核細胞的方式體外抑制寄生蟲生長(36，52)和在人源化SCID小鼠模型中體內抑制寄生蟲生長(3)。一些免疫-流行病學研究也揭示了針對這些抗原的人抗體的類似效果，這些研究說明GLURP和MSP3特異性嗜細胞抗體(IgG1和IgG3)的水平與瘧疾發作的危險性降低顯著相關(11，38，50)。
GLURP和MSP3的發現基礎是對利用純化的非洲人免疫球蛋白G進行的免疫性被動轉移的體外分析(5，6，14，42)。這些研究已經導致對惡性瘧原蟲瘧疾的防禦中假定的效應子機理的闡釋(12)，和對有關的寄生蟲分子的隨後鑑定。這些人類IgG抗體識別的主要B-細胞表位已經被分別定位於GLURP27-489和MSP3212-257區中的保守序列(36，50，51)。這些研究導致GLURP的N端區(GLURP27-489)(52)和MSP3的C-端區(MSP3210-380)(36)被鑑定為生物學活性抗體的靶標。
以前已經在大腸桿菌中產生了融合各種親和標籤的這些抗原的不同區域(35，53，54)。儘管這些附加的序列對於純化有利，但是它們造成了潛在問題，因為針對這些序列的宿主免疫應答可以使得它們不能用於反覆應用。
免疫流行病學研究證實了抗GLURP和抗MSP3抗體與獲得性保護的相關性對於GLURP，在Dielmo、Senegal(38)，Dodowa、Ghana(11，50)和OoDo、Myanmar(Soe Soe，未發表)中進行的三個獨立研究已經闡明GLURP特異的IgG3和/或IgG1抗體水平與抗瘧疾發作的保護作用之間存在統計學上顯著的相關性。即使在控制了由年齡相關的惡性瘧原蟲暴露造成的混淆性效果後，該相關性也是高度顯著的。這些結果證實了以前的研究，這些以前的研究發現天然發生的針對GLURP的IgG抗體與甘比亞兒童中的疾病對抗保護相關(15)並且與利比亞(21)和布吉納法索(4)的兒童中對抗高水平的寄生蟲血症的保護作用相關。
對於MSP3，嗜細胞抗體與非嗜細胞抗體(IgG1+IgG3/IgG2+IgG4+IgM)的高比值(＞2)使得可以區分沒有瘧疾發作記錄的個體與有瘧疾發作的個體。在來自Dielmo的約200個村民的每個年齡組中都發現該現象，這些村民已經處於長達8年以上的每日臨床監測中(37)。在個體水平，與針對相同分子的其他同種型抗體或者針對5種其他抗原的任一同種型抗體相反，抗MSP3 IgG3抗體的出現與保護作用強烈相關(37)。
對於任何其他瘧疾疫苗候選者(如MSP1——迄今主要的針對惡性瘧原蟲瘧疾的疫苗候選者)，血清流行病學數據中類似的一致性並不常見。
這些人IgG抗體識別的主要B細胞表位已被分別定位於GLURP27-489和MSP3212-257區的保守序列上(36，50，51)。這些研究導致GLURP的N末端區(GLURP27-489)(52)和MSP3的C端區(MSP3210-380)(36)被鑑定為生物學活性抗體的靶標。
對來自44個惡性瘧原蟲野外分離株和實驗室株系的GLURP27-489和MSP3210-380區域的序列分析顯示，被ADCI有效人類抗體靶定的GLURP(P1、P3和P4)(48)和MSP3(b肽)(34)中的確定表位幾乎完全保守，表明它們功能性地受到限制並且不發生胺基酸水平上的變異選擇。在GLURP27-489區的不同表位中，P3可能是最重要的，因為親和純化的抗P3肽人抗體體外介導最強的ADCI效應(51)。GLURP和MSP3中主要B細胞表位的保守性可被下面的觀察進一步支持這些主要B細胞表位在惡性瘧原蟲和最緊密相關的寄生蟲——裡氏瘧原蟲(Plasmodiumreichenowi)(黑猩猩的一種天然寄生蟲)之間幾乎是一致的(39，53)，並且來自臨床瘧疾免疫的71個成年利比亞人的血漿IgG抗體對代表來自兩個物種的GLURP27-500區的重組蛋白表現出相同的結合模式(53)。
總之，這些發現表明被生物學有效的人抗體識別的GLURP和MSP3B細胞表位在地理上遙遠的惡性瘧原蟲分離株之間是保守的並且功能性地受到限制，由此提示基於GLURP和MSP3的疫苗可以提供對抗世界範圍內廣譜寄生蟲株系的保護作用。
體外實驗表明親和純化的天然抗GLURP(52)和MSP3(36)人抗體可以以單核細胞依賴的方式抑制寄生蟲生長，而基於其他7種瘧疾疫苗候選者的親和純化的對照抗體不能發揮類似作用(47)。
使用針對重組蛋白(GLURP27-489，和GLURP705-1178)(52)和來自GLURP R0區的合成肽，即P3(GLURP93-207)、S3(GLURP407-434)或LR67(GLURP85-312)(50，51)的天然發生的親和純化的IgG抗體得到相同的抑制效果。
體內實驗中，將親和純化的MSP3b特異的人抗體被動轉移到惡性瘧原蟲感染的Hu-RBC BXN小鼠中，該體內實驗表明寄生蟲清除與氯奎誘導的寄生蟲清除一樣快，並且快於總的非洲人IgG誘導的清除(3)。後一觀察表明用選擇的抗原進行免疫可以導致比完整寄生蟲誘導的免疫性更強的免疫性(3)。
體內實驗中，用弗氏完全佐劑中的重組MSP3免疫的夜猴(Aotusmonkey)被完全保護而免受實驗性惡性瘧原蟲攻擊(20)。對松樹猴(Saimiri sciureus)的免疫表明吸附到Al(OH)3上的GLURP27-500是無毒的、具有免疫原性並且引起高效價抗GLURP抗體，該抗體通過IFA識別惡性瘧原蟲(8)。在隨後用惡性瘧原蟲感染的紅細胞進行的攻擊中，三隻猴子中的兩隻被部分保護，該效果與靈長類動物應答免疫原所產生的抗體的效價和表位專一性直接相關(8)。
這些發現強烈支持如下觀點引起ADCI有效抗體的、針對GLURP和MSP3B細胞表位的免疫應答控制體內寄生蟲繁殖。
以前已經在大腸桿菌中產生了融合各種親和標籤的這些抗原的不同區域(35，53，54)。儘管這些附加序列對於純化有利，但是它們造成了潛在問題，因為針對這些序列的宿主免疫應答可以使得它們不能用於反覆應用。因此需要開發表達系統，其目的是產生沒有載體編碼的親和標籤的重組蛋白。
已經選擇了有限數目的基於MSP3和GLURP的製劑用於進一步疫苗開發，並已經首先在小鼠(49，54)然後在惡性瘧原蟲攻擊的非人靈長類動物(8)中進行了臨床前水平研究。GLURP的N-端區和MSP3的C-端區在臨床前模型中被證明具有強免疫原性。現在已經使用新的、基於乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的pH和生長期調節性啟動子P170的高效表達系統分別生產這些區域(23，33)。
我們到目前為止鑑定了兩種抗原——GLURP和MSP3，它們是ADCI-有效的人抗體的靶標，並且最近用各抗原分別完成兩個I期臨床試驗。兩種疫苗都在志願者中誘導強細胞應答，而IgG抗體應答是中等的。GLURP試驗的所有志願者都產生了針對P3B細胞表位的抗體，該表位在臨床免疫個體中是ADCI有效抗體的最突出的靶標。疫苗誘導的抗體的相對低水平可能與GLURP合成肽上B細胞表位的數目有限有關。
因此，需要開發基於重組蛋白的疫苗，其包括GLURP和MSP3(優選地具有含有額外的B細胞和T細胞表位的相鄰序列)或者來自惡性瘧原蟲的其他抗原(如CS-抗原)。還需要使用產生沒有載體編碼的親和標籤的重組蛋白的表達系統，如乳酸乳球菌。
發明概述本發明公開了針對瘧疾的疫苗，其改善了疫苗誘導的抗體表達。該疫苗含有融合蛋白或者含有編碼所述融合蛋白的相應核苷酸序列，其中所述融合蛋白衍生自與惡性瘧原蟲富穀氨酸蛋白質(GLUPR)遺傳偶聯的至少一種其他惡性瘧原蟲來源的蛋白質(例如裂殖子表面蛋白3(MSP3))。
發明詳述本發明公開了基於抗原的瘧疾疫苗，其含有融合蛋白或者其同系物，其中所述融合蛋白衍生自與惡性瘧原蟲富穀氨酸蛋白質(GLURP)遺傳偶聯的至少一種其他惡性瘧原蟲來源的蛋白質。
本發明的一個優選實施方案是疫苗，其中遺傳偶聯到GLURP的蛋白質來自惡性瘧原蟲的裂殖子表面蛋白3(MSP3)，所述融合蛋白優選具有SEQ ID NO 1中顯示的胺基酸序列。
在另一實施方案中，該疫苗含有SEQ ID NO 1和其它來自惡性瘧原蟲的蛋白質的免疫原性表位。
本發明還公開了具有SEQ ID NO 1中所示胺基酸序列的融合蛋白，並提示了還含有來自惡性瘧原蟲的一種或多種蛋白質的一個或多個免疫原性表位的融合蛋白，其中所述蛋白為例如CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、MSP6、AMA1、Pf155/RESA、RAP1、EBA-175、pfEMP1、EXP1、LSA1、LSA3、Pf25、Pf45/48、Pf230、Pf27、Pf16、或Pf28。
本發明還涉及從重組細菌(例如乳球菌)製備上面提到的融合蛋白。
另一方面，本發明涉及編碼上述融合蛋白的核酸和所述核酸在製備疫苗中的用途。用於疫苗的核酸的一個優選實施方案是如SEQ ID NO 2中所示的序列。
還在另一個實施方案中，該疫苗包含含有編碼上述融合蛋白的核酸序列的重組BCG。
因為基於GLURP和MSP3的疫苗誘導相同類型的免疫應答(即高水平嗜細胞抗體)並且可能彼此互補作為免疫系統的靶標，所以在新型基因表達系統中將相應的GLURP25-500和MSP3212-382區作為重組雜合物一起導入乳酸乳球菌中，該基因表達系統基於pH和生長期調節性啟動子——來自乳酸乳球菌的P170(7，23，33，56)。該基因表達系統提供了一種簡單的發酵方法，其被開發專門用於P170啟動子。乳酸乳球菌被選做表達宿主是因為i)其是一種被良好表徵的、工業上普遍認可的安全(GRAS)微生物，其最令人熟知的用途是用於生產發酵的奶製品，ii)其可以生長在已知成分的合成培養基中；iii)重組蛋白質可被分泌到培養基上清液中，可以從上清液容易地純化重組蛋白質，iv)其不產生毒性物質。
現在已經使用乳酸乳球菌在嵌合的融合蛋白中以雜合蛋白形式生產GLURP的N-端區和MSP3的C-端區。
已經使用Montanide(Seppic)作為佐劑在小鼠中研究了雜合蛋白的免疫原性。Montanide與分別來自GLURP和MSP3的長合成肽用於最近的臨床試驗中。使用雜合蛋白免疫總是比兩種分子的混合物產生更強的針對各GLURP和MSP3域的抗體應答。
對於MSP3-特異抗體應答，該差異最顯著，表明位於GLURPR0-區中的T細胞表位為MSP3區中的B細胞表位提供了幫助。這是GLURP抗原的令人驚奇的能力，該抗原也可與其他瘧疾抗原一起使用。
相反，當用GLURP和MSP3的混合物注射動物時，小鼠個體傾向於產生針對分子之一的主要抗體應答。在一些動物中，GLURP是免疫優勢的，而在其他動物中MSP3是優勢免疫原。
在臨床免疫的成年非洲人中，雜合抗原比單獨抗原更有效地被天然發生的IgG抗體識別。
因此，與單獨的GLURP和MSP3分子相比，GLURP-MSP3雜合蛋白有4個主要優點i)其比單獨分子的任何組合都更具免疫原性，ii)其產生針對GLURP和MSP3兩者的強烈免疫應答，iii)其允許在單一臨床試驗中測試GLURP和MSP3兩者，
iv)預期其和單獨的分子一樣安全，因為在小鼠和非人靈長類動物中的臨床前試驗已經表明在GLURP和MSP3之間的融合連接處不含有新表位。
其他鑑定的適宜作為GLURP抗原的融合配偶體的惡性瘧原蟲抗原是CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、MSP6、AMA1、Pf155/RESA、RAP1、EBA175、pfEMP1、EXP1、LSA1、LSA3、Pf25、Pf45/48、Pf230、Pf27、Pf16、或Pf28。
定義融合蛋白重組融合蛋白由如下核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列是通過遺傳連接來自一個基因的不同區域的核苷酸序列和/或連接來自兩個或多個分開的基因的核苷酸序列而得到的。這些核苷酸序列可來自惡性瘧原蟲，但是它們也可以來自其他生物、用於克隆步驟的質粒或者來自其他核苷酸序列。
免疫原性片段或表位免疫原性片段或表位被定義為可以在當前或者以前被如瘧疾之類的微生物感染的生物樣品或者個體中誘導免疫應答的蛋白質的一部分。
可以通過下面方法之一監視免疫應答·通過取自當前或者以前被瘧疾感染的動物或人的淋巴細胞的相關細胞因子(如IFN-γ)釋放，或者通過對這些T-細胞的增殖的檢測來測定體外細胞應答。通過將多肽或者免疫原性部分加入每孔含有1×105個細胞到3×105個細胞的懸浮液中實施誘導。細胞分離自血液、脾臟、肝臟或者肺，多肽或者免疫原性部分的加入導致濃度不超過20μg/ml懸浮液並且實施刺激2到5天。為了監視細胞增殖，用放射性標記的胸苷脈衝細胞。在孵育16-22小時後，通過液體閃爍計數檢測增殖。陽性應答為大於背景加兩個標準差的應答。可通過ELISA方法測定IFN-γ的釋放，該ELISA方法是本領域中技術人員熟知的。陽性應答為大於背景加兩個標準差的應答。當監視對多肽的免疫應答時，除IFN-γ外的其它細胞因子(如IL-12、TNF-α、IL-4、IL-5、IL-10、IL-6、TGF-β)可能是恰當的。確定細胞因子(例如，IFN-γ)的存在的另一種更靈敏的方法是ELISPOT方法，其中從血液、脾臟、肝臟或者肺分離的細胞被稀釋到優選1到4×106個細胞/ml的濃度並在不超過20μg/ml濃度的多肽或者免疫原性部分的存在下孵育18-22小時。此後，將細胞懸浮液稀釋到1到2×106/ml並轉移到用抗-IFN-γ包被的Maxisorp板並優選孵育4到16小時。可以使用標記的第二抗-IFN-γ抗體和產生點的相關底物確定產生IFN-γ的細胞，所產生的點可以使用解剖顯微鏡計數。還可以使用PCR技術確定編碼相關細胞因子的mRNA的存在。通常，將使用如PCR、ELISPOT或者ELISA測量一種或多種細胞因子。本領域技術人員將明白被特定多肽誘導的這些細胞因子中任一種的量的顯著增加或減少都可以用於評價多肽的免疫學活性。
·也可以使用來自免疫個體或者瘧疾感染者的T細胞系測定體外細胞應答，其中該T細胞系已經被活惡性瘧原蟲、該寄生蟲的提取物或者培養物濾液在加入IL-2的情況下驅動10到20天。通過將不超過20μg多肽/ml的懸液加入每孔含有1×105個細胞到3×105個細胞的T細胞系從而實施誘導，並孵育2到6天。通過ELISA檢測IFN-γ的誘導或者另一種相關細胞因子的釋放。也可以如上描述用放射性標記的胸苷檢測細胞增殖來監視對T細胞的刺激。對於兩種測定法，陽性應答是大於背景加兩個標準差的應答。
·在對臨床或者亞臨床感染惡性瘧原蟲的個體皮內注射或者作為貼劑局部應用最多100μg多肽或者免疫原性部分後，可以以陽性DTH應答形式確定體內細胞應答，在注射或應用後72-96小時陽性應答具有至少5mm直徑。
·通過免疫或者受感染的個體中特異的抗體應答測定體外體液應答。可通過ELISA技術或者蛋白質印跡確定抗體的存在，其中多肽或者免疫原性部分被吸附到硝酸纖維素膜或者聚苯乙烯表面。優選以1∶10到1∶100將血清稀釋於PBS中，並加到所吸附的多肽中並孵育1到12小時。通過使用標記的第二抗體，可通過測量OD(例如通過ELISA，其中陽性應答是大於背景加兩個標準差的應答)或替代性地通過蛋白質印跡中的可見應答確定特異抗體的存在。
·另一個相關參數是在用佐劑中的多肽接種或者DNA接種後測量動物模型中誘導的保護作用。適宜的動物模型包括靈長類動物、豚鼠或小鼠，它們被感染攻擊。所誘導的保護作用的讀出可以是與未接種動物相比的寄生蟲密度降低、與未接種的動物相比延長的存活時間和與未接種動物相比減小的重量損失。
同系物蛋白同系物被定義為本發明的融合蛋白的類似物或變體。該融合蛋白的特徵在於特定的胺基酸並且被特定的核酸序列編碼。應理解這些序列包括通過重組或合成方法產生的類似物和變體，其中這些多肽序列已經通過在重組多肽中置換、插入、加入或缺失一個或多個胺基酸殘基而被修飾，但是在此處描述的任一種生物學測定法中仍然具有免疫原性。置換優選為「保守的」。置換優選為密碼子用法中的沉默置換，其不導致胺基酸序列的任何變化，但是可被導入以增強蛋白質的表達。這些根據下表定義。第二列中相同方框中的胺基酸和優選地第三列中相同行中的胺基酸可以相互置換。第三列中的胺基酸以單字母碼表示。

疫苗，蛋白質本發明涉及含有根據本發明的融合蛋白的疫苗組合物。為了確保這種疫苗組合物的最佳性能，優選該疫苗組合物含有免疫學和藥學上可接受的載體、賦形劑或佐劑。
與未接種的動物相比，有效疫苗(其中本發明的蛋白質被動物識別)在動物模型中能夠在瘧疾寄生蟲攻擊後減少血液和靶器官中的寄生蟲負荷，延長存活時間和/或減少體重損失。
此外，本發明的融合蛋白可以偶聯到糖或者脂質部分(例如、載體)，或者以其他方法修飾，例如，被乙醯化。
當在微生物中生產時，如果不採取特殊措施，本發明的融合蛋白將通常不被乙醯化。因為乙醯化的多肽在細胞、血液或身體和組織液中可能更穩定，所以乙醯化可能是有利的。此外，乙醯化可賦予多肽能夠模擬天然惡性瘧原蟲抗原的結構和構象的結構和構象。
適宜的載體選自通過疏水非共價相互作用結合多肽的聚合物，如塑料(例如聚苯乙烯)，或者共價結合多肽的聚合物，如多糖，或多肽(如牛血清白蛋白、卵清蛋白或者匙孔槭血藍蛋白)。適宜的賦形劑選自稀釋劑和懸浮劑。佐劑優選選自溴化二甲基雙十八烷基銨(DDA)、Quil A、poly IC、氫氧化鋁、弗氏不完全佐劑、IFN-γ、IL-2、IL-12、單磷醯基脂A(MPL)、海藻糖二黴菌酸酯(TDM)、海藻糖二山嵛酸酯和胞壁醯基二肽(MDP)。
含有作為活性成分的肽序列的疫苗的製備是本領域中熟知的，如美國專利4,608,251、4,601,903、4,599,231和4,599,230所例證的，所有這些專利在此處被併入作為參考。
實現用於疫苗的佐劑效果的其他方法包括使用試劑如氫氧化鋁或者磷酸鋁(alum)、糖的合成聚合物(Carbopol)，通過熱處理使疫苗中的蛋白質聚集，通過與胃蛋白酶處理的針對白蛋白的(Fab)抗體反應聚集，與細菌細胞(如C.parvum)或革蘭氏陰性細菌的內毒素或者脂多糖組分混合，在生理學上可接受的油性賦形劑如一油酸二縮甘露醇酯(Aracel A)中乳化或者也可以使用用作block substitute的20％全氟化碳(Fluosol-DA)溶液進行乳化。其他可能方案包括聯合上述佐劑使用免疫調節物質如細胞因子或者合成的IFN-γ誘導劑(如poly IC)。
另一種實現佐劑效果的有意義的可能方案是使用Gosselin等人，1992(19)中描述的技術。簡言之，相關抗原(如本發明的抗原)可以被綴合到針對單核細胞/巨噬細胞上Fcγ受體的抗體(或者結合抗原的抗體片段)上。
疫苗以與劑量配製相容的方式施用，並且所施用的量是治療有效的和免疫原性的。所施用的量依賴於所治療的受試者，包括如個體的免疫系統發動免疫應答的能力，和所希望的保護程度。適宜的劑量範圍約為每次接種幾百微克活性成分，優選的範圍為約0.1μg到1000μg，如約1μg到300μg的範圍，特別約10μg到50μg的範圍。最初施用和強化接種的適宜方案也是可變的但是通常為最初施用後接著隨後接種或其他施用。
應用的方式可以變化很大。可以應用任何施用疫苗的常規方法。這些方法被認為包括在固態生理學上可接受的基質上或在生理學上可接受的分散體中口服應用，和通過注射等的腸胃外應用。疫苗的劑量將依賴於施用途徑並根據所要接種的人的年齡而變化和較小程度地根據所接種的人的尺寸而變化。
通常通過注射，例如皮下或者肌內注射，腸胃外施用疫苗。適於其他施用模式的其它製劑包括栓劑和，在某些情況中，口服製劑。對於栓劑，常規結合劑和載體可包括如聚烷烯二醇或甘油三酯；可以從含有0.5％到10％(優選1-2％)活性成分的混合物形成這些栓劑。口服製劑包括這些通常使用的賦形劑，如藥物級甘露醇、乳糖、澱粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。這些組合物採取溶液劑、懸浮劑、片劑、丸劑、膠囊劑、緩釋製劑或者粉劑的形式並且優選含有10-95％的活性成分，優選25-70％的活性成分。
在許多情況中，必須多次施用疫苗。特別地，可以施用疫苗以預防瘧疾感染和/或治療已確立的瘧疾感染。當施用疫苗預防感染時，在感染的確定臨床病徵或者症狀出現之前，預防性地施用該疫苗。
由於基因變異，不同個體對於相同蛋白質的免疫應答可能具有不同的強度。因此，根據本發明的疫苗可以含有一些不同的蛋白質以便增強免疫應答。疫苗可以含有兩種或多種多肽或免疫原性部分，其中所有蛋白質如上面定義，或者這些肽中的一些(但不是所有)可以來自惡性瘧原蟲或者其他微生物。在後一實例中，不一定滿足上面為多肽提出的標準的多肽可以由於它們的自身免疫原性而起作用或者僅僅作為佐劑起作用。
疫苗可以含有1-20(如2-20或者甚至3-20種)不同的蛋白質者融合蛋白，如3-10種不同的蛋白質或融合蛋白。
本發明還涉及免疫動物(包括人)以抵抗例如由惡性瘧原蟲導致的瘧疾的方法，該方法包括對動物施用本發明的融合蛋白，或如上描述的本發明疫苗組合物，或下述活疫苗。
本發明還涉及生產根據本發明的免疫組合物的方法，該方法包括製備、合成或分離根據本發明的融合蛋白，並將該融合蛋白溶解或分散在用於疫苗的介質中，並任選加入其他抗原和/或載體、賦形劑和/或佐劑物質。
本發明的另一方面是在重組微生物中產生本發明雜合蛋白，該重組微生物除了表達編碼本發明雜合蛋白的DNA序列之外，還表達對不同於瘧疾的另一種疾病(例如結核病)具有治療或保護效果的一種或多種抗原。這些其他抗原可以作為分開的抗原表達或者與本發明雜合蛋白相融合而表達。對Tb有效的其他抗原的實例是ESAT6、CFP7、CFP10、CFP29、ORF2c、TB13、MPT59、α-crystalline、Rv0285和它們的雜合物，但是該概念不僅限於TB或者針對TB的抗原。
疫苗DNA本發明的核酸片段可用於實現抗原的體內表達，即核酸片段可用於所謂的DNA疫苗中(如Ulmer等人，1993所綜述的，其被併入為參考文獻)。
因此，本發明還涉及含有根據本發明的核酸片段的疫苗，該疫苗實現了該疫苗所施用的動物(包括人)對抗原的體內表達，所表達的抗原的量可有效賦予動物(包括人)對惡性瘧原蟲導致的感染具有顯著增加的抗性。
通過將編碼表達產物的基因與編碼能夠調節免疫應答的多肽的DNA片段一同施用，可能可以增加這種DNA疫苗的效力。
活重組疫苗可以通過在非病原性微生物或者病毒中表達疫苗的相關抗原，有效地活化針對疫苗的細胞免疫應答。這種微生物的熟知的實例是牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)BCG、沙門氏菌(Salmonella)和假單胞菌(Pseudomona)，病毒的實例是痘苗病毒和腺病毒。
因此，本發明的另一重要的方面是當前可獲得的活BCG疫苗的額外品質，其中編碼如上面定義的一種或多種融合蛋白的DNA序列的一份或多份拷貝已經以允許微生物表達並分泌該蛋白質的方式摻入到該微生物的基因組中。可以考慮摻入本發明多核苷酸序列的一份以上的拷貝以增強免疫應答。
本發明的另一方面是非病原性微生物，如乳酸乳球菌或者BCG，該微生物表達編碼如上定義的一種或多種融合蛋白的DNA序列並額外表達一種或多種其它抗原，所述其它抗原對不同於瘧疾的疾病(例如結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)導致的結核病)具有治療或保護作用。這些其他抗原可作為分開的抗原表達或者與本發明雜合蛋白融合而表達。對Tb有效的其他抗原的實例(通過它們的Sanger資料庫登錄號鑑別)是Rv3875(ESAT6)、Rv1886c(Ag85B)、Rv0288(CFP7)、Rv3874(CFP10)、Rv0798c(CFP29)、Rv2031c(α-crystalline)和Rv0285或者它們的片段或雜合物，最優選ESAT6-Ag85B雜合物，但是該概念不僅限於TB或針對TB的抗原。
通過將編碼表達產物的基因與編碼能夠調節免疫應答的多肽的DNA片段一起施用可能可以增強這種DNA疫苗的效果。例如，可以將編碼淋巴因子前體或者淋巴因子(例如，IFN-γ、IL-2、IL-12)的基因與編碼免疫原性融合蛋白的基因一起施用，可通過施用兩種分開的DNA片段或者通過施用包含在同一載體中的兩種DNA片段實現該施用。
另一可能性是將編碼根據本發明的多肽的DNA整合在減毒病毒(如痘苗病毒或腺病毒)中(40)。重組痘苗病毒能夠在受感染的宿主細胞的細胞質中複製並且目的蛋白可因此誘導免疫應答，預期該免疫應答誘導對抗瘧疾的保護作用。
治療性疫苗本發明還涉及本發明融合蛋白或核酸用作如D.Lowry(Lowry等人1999)在文獻中描述的治療性疫苗的用途。可根據當作為疫苗施用時，實驗動物中降低瘧疾感染的嚴重性或者防止以前的感染再活化的能力來鑑定具有治療性質的抗原。可以根據如上關於疫苗的描述來製備用作治療性疫苗的組合物。
附圖簡述

圖1.pPSM1013和pAMJ328和用於乳酸乳球菌的表達構建體的示意圖。指出了文中提到的載體編碼的限制位點的位置、啟動子P170、Shine-Dalgarno序列(SD)和310mut2信號肽。預期信號肽酶在32和33號胺基酸之間切割，從而在成熟重組蛋白的N-末端留下Ala-Glu殘基。glurp和MSP3的核苷酸編號分別相對於M59706和L07944的ATG密碼子中的A。
圖2.(A)純化的乳酸乳球菌MG1363中產生的GLURP-MSP3融合蛋白(泳道1)、GLURP25-514(泳道2)，和MSP3212-380(泳道3)的12.5％聚丙烯醯胺凝膠的考馬斯藍染色。(B)C4柱上分別對GLURP-MSP3雜合蛋白和GLURP25-514的HPLC分析。指出了分子量標準參照物的大小(千道爾頓)。(C)GLURP-MSP3雜合蛋白和GLURP25-514的推導的胺基酸序列和肽作圖。GLURP-MSP3雜合蛋白的頭四個胺基酸(Ala-Glu-Arg-Ser)來自克隆載體pSM1013。從考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠切出用於肽質量作圖的樣品。基本如所描述的(44)，將條帶的一半(約1μg蛋白質)洗滌、乾燥、還原並用碘乙醯胺烷基化，之後用修飾的胰蛋白酶(Promega，USA)過夜消化。將消化物的上清液應用於填裝Poros 20 R2反相柱材料(PerSeptive，USA)的GELoader tips(Eppendorff，德國)並用0.8μlα-氰基羥基肉桂酸(於70％乙腈/30％水中20μg/μl)直接洗脫到MALDI靶上(28)。在以反射鏡模式運行的PerSeptive Voyager STR(PerSeptive，USA)上實施分析並在GPMAW ver.5.02(Lighthouse data，丹麥)中分析結果。MALDI-TOF譜中肽所覆蓋的序列加有下劃線並指出總的測序覆蓋百分比。
圖3.來自臨床瘧疾免疫的成年利比亞人的71個血漿樣品中對GLURP和MSP3衍生抗原對的IgG抗體應答模式。在每圖中提供了相關係數和P值。
圖4.小鼠中的抗體應答。用雜合物(gr7)、一個注射器中的GLURP和MSP3的混合物(gr8)，或處於分開的注射器中於不同部位注射的GLURP和MSP3(gr9)對每組10隻小鼠免疫。(A)在用GRURP25-514或者MSP3212-380包被的ELISA板上測試第35天的血漿樣品的抗體反應性。箱圖顯示了中位數、第25和第75百分位數，須狀線(whisker)顯示了數據的範圍。(B)小鼠血清對代表GLURP B細胞表位的8種肽的累積應答。(C)結果示於A圖的小鼠的同種型應答。每個垂直棒代表GLURP和MSP3特異性ELISA中的平均吸收(±SEM)。
圖5.雜合物僅含有GLURP和MSP3來源的B細胞表位。將來自用雜合物免疫的小鼠的血漿池與指明濃度的GLURP、MSP3、GLURP和MSP3的混合物或者雜合物預孵育，之後加入用該雜合物包被的ELISA。與GLURP和MSP3的混合物或者雜合物預孵育完全抑制Ig抗體與雜合物的結合。
圖6.惡性瘧原蟲NF54的免疫印跡分析。在7.5％聚丙烯醯胺凝膠上分離完整細胞提取物並用血漿進行免疫印跡，這些血漿來自用GLURP25-514(泳道1)、MSP3212-380(泳道2)和GLURP-MSP3雜合物(泳道3)免疫的小鼠。圖中指出了分子量標準參照物的大小(千道爾頓)。
實施例實施例1材料和方法細菌菌株、質粒和生長條件。含有指明的質粒的大腸桿菌DH10B(K-12，F-mcrAΔ(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZΔm15ΔlacX74deoRrecA1 endA1 araD139Δ(ara，leu)7697galUgalKλ-rpsL nupG)(LifeTechnologies)生長於補加紅黴素(200μg/ml)的Luria肉湯(LB)中。含有指明的質粒的乳酸乳球菌MG1363(17)生長於補加1μg/ml紅黴素的增強的合成胺基酸(SA)培養基(該培養基被命名為3×SAIV培養基(24))或含有0.5％(wt/vol)葡萄糖的M17肉湯(Difco Ltd.)中。固體化的LB或M17培養基分別補加200和1μg/ml紅黴素。載體pPSM1013(圖1)是一種基於pAMβ1複製子(46)的高拷貝數表達質粒，其含有獨特限制性位點，允許構建具有優化的分泌信號肽序列(SP310mut2)的框內融合物(Ravn，P.，Arnau，J.，Madsen，S.M.，Vrang，A.，和Israelsen，H.未出版)。該肽的mRNA從質粒編碼的翻譯起始位點翻譯並且從pH和生長期可誘導的乳酸乳球菌啟動子P170轉錄(7，23，33)。pH值為7或者更高時，基本上沒有從P170啟動子的轉錄。然而，在pH低於6.5時，在向穩定期的過渡中轉錄被誘導。通過使質粒pPSM1013缺失所有lacZ調節序列以避免從lac啟動子轉錄，並通過產生沒有信號肽的新克隆區，從pPSM1013衍生出質粒pAMJ328(32)。
在乳酸乳球菌中表達GLURP和MSP3的質粒的構建。所有質粒都在大腸桿菌DH10B中構建並通過如所描述的電穿孔(22)轉化到乳酸乳球菌MG1363中。通過DNA測序驗證所有的質粒構建。
pMST73.用引物5′-CCC AGA TCTACA AGT GAG AAT AGA AATAAA C[核苷酸79到100](從M59706的ATG起始密碼子中的A起始計數)和5′-CCC AGA TCTTGC TTC ATG CTC GCT TTT TT CCG AT[核苷酸1475到1500]擴增FVO glurp的非重複區；用BglII消化，並將所得DNA片段克隆到BgHI消化的pPSM1013中。
pKBR5.用BamHI和SalI消化pMST73質粒，並將所得的含有glurp插入片段的DNA片段克隆到BamHI-SalI消化的pAMJ328中。
pKBR7.用引物5′-AAG TAG ATC TAC TAA TAC AAG TGA GAATAG AAA TAA AC[核苷酸73到100]和5′-GTT CAG ATC TTT ATT CATGAT GGC CTT CTA GC[核苷酸1519到1542]擴增F32glurp的非重複區；將所得DNA片段用BglII消化並克隆到BglII消化的pPSM1013中。
pKBR8.用BamHI和SalI消化質粒pKBR7，並將glurp插入片段克隆到BamHI-SalI消化的pAMJ328中。
pKBR9.用引物5′-CCCAGA TCTAAA GCA AAA GAA GCT TCTAGT TAT[核苷酸628到651]和5′-ATTAGA TCTCAT TTA ATG ATTTTT AAA ATA TTT GGATA[核苷酸1118到1140](從L07944的ATG起始密碼子中的A起始計數)擴增F32 MSP3的C-端區；將所得DNA片段用BglII消化並克隆到BglII消化的pPSM1013中。除了MSP3中可變位置的下列殘基735(T→C)和948(A→G)外，該MSP3區和FC27等位基因(登錄號L07944)的相同。
pKBR10.用BamHI和SalI消化質粒pKBR9，並將MSP3插入片段克隆到BamHI-SalI消化的pAMJ328中。
pKBR11.將pKBR9的BglII片段克隆到用BglII部分消化的pKBR5中，產生glurp79-1500和MSP3628-1140之間的框內融合。除了在GLURP中可變位置上的下列殘基Leu-50、Asn-53、Glu-65、Asp-129、Glu-224、Pro-500外，該雜合分子相應於F32等位基因。
發酵.於30℃在2L發酵罐中發酵含有質粒pKBR8(GLURP)、pKBR10(MSP3)或pKBR11(GLURP-MSP3雜合物)的乳酸乳球菌MG1363，發酵培養基為補加紅黴素(1μg/ml)、酵母提取物(0.5％)和葡萄糖(1.5％)的1L3×SAIV-培養基。將培養基的起始pH調節到7.4。由於乳酸乳球菌MG1363在生長期間產生乳酸，所以隨著細胞密度增加，pH降低。生長約3小時後，pH降低到6，通過對2M KOH進行pH控制的加入，將該pH水平再保持8小時，直到細胞密度接近OD600＝8。將50％葡萄糖溶液與該鹼平行加入，因為這傾向於增加細菌產率。通過用Pellicon 2 Durapore濾器(PVDF，0.22μm，0.1m2)(Millipore)超濾，從培養基上清液(含有輸出的蛋白質)中除去細菌細胞。培養基上清液被立即使用或者保存在-20℃。
重組蛋白的純化.為重組GLURP、MSP3和雜合分子開發了純化策略。將無細胞的培養基上清液在安裝Pellicon XL Biomax 8濾器(聚丙烯膜，50000Da，50cm2)的Millipore LabscaleTMTFF系統上濃縮，並在Sephadex G-25柱(C26/40，170ml)上將濃縮物的緩衝液換成20mMBis-Tris(pH6.4)。重組蛋白首先在5ml HiTrap Q Sepharose HighPerformance(Phamacia Biotech)柱上純化，具體為應用柱緩衝液中的0到1M NaCl梯度，流速為1ml/min。合併含有目的重組蛋白的級分(2ml)並對20mM Bis-Tris(pH6.4)透析，並應用於5ml HiTrap SP SepharoseHigh Performance(Phamacia Biotech)柱上。通過柱緩衝液中的0到1MNaCl的梯度洗脫重組蛋白。GLURP和MSP3洗脫在單峰中而雜合物洗脫在兩個峰中。合併含有目的峰的級分(2ml)並調節到1M(NH4)2SO4，並在5ml苯基Sepharose High Performance(Phamacia Biotech)上進一步純化，純化具體為應用20mM Bis-Tris(pH6.4)中的1到0M(NH4)2SO4梯度，流速為1ml/min。通過SDS-PAGE實施所有級分的分析。通過BCATM蛋白質測定法(Pierce，Rockford，Illinois，USA)測量蛋白質濃度。
小鼠IgG的免疫和純化.將30隻BALBc/CFl BALBc/CFl小鼠(27)雌性小鼠(7到10周齡)隨機分成3組。通過在尾基部的皮下注射，用20μg GLURP25-500-MSP3212-380雜合物(gr7)或者15μg GLURP25-512與5μg MSP3212-380的混合物(gr8)分別免疫兩組小鼠，第三組(gr9)在尾基部接受15μg GLURP25-512注射和在肩部接受5μg MSP3212-380注射。所有免疫原都在Montanide中乳化並且每隻小鼠以兩周為間隔接受3次注射，並在第0、14、28和35天取血。通過(NH4)2SO4沉澱並隨後在DEAE-柱上純化，從合併的第35天採自組gr7、8和9動物的血清樣品和合併的第0天樣品純化總IgG。
ELISA和血清樣品.如以前詳細描述的(54)實施酶聯免疫吸附測定法(ELISA)。GLURP25-512、MSP3212-380、和GLURP27-500-MSP3212-380的包被濃度分別為0.5、1.0和0.5μg/ml。在用任一抗原包被的ELISA板上測試來自臨床瘧疾免疫的成年利比亞人、從未暴露於瘧疾的丹麥供體(51)和小鼠的血漿連續稀釋液，並以吸收值對血漿稀釋液作圖。為了比較不同血漿樣品中抗-雜合物抗體應答與相應的抗-GLURP及抗-MSP3抗體應答，以在曲線的平行部分中給出A492＝1000吸收值的血漿稀釋度定義抗體效價。
競爭性ELISA測定法.將重組GLURP25-518和MSP3212-380和這兩種抗原的混合物以各種濃度(3.2×10-5μg/ml到100μg/ml)加到來自用GLURP-MSP3雜合物免疫的小鼠的血漿池中，所述血漿稀釋於含1.25％(w/v)奶粉的PBS中。調節所用血漿稀釋液以得到約2500的吸收值(A492)。在4℃過夜孵育抗原-抗體混合物並隨後確定與用GLURP-MSP3雜合物包被的ELISA板的反應性。
間接免疫螢光抗體(IFA)測試.如以前的報導(5)實施IFA。簡言之，在溼室中，37℃下，將主要含有裂殖體階段的惡性瘧原蟲NF54的RBCs的薄膜與純化的小鼠IgG在磷酸緩衝鹽溶液(PBS pH7.4)中的連續稀釋液孵育30分鐘。用PBS洗滌後，用以1∶300在PBS中稀釋的綴合Alexa螢光色素的山羊抗-小鼠IgG(Molecular probe，USA)顯示小鼠抗體。將載玻片洗滌後在紫外光下檢查。終點效價是產生可見的特異免疫螢光的抗體最高稀釋度。
GLURP和GLURP-MSP3的RP-HPLC分析.使用蛋白質C4柱(VYDAC_，214TP54，USA)，在HPLC系統(Phamacia，瑞典)上分析樣品。在乙腈∶H2O∶TFA緩衝體系中實施分析。純化的樣品以1∶2在A-緩衝液(H2O+0.1％(w/v)TFA)中稀釋並應用於柱上，用0-80％ B-緩衝液(80％乙腈+0.1％(w/v)TFA)的線性梯度經20個柱體積進行洗脫。通過214nm處紫外吸收(UV-Abs)監視洗脫。收集峰並在HetoVac(Heto，丹麥)上真空乾燥並保持在4℃備用。
Maldi-Tof MS和ES-MS.從考馬斯染色的SDS-PAGE凝膠上切取用於肽質量作圖的樣品。基本如所描述的(44)，將條帶的一半(約1μg蛋白質)洗滌、乾燥、還原並用碘乙醯胺烷基化，之後通過修飾的胰蛋白酶(Promega，USA)過夜消化。將消化物的上清液應用於填裝Poros 20 R2反相柱材料(PerSeptive，USA)的GELoader tips(Eppendorff，德國)上並用0.8μlα-氰基羥基肉桂酸(於70％乙腈/30％水中20μg/μl)直接洗脫到MALDI靶上(28)。在以反射鏡模式運行的PerSeptive Voyager STR(PerSeptive，USA)上實施分析，並在GPMAW ver.5.02(Lighthouse data，丹麥)中分析結果。
對來自RP-HPLC的級分(約20μg蛋白質)實施完整蛋白的電噴射質譜。將樣品乾燥並重新溶解在5％甲酸中至20pmol/μl濃度，之後用鈉噴霧源在Micromass QTOF(Micromass，UK)上分析。
實施例2乳酸乳球菌中glurp和MSP3的表達並排地克隆編碼glurp79-1500和MSP3628-1140區的PCR片段，從而產生載體編碼的信號肽和GLURP25-500-MSP3212-380融合蛋白之間的框內融合(pKBR11，圖1)。該雜合物含有由連接這些glurp和MSP3片段而產生的兩個額外的胺基酸殘基。為了比較，也克隆單獨的glurp73-1542和MSP3628-1140片段(pKBR8和pKBR10，圖1)。如在「材料和方法」中描述的，將質粒轉化到乳酸乳球菌MG1363中並將所得菌株在發酵罐中生長。生長培養基的pH保持為6以實現從P170啟動子的最佳轉錄(33)。所有三種重組蛋白都被分泌到培養上清液中，通過依次進行HiTrap Q和SPSepharose柱上的離子交換，然後苯基Sepharose上的疏水相互作用層析，從上清液純化這些重組蛋白。隨後的SDS-PAGE表明質粒pKBR11(泳道1)、pKBR8(泳道2)、和pKBR10(泳道3)分別產生136、100和36kDa的主要產物(圖2A)。在純化的GLURP和MSP3製劑中觀察到額外的低分子量帶。當通過免疫印跡分析時，泳道2和3中的較小產物如同全長產物一樣，分別被針對GLURP和MSP3的抗體特異識別，表明它們可能來自mRNA的不完全翻譯和/或主要蛋白質產物的蛋白酶切割。泳道2中SDS-PAGE純化的條帶的MALDI MS胰蛋白酶肽圖證實該分子量較小的蛋白質來自GLURP25-514(數據未顯示)。如「材料和方法」中描述的通過HPLC評估GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514製劑的純度。GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514給出單一主峰(圖2B)。GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514的分子量分別為74950和56518Da(±20Da)，它們是通過ES MS確定的。假定兩種重組蛋白每種都含有連接到它們的N-末端的載體編碼的胺基酸殘基A-E-R-S(圖1)，那麼這些分子量可分別良好地吻合於所預測的值74939和56518。因此，GLURP27-500-MSP3212-380和GLURP25-514重組蛋白都是完整的並且含有所預測的胺基酸殘基。
實施例3乳酸乳球菌中產生的GLURP和MSP3的抗原性針對來自臨床瘧疾免疫的71名成年利比亞人的血漿評估重組蛋白的抗原性(圖3)。在用每種重組蛋白包被的單獨板上測試所有血漿樣品的連續稀釋液並將抗原-特異效價確定為給出1000的吸收值的稀釋度。如所預期的，不同血漿含有不同量的GLURP和MSP3-特異的IgG抗體(圖3A)。通常，雜合物-特異的抗體效價超過用單獨的GLURP25-514和MSP3抗原記錄的效價(圖3B和C)，從而表明雜合分子分別對GLURP和MSP3抗原決定簇提供了充分呈遞。
實施例4重組GLURP和MSP3產物的免疫原性為了確定GLURP-MSP3雜合分子與單獨的GLURP25-514和MSP3212-380分子的混合物相比是否是優越的免疫原，將BALBc/CF1小鼠組各用Montanide中的雜合物分子皮下免疫或者用在一個注射器中組合的GLURP25-514和MSP3212-380皮下免疫或者將GLURP25-514和MSP3212-380在不同部位分開注射進行皮下免疫。第三次注射後，測試第35天血清分別對GLURP和MSP3的IgG抗體反應性。儘管雜合物組中的平均GLURP-ELISA效價僅略高於其他兩組中的平均GLURP-ELISA效價，但是與在兩個不同部位接受MSP3212-380和GLURP25-514的組相比，接受雜合物的組的平均MSP3-ELISA效價高4.3倍(Kruskal Wallis檢驗，P＜0.004)(圖4A中比較gr7和gr9)。在個體水平，用雜合物免疫的小鼠與GLURP和MSP3結構域都強烈反應，而用兩種分子的組合免疫的小鼠傾向於發動主要針對GLURP或MSP3的抗體應答。抗-雜合物IgG抗體主要針對含有用於人抗體的公知表位的P3、P4、P11和S3肽(51)；然而也識別到不含有這些表位的肽P5和P9(圖4B)。儘管對於所有疫苗製劑，GLURP和MSP3-特異的IgG亞類譜都是相似的(圖4C)，但是GLURP-特異的IgG抗體傾向於使用κ輕鏈，而MSP3-特異的IgG抗體傾向於使用入輕鏈。不管是針對雜合物或者單獨分子的混合物而引起的GLURP或MSP3-特異性抗體都發現了輕鏈中的這種差異。
還通過競爭性ELISA分析了針對該雜合物的小鼠抗體的特異性(圖5)。似乎針對該雜合物的抗體是純粹GLURP和MSP3特異的，因為可溶的GLURP25-514和MSP3212-380的混合物可完全抑制抗-雜合物抗體與固定化GLURP25-500-MSP3212-380的結合。因此，GLURP-MSP3雜合分子的構建沒有在重疊區產生新的B-細胞表位。
實施例5小鼠抗-GLURP和抗-MSP3血清與天然GLURP和MSP3的反應性還通過寄生蟲來源的蛋白質與用三種重組蛋白——雜合物、GLURP25-514和MSP3212-380——分別免疫小鼠後得到的血清的免疫印跡，研究了重組GLURP和MSP3的免疫原性。如圖6中所表明的，來自用GLURP25-514、MSP3212-380和雜合物免疫的小鼠的血漿分別識別約220,000Da(泳道1)、48,000Da(泳道2)的多肽和兩者(泳道3)。
實施例6作為長合成肽產生的GLURP和MSP3之間的抗原競爭免疫原以長合成肽形式產生所用的MSP3和GLURP區MSP3(LR55)181-RKTKEYAEKA KNAYEKAKNA YQKANQAVLK AKEASSYDYILGWEFGGGVP EHKKEENMLS HLYVSSKDKE NISKENDDVL DEKEEEAEET EEEELE276andGLURP(LR67)85NVPSGL DIDDIPKESI FIQEDQEGQT HSELNPETSE HSKDLNNNGSKNESSDIISE NNKSNKVQNH FESLSDLELL ENSSQDNLDK DTISTEPFPNQKHKDLQQDL NDEPLEPFPT QIHKDYKEKN LIN-213免疫將20隻BALBc雌性小鼠(7到10周齡)隨機分成4組並用MSP3和GLURP的不同組合皮下注射免疫1.用5μg LR55免疫組110，2.用5μg LR67免疫組111，3.通過尾基部皮下注射5μg LR55+5μg LR67的混合物免疫組112，4.組113在尾基部接受5μg LR55注射並在肩部接受5μg LR67注射。
所有免疫原在Montanide ISA720中乳化並且每隻小鼠以2周間隔接受3次注射，並在第0、14、28和35天取血。
ELISA在分別以0.5μg/ml LR55或LR67包被的ELISA板上測試第35天血漿樣品的連續稀釋液，並對血漿稀釋液作吸收值圖。抗體效價定義為在曲線的平行部分中給出A492＝1.00的吸收值的血漿稀釋度。
結果為了確定是否可以得到針對產生的長合成肽MSP3和GLURP的混合物的平衡免疫應答，四組BALBc小鼠各用1)LR55(gr110)、2)LR67(gr111)、3)在一個注射器中組合的LR55和LR67(gr112)或4)在不同部位分開注射的LR55和LR67(gr113)皮下免疫。測試第一次注射後35天收集的血清分別對GLURP和MSP3的IgG抗體反應性。僅用LR55或LR67免疫的小鼠分別與LR55或LR67強烈反應(圖7(a)和7(b))。同樣的，用兩種分子在不同部位注射免疫的小鼠與GLURP和MSP3結構域都強烈反應(圖7(d))，而用在一個注射器中施用的兩種分子的組合進行免疫的小鼠僅針對LR55反應(圖7(c))。
該結果強烈支持如下觀點單獨的GLURP和MSP3產物的混合物不可能在單一疫苗製劑中施用而不出現GLURP和MSP3之間的抗原競爭。
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625 630 635 640Val Glu Glu Leu Ser Lys Tyr Phe Lys Asn His645 65021022111953212DNA213惡性瘧原蟲4002gccgaaagat ctacaagtga gaatagaaat aaacgaatcg ggggtcctaa attaaggggt 60aatgttacaa gtaatataaa gctgccatca aataacaaag gtaaaattat aagaggttcg 120aatgatgaac ttaataaaaa ctctgaagat gttttagaac aaagcgaaaa atcgcttgtt 180tcagaaaatg ttcctagtgg attagatata gatgatatcc ctaaagaatc tatttttatt 240caagaagatc aagaaggtca aactcattct gaattaaatc ctgaaacatc agaacatagt 300aaagatttaa ataataatga ttcaaaaaat gaatctagtg atattatttc agaaaataat 360aaatcaaata aagtacaaaa tcattttgaa tcattatcag atttagaatt acttgaaaat 420tcctcacaag ataatttaga caaagataca atttcaacag aaccttttcc taatcaaaaa 480cataaagact tacaacaaga tttaaatgat gaacctttag aaccctttcc tacacaaata 540cataaagatt ataaagaaaa aaatttaata aatgaagaag attcagaacc atttcccaga 600caagagcata aaaaggtaga caatcataat gaagaaaaaa acgtatttca tgaaaatggt 660tctgcaaatg gtaatcaagg aagtttgaaa cttaaatcat tcgatgaaca tttaaaagat 720gaaaaaatag aaaatgaacc acttgttcat gaaaatttat ccataccaaa tgatccaata 780gaacaaatat taaatcaacc tgaacaagaa acaaatatcc aggaacaatt gtataatgaa 840aaacaaaatg ttgaagaaaa acaaaattct caaatacctt cgttagattt aaaagaacca 900acaaatgaag atattttacc aaatcataat ccattagaaa atataaaaca aagtgaatca 960gaaataaatc atgtacaaga tcatgcgcta ccaaaagaga atataataga caaacttgat1020aatcaaaaag aacacatcga tcaatcacaa cataatataa atgtattaca agaaaataac1080ataaacaatc accaattaga acctcaagag aaacctaata ttgaatcgtt tgaacctaaa1140aatatagatt cagaaattat tcttcctgaa aatgttgaaa cagaagaaat aatagatgat1200gtgccttccc ctaaacattc taaccatgaa acatttgaag aagaaacaag tgaatctgaa1260catgaagaag ccgtatctga aaaaaatgcc cacgaaactg tcgaacatga agaaactgtg1320tctcaagaaa gcaatcctga aaaagctgat aatgatggaa atgtatctca aaacagcaac1380
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1.基於抗原的瘧疾疫苗，該疫苗含有融合蛋白或者所述融合蛋白的同系物，其中所述融合蛋白衍生自與至少一種其它惡性瘧原蟲來源的蛋白質遺傳偶聯的惡性瘧原蟲富穀氨酸蛋白質(GLUPR)。
2.根據權利要求1的基於抗原的瘧疾疫苗，其中遺傳偶聯到GLURP上的蛋白質來自惡性瘧原蟲的裂殖子表面蛋白質3(MSP3)。
3.根據權利要求2的疫苗，其含有SEQ ID NO 1。
4.根據權利要求2或3的疫苗，其還含有來自惡性瘧原蟲的蛋白質的免疫原性片段。
5.含有SEQ ID NO.1的融合蛋白或者其同系物。
6.根據權利要求5的融合蛋白，其還含有來自惡性瘧原蟲的一種或多種蛋白質的一種或多種免疫原性片段。
7.根據權利要求6的融合蛋白，其中免疫原性片段選自CS、MSP1、MSP2、MSP4、MSP5、MSP6、AMA1、Pf155/RESA、RAP1、EBA-175、pfEMP1、EXP1、LSA1、LSA3、Pf25、Pf45/48、Pf230、Pf27、Pf16、或Pf28。
8.從重組乳球菌屬種中製備根據權利要求5-7的融合蛋白。
9.含有SEQ ID NO.2的核酸或者其同系物。
10.編碼根據權利要求6或7的融合蛋白的核酸。
11.根據權利要求9或10的核酸在製備疫苗中的用途。
12.含有表達根據權利要求9或10的核酸序列的重組BCG的疫苗。
全文摘要
衍生自遺傳偶聯到惡性瘧原蟲裂殖子表面蛋白3(MSP3)上的惡性瘧原蟲富穀氨酸蛋白質(GLURP)的融合蛋白，以分泌的重組GLURP－MSP3雜合蛋白形式在乳酸乳球菌中產生，實驗表明雜合物的GLURP－部分增加了總體的抗體應答。用雜合蛋白免疫一貫地比在一個部位注射兩種重組分子的混和物或在兩個不同部位同時注射單獨的重組分子產生更強的針對單獨的GLURP和MSP3域的抗體應答。該差異在MSP3－特異的抗體應答中最明顯，表明位於GLURP RO－區中的T細胞表位為MSP3區中的B－細胞表位提供了幫助。此外，當用GLURP和MSP3的混合物注射動物時，小鼠個體傾向於產生針對分子之一的優勢抗體應答在一些動物中，GLURP是免疫優勢的，而在其他動物中MSP3是優勢免疫原。此外，雜合物也比各單獨的重組蛋白更具抗原性，因為在臨床免疫的非洲成年人中針對雜合蛋白的天然IgG抗體的ELISA效價高於針對各單獨的重組蛋白的效價。還證明該雜合蛋白是潛在的保護性抗原，因為小鼠抗－GLURP－MSP3 IgG抗體能夠以單核細胞依賴的方式體外抑制寄生蟲生長。
文檔編號A61P33/00GK1741815SQ200380103154
公開日2006年3月1日 申請日期2003年11月6日 優先權日2002年11月12日
發明者M·泰森, S·耶普森 申請人:國立血清研究院