一種海膽致病菌強壯弧菌的檢測方法與流程

2023-09-10 11:43:20 1

本發明涉及一種海膽致病菌強壯弧菌的檢測方法。
背景技術：
：隨著海膽養殖業的發展及養殖環境的汙染，海膽養殖業面臨著嚴重的病害威脅。其中，強壯弧菌是引起海膽細菌性疾病的一種重要致病菌。對於海產品病原菌檢測及鑑定的現階段大多數都停留在微生物學檢驗水平上，但其存在培養周期長，操作繁瑣，特異性差等缺點；並且自然環境可供培養的微生物僅有不到1％，給檢測帶來了一定的困難。而細菌檢測基因晶片多採用細菌學上較保守的基因，如16srrna基因，但由於其信息位點較少，因此構建的系統穩定性較差，用於鑑定親緣關係較接近的細菌，容易產生偏差，引起假陽性，影響檢測結果的準確性。技術實現要素：本發明要解決的技術問題是提供一種海膽致病菌強壯弧菌的檢測方法，該檢測方法可以快速、準確鑑定海膽致病菌強壯弧菌，並且具有靈敏度高的特點。本發明的技術解決方案是：一種海膽致病菌強壯弧菌的檢測方法，其具體步驟是：(1)基因晶片的製作用於檢測的三組探針vf2、vf3和vf4，探針序列如下：vf2(5』-3』)：cgttatcaacttgcgatgctgtaggggtg；vf3(5』-3』)：cttagctgcctaacttcttgagaacgaaccg；vf4(5』-3』)：ggtgtcgttaatagcggcatctcttga；將vf2、vf3和vf4探針在5』端加上15個t的間隔臂，並在探針5』端進行氨基修飾；用雙蒸水將經氨基修飾的探針稀釋成100μmol/l的母液，再用點樣緩衝液稀釋至濃度20μmol/l；使用點樣儀在醛基化基片上進行非接觸式點樣，然後將點樣後的晶片放到盛有探針固定增效劑的可密閉的敞口容器內，密閉後靜置於30℃烘箱過夜，得到用於檢測海膽致病菌強壯弧菌的基因晶片；(2)待測樣品dna提取將環境中的水樣、泥樣或生物樣品進行取樣，然後提取待測樣品的dan，備用；(3)樣品pcr擴增用於檢測強壯弧菌(vibriofortis)引物是：vf2和vf3探針使用的引物基因序列如下：上遊引物：ctttactcgcgtaaccttga；下遊引物：ccatcgtagccctttctgt；vf4探針使用的引物基因序列如下：上遊引物：ctggaactgagacacggtcc；下遊引物：ggagttagccggtgcttctt；將步驟(2)提取的樣品的dna作為擴增模板，分別以探針對應的引物進行pcr擴增，得到pcr擴增產物；(4)pcr擴增產物與晶片雜交將pcr擴增產物進行螢光標記，將基因晶片進行預雜交，然後，將經螢光標記後的pcr擴增產物與經預雜交的基因晶片進行雜交，離心乾燥後，放於微陣列晶片掃描儀上檢測，收集檢測結果，在探針點樣位置具有特異性信號，判定為陽性，在探針點樣位置未出現特異性信號，為陰性。進一步的，步驟(3)進行pcr擴增時，首先在95℃預變性5min；然後95℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環；最後72℃延伸10min。進一步的，預雜交時，使用鮭精dna用預雜交緩衝液稀釋後進行預雜交。進一步的，預雜交緩衝液與鮭精dna的體積比為10:1。本發明的有益效果：以membraneprotein為靶基因設計特異性探針，通過基因晶片技術檢測強壯弧菌，具有快速、靈敏、準確性高、重複性強的特點，該方法能快速高效檢測海膽致病菌強壯弧菌，並且特異性高和敏感性強，提高了鑑定海膽養殖區環境及生物體致病菌強壯弧菌的能力，避免了檢測過程中假陰性的發生。附圖說明圖1為強壯弧菌vf2和vf3特異性探針基因晶片驗證結果圖；圖2為強壯弧菌vf4特異性探針基因晶片驗證結果圖；圖3為強壯弧菌vf2和vf3特異性探針基因晶片的檢測結果；圖4為副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、燦爛弧菌用vf4特異性探針基因晶片的檢測結果；圖5為強壯弧菌vf4特異性探針基因晶片的檢測結果。具體實施方式實施例1探針的設計及合成1、目標檢測菌種及靶基因本發明選擇海膽養殖區環境及生物體中重要的常見致病菌強壯弧菌作為檢測對象，使用membraneprotein為靶基因；2、探針設計本發明採用18-30bp的寡核苷酸探針。探針參數基本要求是特異性和高效性的雜交，應滿足以下條件：①探針tm值保持相近，在上下10℃範圍內浮動；②形成二聚體和髮夾結構的連續互補鹼基數少於4個；③探針與非目標基因序列的連續匹配鹼基數少於7個鹼基；④探針與目標基因的錯配鹼基數少於4個鹼基。本發明針對海膽致病菌強壯弧菌共設計3條探針，如表1所示：表1探針信息表3、探針合成將表1的探針在5』端加上15個t的間隔臂，以減少dna雜交時的空間位阻，提高雜交效率。同時在探針5』端進行氨基修飾，以備下一步與玻璃片上的醛基交聯，將探針固定在玻片上。如表2所示：表2實施例2基因晶片的製作利用實施例1設計的探針製備用於海膽養殖區環境及生物體中重要的常見致病菌強壯弧菌，具體步驟如下：1、探針母液的配製用雙蒸水將合成的探針(表2)稀釋成100μmol/l的母液，再用點樣緩衝液稀釋至濃度20μmol/l；2、點樣前的準備取100μl移至96孔板的a1、b1、c1孔，在d1孔加入100μl點樣緩衝液；3、點樣用美國bio-dot公司的ad1500基因晶片點樣儀按照預先設定好的程序在醛基化基片上進行非接觸式點樣；每點點樣量為0.5μl，點直徑為200μm，點心間距為1.5mm，點樣時環境相對溼度55-65％，溫度23℃；4、基因晶片的製備將表2中經合成的檢測探針以點陣形式分布在醛基基片上，每條探針重複3次；5、點樣後的處理將點完樣的晶片放到盛有探針固定增效劑的可密閉的敞口容器內，密閉後靜置於30℃烘箱過夜，得到用於檢測海膽致病菌強壯弧菌的基因晶片。實施例3用於檢測海膽養殖區環境及生物體中重要的常見致病菌強壯弧菌基因晶片(實施例2製備的)的使用方法，具體步驟如下：1、待測樣品採集及處理將獲得的水樣用8μm無菌濾膜除去雜質，之後用0.22μm的濾膜過濾並收集濾膜，用無菌鋁箔包裹，-20℃下保存；泥樣取自養殖環境底部2-5cm處底泥100g，採集樣品於冰盒中運送至實驗室；海膽(動物樣品)用無菌剪刀剪取，無菌水衝洗3次，裝入凍存管，放入液氮保存。2、模板dna製備水樣和泥樣dna分別用omega水樣dna提取試劑盒(omegawaterdnakit,d5525)和土壤dna提取試劑盒(omegasoildnakit,d5625)提取，海膽樣品致病菌dna用天根細菌基因組試劑盒提取。3、引物和探針的設計從強壯弧菌致病弧菌相應基因序列以及部分相鄰菌種的上述基因的序列，進行多基因序列比對，對每種致病菌引物進行設計，從而建立了由3條寡核苷酸探針和2對引物組成的檢測海膽養殖區環境及生物體中重要的常見致病菌強壯弧菌基因晶片。表3強壯弧菌的靶基因的擴增引物4、pcr擴增(1)pcr反應體系將表4中所示試劑分別加入pcr管中，震蕩混勻，瞬時離心。表4pcr反應體系試劑體積(μl)mix12.5上遊引物(20μmol/l)0.2下遊引物(20μmol/l)1模板dna1ddh2o10.3(2)pcr反應條件將提取的dna作為pcr擴增模板，分別以對應的引物和pcr擴增條件進行反應，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測、觀察pcr擴增效果。表5pcr反應條件5、螢光標記pcr產物(1)取各模板pcr合併後的產物8μl於無菌的0.2ml離心管中，作為模板；(2)向每個樣品管中加入雜交緩衝液8μl和1μl，震蕩混勻，瞬時離心(3)將離心後的樣品管放入pcr儀，99℃變性3min，立即冰浴3min，瞬時離心，然後，進行下一步晶片雜交。6、雜交(1)晶片預雜交①將預雜交緩衝液在50℃預熱；②預雜交緩衝液與鮭精dna按照體積比10:1的比例混合，置於pcr儀上99℃變性5min，立即冰浴3min，然後用移液器加到晶片的點樣區，用適當大小的原位雜交專用蓋玻片覆蓋點樣區；③將晶片放入溼盒，置於水浴鍋，65℃，1h；預雜交結束後，用ddh2o衝洗，後離心乾燥。(2)樣品與晶片雜交①將晶片正面朝上，平放於桌面，將晶片圍欄貼於各點樣區之間，放上晶片蓋片(有凸臺的一面朝向晶片)，上端先接觸晶片，再緩緩蓋下；②用移液器通過蓋玻片加樣孔緩慢注入16μl螢光標記後的樣品，樣品會憑藉液體表面張力在蓋玻片下面的凹臺和晶片表面之間形成一道液膜；(注意：不要震動蓋片或晶片，以免破壞液膜。)③將晶片放入溼盒，置於水浴鍋，65℃，2h，避光；④雜交完畢的晶片依次用洗液a(1×ssc，0.2％sds)、洗液b(0.2×ssc)、洗液c(0.1×ssc)在振蕩培養箱中150r/min各洗15min。7、掃描晶片晶片洗滌完畢後，離心乾燥，放於微陣列晶片掃描儀上檢測，電腦收集數據。8、結果判定一個有效的雜交結果要符合二點要求：(1)空白點的信號平均值，即背景平均值要小於10；(2)質控點信號的平均值要高於背景平均值10倍以上。陽性雜交信號還要符合：(1)陽性點的信號平均值要高於背景平均值10倍以上；(2)陽性點與質控點的平均值比值要在0.4以上。非特異性信號的判定標準為：(1)陽性點與質控點的平均值比值要小於0.35；(2)非特異性點的信號平均值要小於8倍的背景平均信號值。實施例4將實施例2製備得到的用於檢測海膽致病菌強壯弧菌的基因晶片的特異性效果驗證將vf2和vf3探針以點陣形式分布在醛基基片上，每條探針重複3次，做成基因晶片。將海膽致病菌強壯弧菌實驗菌株靶基因的擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格後再進行雜交顯色，用於基因晶片特異性驗證。驗證結果如圖1所示。將vf4探針以點陣形式分布在醛基基片上，每條探針重複3次，做成基因晶片。將實驗海膽致病菌強壯弧菌菌株靶基因的擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格後再進行雜交顯色，用於基因晶片特異性驗證。驗證結果如圖2所示。這3條探針都能特異性結合海膽致病菌強壯弧菌的靶基因，無非特異性雜交信號。因此，所有自主設計的探針具有高度的特異性。實施例5將實施例2製備得到的用於檢測海膽養殖區環境及生物體中重要的致病菌強壯弧菌的基因晶片的具體應用效果檢測採用模式菌株：強壯弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、燦爛弧菌用vf2和vf3探針製作的基因晶片利用發明方法進行檢測；其中，強壯弧菌的檢測結果如圖3所示，在相應vf2和vf3探針的點樣位置，有特異性信號；而以副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、燦爛弧菌用本發明的探針進行檢測，均沒有特異性信號，其檢測結果如圖4所示。採用模式菌株：強壯弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、燦爛弧菌用vf4探針製作的基因晶片利用本發明方法進行檢測；其中，強壯弧菌的檢測結果如圖5所示，在相應探針的點樣位置，有特異性信號；而以副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創傷弧菌、燦爛弧菌用本發明的探針進行檢測，均沒有特異性信號，其檢測結果與圖4相同，未出現特異性信號。從海膽養殖池的隨機選取海膽樣品用無菌剪刀剪取，無菌水衝洗3次，然後用天根細菌基因組試劑盒提取海膽致病菌dna，用vf2和vf3探針製作的基因晶片利用本發明方法進行檢測，在基因晶片的相應vf2和vf3探針點樣位置，具有特異性信號(其檢測結果與圖3相同)，該樣品海膽致病菌強壯弧菌呈陽性。將本發明的基因晶片對海膽致病菌強壯弧菌進行靈敏度評價，將海膽致病菌強壯弧菌進行梯度稀釋，基因晶片檢測下限為650拷貝的基因組dna，檢測靈敏度和pcr相當。從預養殖海膽的養殖池內將獲得的水樣用8μm無菌濾膜除去雜質，之後用0.22μm的濾膜過濾並收集濾膜，用無菌鋁箔包裹，-20℃下保存；泥樣取自養殖環境底部2-5cm處底泥100g，採集樣品於冰盒中運送至實驗室；水樣和泥樣dna分別用omega水樣dna提取試劑盒(omegawaterdnakit,d5525)和土壤dna提取試劑盒(omegasoildnakit,d5625)提取，將水樣和泥樣中提取的dna用vf4探針製作的基因晶片利用本發明方法進行檢測，在基因晶片的相應vf4探針點樣位置，具有特異性信號(其檢測結果與圖5相同)，該樣品養殖區海膽致病菌強壯弧菌呈陽性。以上僅為本發明的具體實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。sequencelisting大連海洋大學一種海膽致病菌強壯弧菌的檢測方法7patentinversion3.5129dna人工序列1cgttatcaacttgcgatgctgtaggggtg29231dna人工序列2cttagctgcctaacttcttgagaacgaaccg31327dna人工序列3ggtgtcgttaatagcggcatctcttga27420dna人工序列4ctttactcgcgtaaccttga20519dna人工序列5ccatcgtagccctttctgt19620dna人工序列6ctggaactgagacacggtcc20720dna人工序列7ggagttagccggtgcttctt20當前第1頁12