一種從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法
2023-09-11 05:06:50
專利名稱：一種從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法
技術領域：
本發明涉及以植物為原料提取製備有效成分的方法，具體涉及從杜仲葉中分離純 化綠原酸的方法。背景技術：
杜仲(Eucommia ulmoides Oliver)，古稱「曼榆」，又名「木棉」，屬杜仲科落葉喬 木，為我國特有的經濟樹種，已有2000多年的栽培歷史，產地分布全國，總量佔世界90% 以上。杜仲植物的乾燥樹皮具有補肝腎、強筋骨、降血壓、抗腫瘤、抗菌等諸多功效，但杜仲 皮一般需生長15 20年，周期長、資源相對緊缺且昂貴。杜仲葉的資源相對豐富、易得， 全國約有杜仲林觀萬公頃，每年可產落葉達400萬噸，而其利用率僅佔可採集葉的10% 20%，這些豐富的杜仲葉資源一直被人們所忽視。近年來大量研究表明杜仲葉中綠原酸等 黃酮類物質含量豐富，其主要化學成分與杜仲皮的化學成分基本一致，有一定的互補性，因 此利用杜仲葉提取具有多種藥理活性物質，充分利用我國的植物資源具有重要的經濟意義 和現實意義。
綠原酸為咖啡酸奎尼酸衍生物，具有利膽、抗菌、抗病毒、減壓、增高白血球及調節 中樞神經系統等多種藥理作用，作為重要原料廣泛用於保健品，藥品、化妝品等工業。綠原 酸多從植物中提取獲得，目前國內外主要從生咖啡豆和金銀花中提取綠原酸。杜仲葉中綠 原酸含量為 5.5%，該含量在植物葉子中屬於較高者，因此從杜仲葉中分離提取綠原 酸具有廣闊的開發前景。
微波是利用分子極化或離子導電效應而直接對物質進行加熱的一種處理技術，因 此微波輔助提取有效成分，能對不同組分進行選擇性加熱，使目標組分更容易從提取物中 分離出來，且熱效率高，能有效地提高提取效率。因此，微波輔助提取在原有單純溶劑提取 的基礎上，可以有效地提高目標物的分離提取率，是物質分離提取中一種有效的輔助手段。
高速逆流色譜技術(High-Speed Counter-current Chroma-tography, HSCCC)是 當前國際上較新型無固體載體的液-液分配技術。HSCCC依靠纏繞在自傳軸上的聚四氟乙 烯(PTFE)蛇形管在共轉軸上進行特殊的同步行星式運動模式而產生的離心場作用，使互 不相溶的兩液體相的其中一相因離心力保留在柱中，另一相作為流動相，並使流動相單向、 低速通過固定相，在短時間內實現樣品在互不相溶的兩相溶劑系統中高速分配，繼而達到 連續逆流萃取分離目的，被分離的各組分依據其在兩相中分配係數的差異得到分離。HSCCC 因其無固體支持物作固定相，所以避免了固體支持物或載體帶來的樣品吸附、變性、損失、 汙染、峰形拖尾等缺點，對顆粒或沉澱物質進行分離而不會造成色譜柱的堵塞；同時具有預 處理簡單，可直接進樣粗製樣品或合成混合物，且分離純化製備可同步完成，洗脫組分可達 到相當高的純度，組分回收簡單等優點。
目前，專利CN1400199A公開了一種從杜仲葉中連續提取活性物質的方法，該法 以水、甲醇或乙醇為提取劑，通過大孔樹脂分離、乙酸乙酯萃取和混合溶劑重結晶等工序 提取綠原酸和杜仲總黃酮。該方法使用的是非極性樹脂，對綠原酸的吸附率不高；採取的乙酸乙酯萃取、乙酸乙酯-氯仿重結晶，操作麻煩、溶劑複雜、母液回收設備要求高。專利 CN1687435A公開了一種高純度綠原酸工業化生產工藝，主要步驟為原料經石油醚預處理、 生物複合酶提取、提取液調酸、乙酸乙酯萃取、鹼中和萃取液後水相酸沉、沉澱重結晶。專利 CN1273964A公開了一種杜仲葉製備綠原酸工藝，主要步驟如下超聲預處理、高溫提取、超 濾、乙酸乙酯萃取、D-140樹脂分離等。目前已公開的相關杜仲葉中有效成分的分離製備專 禾IJ，幾乎都是涉及溶劑反覆萃取、大孔樹脂或矽膠柱分離、重溶與結晶等，存在操作複雜繁 瑣、周期長、所用溶劑複雜、組分的回收率不高等缺陷。隨著市場上對綠原酸的需求不斷上漲，如何利用簡便、快速的先進技術與設備從 杜仲葉中得到質量穩定、純度高、溶劑回收率較高的綠原酸將成為研究的熱點，針對該類提 取方法的研究十分必要。
發明內容
本發明的目的是提供一種從杜仲葉中分離提取綠原酸的方法，該方法克服了溶劑 提取杜仲葉中綠原酸的提取率低、分離純化效果差、目標組分回收率低及純度不高等缺陷。本發明採用的技術方案如下一種從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，所述方法按照以下步驟進行以杜仲 植物葉為原料，以體積分數為20% 80%的強極性有機溶劑水溶液為提取劑，在功率為 300 800W的微波輔助下，40 70°C浸提15 40min，將提取液過濾，乾燥，製得杜仲葉黃 酮粗品，所述原料與提取劑的料液比為Ig 10 50mL;所述的杜仲葉黃酮粗品再以高速 逆流色譜分離純化以體積比為3 4 1 4 5的乙酸乙酯/正丁醇/水作為溶劑體 系，上相為固定相，下相為流動相，流速為1 2mL/min，在800 900r/min的轉速下，25 350C，高速逆流色譜分離純化200min，紫外254nm檢測收集液的吸收峰，根據逆流色譜出峰 時間在86 142min之間的收集液作為目標組分，再將目標組分45 60°C真空旋轉蒸發乾 燥，得綠原酸。所述的原料為落葉前採摘的杜仲葉陰乾後，碾碎成杜仲葉粉末，通常碾成過80目 篩的粉末。所述強極性有機溶劑為乙醇、丙酮或甲醇，優選為丙酮。所述有機溶劑水溶液中有機溶劑體積分數為40% 60%，更優選為50%。所述原料與提取劑的料液比優選為Ig 16 40mL，更優選為Ig 30mL。所述的微波輔助提取溫度優選為45 60°C，更優選為50 60°C。所述的微波功率優選為400 700W，更優選為600W。所述的微波輔助浸提時間優選為20 35min，更優選為25min。所述的高速逆流色譜分離純化流速優選為1. 5 2. OmL/min,更優選為1. 8 2. OmL/min。所述的高速逆流色譜分離純化轉速優選為850 900r/min，更優選為900r/min。與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在本發明採用微波輔助提取及高速逆流色譜分離純化相結合的方法從杜仲葉中分 離純化綠原酸，該方法具有操作步驟簡單、設備種類單一、生產周期短、產物純度高等優點， 克服了採用樹脂柱、矽膠柱等分離方法的分離效果不明顯、目標組分難回收、提取率低等缺陷，具有廣泛的應用價值及良好的社會經濟效益。
圖1為實施例1所得杜仲葉黃酮粗品在254nm下的高速逆流色譜分離圖2、3分別為實施例1所得杜仲葉黃酮粗品在254nm、350nm下的HPLC譜圖4為對比例1中單純丙酮浸提所得杜仲葉黃酮粗品在350nm下的HPLC譜圖5為對比例1中單純甲醇浸提所得杜仲葉黃酮粗品在350nm處的HPLC譜圖6為對比例1中單純乙醇浸提所得杜仲葉黃酮粗品在350nm處的HPLC譜圖7、8分別為實施例10和實施例11高速逆流色譜分離所得綠原酸樣品在350nm 處的HPLC譜圖9為實施例10所得綠原酸樣品與綠原酸標品的薄層色譜對照圖，A點為綠原酸 樣品點，B點為綠原酸標品點；
圖10為實施例11所得綠原酸樣品與綠原酸標品的紫外光譜對照圖11為實施例11所得綠原酸樣品的電噴霧電離源-質譜圖；
圖12為實施例12所得綠原酸樣品的1HNMR譜圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此
實施例1
準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品30. Og,以900mL 50%的丙酮水溶液為提取 劑，按照料液比(g/mL)為1 30投料，50°C下提取25min，微波功率為600W。提取結束後 真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，得3. 8432g乾燥物，即為杜仲葉黃酮粗品，得率為12. 81%。
實施例2
準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品5. 0g，以80mL 50%的丙酮水溶液為提取 劑，按照料液比(g/mL)為1 16投料，微波功率400W，40°C下浸提20min，提取結束後真空 抽濾，濾液經旋轉蒸發乾燥，得5. 7452g乾燥物，即為杜仲葉黃酮粗品，得率為11. 49%。
實施例3
準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品5. Og,以IOOmL 50%的丙酮水溶液為提取 劑，按照料液比(g/mL)為1 20投料，50°C下提取30min，微波功率為500W。提取結束後 真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲葉黃酮粗品0. 6270g，得率為12. M%。
實施例4
準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品5.0g，以200mL 50%的丙酮水溶液為提取 劑，按照料液比(g/mL)為1 40投料，60°C下提取35min，微波功率為700W。提取結束後 真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲葉黃酮粗品0. 6464g，得率為12. 93%。
實施例5
準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品5. Og,以50mL 60 %的丙酮水溶液為提取 劑，按照料液比(g/mL)為1 10投料，70°C下提取35min，微波功率為300W。提取結束後 真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲葉黃酮粗品0. 4088g，得率為8. 19%。5
實施例6準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品5.0g，以250mL 20%的丙酮水溶液為提取 齊U，按照料液比(g/mL)為1 50投料，70°C提取40min，微波功率為800W。提取結束後真 空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲葉黃酮粗品0. 6014g，得率為12. 03%。實施例7準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品5. Og,以IOOmL 40%的丙酮水溶液為提取 齊U，按照料液比(g/mL)為1 20投料，45°C下提取25min，微波功率為700W。提取結束後 真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲葉黃酮粗品0. 5009g，得率為10. 02%。實施例8準確稱取過80目篩的杜仲葉粉末樣品5. Og,以150mL 80%的丙酮水溶液為提取 齊U，按照料液比(g/mL)為1 30投料，40°C下提取15min，微波功率為600W。提取結束後 真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲葉黃酮粗品0. 6346g，得率為12. 69%。實施例9 =HPLC檢測HPLC 檢測的分離柱採用 Symmetry shield RP18 (4. 6 X 250mm, 5 μ m)；柱溫為 35°C ；流動相A為甲醇，B為0. 5%的磷酸水溶液，線性梯度洗脫程序0-10min =A = 30%, 10-30min :A 30 % -50 %, 30-40min :A = 50 % -60 %, 40-50min :Α = 60 % -30 % ；流速 0. 6mL/min ；樣品均採用全自動進樣，進樣量為10 μ L ；200nm-400nm紫外全波長掃描檢測。準確稱取1. 005g實施例1製得的杜仲葉黃酮粗品，用進口色譜級甲醇溶解並定溶 至IOOmL,在254nm和350nm對其進行HPLC分析，結果如圖2和圖3所示。從圖2、3中可以看出杜仲葉的丙酮水提物有3個主要組分，且組分1的含量較 大。實施例10 高速逆流色譜分離純化及純度檢測準確稱取實施例1製得的杜仲葉黃酮粗品424. 7mg,溶於20mL上下相混合溶液 (上、下相溶液各IOmL)中，進行高速逆流色譜分離純化(HSCCC)。高速逆流色譜條件為乙 酸乙酯-正丁醇-水(3 1 4)作為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相；轉速900r/ min ；溫度30°C ；流速2mL/min，分離時間為200min ；在254nm處紫外檢測，收集出峰時間在 98 104min的流出液，如圖1中黑色部分所示，旋轉蒸發至幹，得綠原酸樣品28. 9mg。將 該樣品溶於進口色譜級甲醇，在350nm處進行HPLC分析，純度為98. 7%，結果如圖7所示。實施例11高速逆流色譜分離純化及純度檢測準確稱取實施例1製得的杜仲葉黃酮粗品407. 3mg,溶於20mL上下相混合溶液 (上、下相溶液各IOmL)中，進行高速逆流色譜分離純化。高速逆流色譜條件為乙酸乙 酯-正丁醇-水(4 1 5)作為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相；轉速850r/min; 溫度30°C ；流速1. 5mL/min，分離時間為200min ；紫外254nm檢測，收集出峰時間在101 107min的流出液，旋轉蒸發至幹，得綠原酸樣品27. 7mg，將該樣品溶於進口色譜級甲醇，在 350nm處進行HPLC分析，純度為98. 3%，結果如圖8所示。實施例12高速逆流色譜分離純化及純度檢測 準確稱取實施例1製得的杜仲葉黃酮粗品453. 4mg,溶於20mL上下相混合溶液 (上、下相溶液各IOmL)中，進行高速逆流色譜分離純化。高速逆流色譜條件為乙酸乙 酯-正丁醇-水(4 1 5)作為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相；轉速900r/min;溫度35°C ；流速1. 8mL/min,分離時間為200min ；紫外2Mnm檢測，收集出峰時間在86 97min的流出液，旋轉蒸發至幹，得綠原酸樣品29. %ig，將該樣品溶於進口色譜級甲醇，在 350nm處進行HPLC分析，純度為98. 0%。
實施例13高速逆流色譜分離純化及純度檢測
準確稱取實施例1製得的杜仲葉黃酮粗品442. 8mg,溶於20mL上下相混合溶液 (上、下相溶液各IOmL)中，進行高速逆流色譜分離純化。高速逆流色譜條件為乙酸乙 酯-正丁醇-水(3 1 4)作為溶劑體系，上相為固定相，下相為流動相；轉速800r/min; 溫度25V ；流速1. OmL/min,分離時間為200min ；紫外254nm檢測，收集出峰時間在128 142min的流出液，旋轉蒸發至幹，得綠原酸樣品28. ang，將該樣品溶於進口色譜級甲醇，在 350nm處進行HPLC分析，純度為97. 9%。
實施例14 綠原酸樣品的定性分析
將實施例10所得綠原酸樣品以三氯化鋁乙醇溶液為顯色劑，與綠原酸標品進行 薄層層析色譜分析，A點為綠原酸樣品點，B點為綠原酸標品點，結果如圖9所示，綠原酸樣 品與綠原酸標品的Rf值一致，為0. 263.
稱取實施例11製得的綠原酸樣品0. 0027g，溶於無水甲醇，定容至10mL，搖勻；以 無水甲醇為參比，在200 400nm進行紫外掃描，結果綠原酸樣品的紫外吸收峰與綠原酸標 品基本一致，如圖10所示。
實施例15 電噴霧電離源-質譜分析(ESI-MS)
將實施例11所得綠原酸樣品配成1. 7mg/mL樣品甲醇溶液，在電離源電噴霧 (ESI)；電離模式+ESI ；實驗參數氣體溫度(Gas Temp) :300°C，裂解電壓(Fragmentor) 175V,乾燥氣流速(Drying Gas) :10L/min，掃描電壓(Skimmer) :65V，霧化壓力 (Nebulizer) :50psig ；m/z為60 800全離子掃描的質譜條件下進行電噴霧電離源-質譜 分析，結果與綠原酸的分子質量一致，如圖11所示。
實施例16 核磁共振氫譜分析
精確稱取實施例12所得綠原酸樣品14. 7mg溶於氘代試劑(甲醇)，進行氫譜分 析，結果如圖12所示。
對比例1單純溶劑提取與微波輔助提取效果的比較
乙醇/丙酮/甲醇水溶液浸提準確稱取杜仲葉樣品5. Og,以50%乙醇水溶液或 50%丙酮水溶液或50%甲醇水溶液為提取劑，按照料液比為1 30，提取時間為池，提取溫 度為50°C，置於恆溫水浴鍋中浸提，反應結束後真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲黃 酮粗品。
微波輔助有機溶劑浸提準確稱取杜仲葉樣品5. Og,以50%的丙酮水溶液為溶 劑，按照料液比為1 30，提取時間為25min，提取溫度為50°C，提取功率為600W，提取結束 後真空抽濾，濾液旋轉蒸發乾燥，即得杜仲黃酮粗品，與單純有機溶劑浸提效果比較，如表1 所示。
表1單純溶劑浸提與微波輔助浸提綠原酸效果的比較
提取方法 得率1 得率2 得率3 平均得率綠原酸比例
權利要求
1.一種從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述方法按照以下步驟進行 以杜仲植物葉為原料，以體積分數為20% 80%的強極性有機溶劑水溶液為提取劑，在功 率為300 800W的微波輔助下，40 70°C浸提15 40min，將提取液過濾，乾燥，製得杜仲 葉黃酮粗品，所述原料與提取劑的料液比為Ig 10 50mL;所述的杜仲葉黃酮粗品再以 高速逆流色譜分離純化以體積比為3 4 1 4 5的乙酸乙酯/正丁醇/水作為溶 劑體系，上相為固定相，下相為流動相，流速為1 2mL/min，在800 900r/min的轉速下， 25 35°C，高速逆流色譜分離純化200min，紫外254nm檢測收集液的吸收峰，根據逆流色譜 出峰時間在86 142min之間的收集液作為目標組分，再將目標組分45 60°C真空旋轉蒸 發乾燥，得綠原酸。
2.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述的原料為 落葉前採摘的杜仲葉陰乾後，碾碎成杜仲葉粉末。
3.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述強極性有 機溶劑為乙醇、丙酮或甲醇。
4.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述有機溶劑 水溶液中有機溶劑的體積分數為40% 60%。
5.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述原料與提 取劑的料液比為Ig 16 40mL。
6.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述的微波輔 助提取溫度為45 60°C。
7.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述的微波功 率為400 700W。
8.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述的微波輔 助浸提時間為20 35min。
9.如權利要求1所述的從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，其特徵在於所述的高速逆 流色譜分離純化流速為1. 5 2. OmL/min。
全文摘要
本發明公開了一種從杜仲葉中分離純化綠原酸的方法，所述方法為以杜仲植物葉為原料，以體積分數為20％～80％的強極性有機溶劑水溶液為提取劑，在功率為300～800W的微波輔助下，40～70℃浸提15～40min，將提取液過濾，乾燥，製得杜仲葉黃酮粗品，所述原料與提取劑的料液比為1g∶10～50mL；所述杜仲葉黃酮粗品以體積比為3～4∶1∶4～5的乙酸乙酯/正丁醇/水作為溶劑體系進行高速逆流色譜分離純化，製得綠原酸；本發明有益效果主要體現在本發明操作步驟簡單、設備種類單一、生產周期短、產物純度高，具有廣泛的應用價值及良好的社會經濟效益。
文檔編號C07D311/30GK102040520SQ201010542548
公開日2011年5月4日 申請日期2010年11月15日 優先權日2010年11月15日
發明者劉青梅, 孫培龍, 洪臺, 邵平 申請人:浙江工業大學