全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法及其分析儀器的製作方法
2023-09-10 19:59:20
專利名稱：：全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法及其分析儀器的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種醫療檢測儀器類血細胞分析方法及儀器，特別涉及一種全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法及其分析儀器。
背景技術：
：1、歷史回顧血細胞分析儀，也稱血細胞計數儀，是對血液中各種組成細胞進行計數和分類分析的最常用的重要臨床檢驗儀器的一種。1852年就有人試圖對紅細胞計數，1855年出現了用於血細胞計數的方法。這種用顯微鏡人工鏡檢的方法既費時又費力，需專業訓練的操作人員，在大批量標本檢查時難以及時給出報告，並存在人為計數誤差。1949年，美國人瓦萊思·庫爾特(WallaceH.Coulter)順利地在美國提交了發明專利，並在1953年獲得了此項專利USPatent2656508「MEANSFORCOUNTINGPARTICLESSUSPENDEDINFLUID"(〃懸浮在液體中粒子的計數方法〃)。同年，庫爾特送交了兩臺庫爾特血細胞計數儀原型給(美國)全國衛生研究所NationalInstitutesofHealth(NIH)作鑑定。NIH不久就在發布的兩篇關鍵性文章中，肯定了血細胞計數的庫爾特方法的準確性和便利性。也是在同年，庫爾特在美國全美電工大會(NationalElectronicsConference)上發表了他一生中唯一的技術論文《高速自動化血細胞計數和細胞大小分析儀》(「HighSpeedAutomaticBloodCellCounterandCellSizeAnalyzer")。用顯微鏡方法需要30分鐘的人工鏡檢時間，用庫爾特血細胞計數儀在15秒的時間內即可完成，同時檢測樣本的大小也增加了100倍，並且誤差降低了近10倍。1958年，瓦萊思·庫爾特(WallaceH.Coulter)和他的弟弟約瑟夫·庫爾特(JosephCoulter,Jr.)共同創建了"庫爾特電子公司「，開始銷售庫爾特血細胞計數儀。從此開啟了血細胞計數和分析自動化的新紀元。瓦萊思·庫爾特(WallaceH.Coulter)因其發明的庫爾特原理(CoulterI^inciple)於1960年獲得了享有崇高聲望的約翰斯葛特科學成就獎(JohnJcottAwardforScientificAchievement)，這一為有獨創性的男女設立的科學成就獎創始於1816年，是專門頒發給對人類具有革命性發明的發明家，迄今獲此殊榮的發明家中，大家較熟悉的有發明電燈的愛迪生(ThomasEdison)，發現原子裂變的居裡夫人(MarieCurie)，無線電通信的奠墓人馬可尼(GuglielmoMarconi)等著名科學家和發明家。2、庫爾特原理(CoulterPrinciple)(參見圖2)一個容器(圖2中的微孔池21)被分成兩個部分(圖2中的微孔管22)，兩個部分由一個微孔25連結，兩個電極沈、27分別置於容器的兩個部分，於是電流就在通路中形成(圖2中的微孔電流觀)，當懸浮在弱電解質溶液中的一個粒子(例如血細胞24)通過微孔時，由於粒子的阻抗比電解質溶液的阻抗大，在微孔25兩端就有一個瞬時的阻抗增加。微孔阻抗改變的區域形成了一個"敏感區"。阻抗的瞬間變化產生一個電脈衝，通常被稱為直流(DirectCurrent)脈衝，簡稱DC脈衝。這一DC脈衝的幅度與通過微孔25的粒子的體積成正比。這就是庫爾特原理。利用庫爾特原理就可以對通過微孔的粒子進行計數並分析粒子的大小，這種方法也被稱為直流阻抗法或庫爾特阻抗法。庫爾特原理可以對各種不同的粒子進行分析，不僅適用於血細胞，還可用於其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，對材料有顆粒度及粒子內部成分有要求的各個工業領域，諸如食晶、製藥、化工、石化工業等，航空航天工業中同樣也用來檢測燃料的純度。庫爾特原理和庫爾特阻抗法是血細胞計數及分析的最為經典的原理和方法，自發明一直沿用至今，是任何一臺血液分析儀器所必不可少的組成部分，而其原理和方法幾十年來基本上沒有什麼根本的改變。3、血液成分，參見圖6及參考文獻1)血液由血漿61(58%)和有形細胞成分62(42%)組成。有形分成主要包括紅細胞64(每微升4-5百萬個，RBC為紅細胞RedBloodCell的簡稱)、白細胞65(每微升59千個，WBC為白細胞WhiteBloodCell的簡稱)和血小板63(每微升20-40萬個，PLT為其Platelet的簡稱)三大類。白細胞65可以粗分為粒性白細胞(Granulocyte)，淋巴細胞69(Lymphocytes)和單核細胞610(Monocyte)。粒性白細胞包括嗜鹼粒細胞68(Basophil)，嗜酸粒細胞67(Eosinophil)和中性粒細胞66(Neutrophil)。所以白細胞可以細分為五個亞細胞群，即淋巴細胞69、單核細胞610、中性細胞66、嗜酸細胞67、嗜鹼細胞68。4、三分類和五分類血細胞分析儀由於庫爾特原理是以粒子通過微孔時電阻抗的變化產生的DC脈衝的幅度來鑑別不同體積的血細胞，而白細胞中的中性、嗜酸、嗜鹼三種細胞的體積很接近，所以僅用庫爾特原理製成的血細胞分析儀只能將白細胞分為三類，故稱為三分類儀器，即中性粒細胞(GRN)，淋巴細胞(LYM)，和中間細胞群(MID，包括嗜鹼粒細胞、嗜酸粒細胞、中性粒細胞)。能鑑別白細胞中的五種組分(即淋巴、單核、中性、嗜酸、嗜鹼細胞)並分類計數的血細胞分析儀就是通常所稱的五分類血細胞分析儀。為了達到五分類的目的，90年代，雷射光散射、射頻、化學染色計數等方法相繼被應用於對細胞特性的分析，出現了五分類血液分析儀。5、基於流式細胞儀原理的雷射光散射方法為利用雷射光散射，90年代開始出現基於流式細胞儀原理的光散射血細胞分析儀，其基本原理可用圖7來說明。核心部分是通稱為流式細胞盒71(FlowCell)的提供液體和粒子通道的小盒，如圖8所示。在一個約4毫米x4毫米x8毫米的石英長方柱體沿長軸在中心以某種方法(譬如雷射)鑽出一條直徑約50微米的直通微孔，然後從直通孔的兩端磨出相對對準的兩個圓錐83，直至在方柱體的中心留有約70微米長的微孔，稱為微通孔(道)84(0rifice)，如圖8所示，這就是流式細胞盒。雷射束81從水平方向射入並聚焦在微通孔84的中心，當粒子沿垂直方向通過微通孔84的中心時，就會和雷射相互作用，產生前向、側向和後向等各個方向的光散射(LightScattering，縮寫為LS)，即前向光散射(forwardlightscatter)，側向或90°光散射(sidelightscatter)，和後向光散射(backlightscatter)，一般縮寫為FLS，SLS和BLS。側向或90°光散射可由90°光散射或螢光探測裝置79來檢測，而前後向光散射和軸向光損失可由前後向光散射和軸向光損失檢測裝置710來檢測(在參見圖7)。82表示鞘套流束，85表示樣本(粒子)流束。5在圖7所示的儀器中，照明方式是雷射光源77的光束的轉播方向(圖中是水平方向)與粒子的流動方向(圖中是垂直方向)相互正交，這裡我們稱之為正交照明方式，以便與本發明的共軸照明方式加以區別。現今世界上所有基於流式細胞儀原理的光散射血細胞分析儀都是用這種正交照明方式。為了能使粒子一個一個相繼的通過微通孔的中心，除了適當的稀釋懸浮粒子的溶液的濃度外，還需用鞘流束流體包圍含有被測粒子的樣本(粒子)流束，這就是通稱為流體聚焦法(HydrodynamicFocusing)。在上下兩個圓錐內各安裝一個電極73，當粒子通過微(通)孔72時，就會產生前述的庫爾特直流脈衝(DC)，微孔電流74。這樣，當每一個粒子通過微通孔72時，就可以同時得到三個以上的信號，如DC，FLS和SLS。如在上述的兩個電極上再加上高頻電源，就可以同時多得到一個信號，這也是庫爾特先生的另一個重大發明，(USPatent3502974)稱為射頻法，簡稱為(RF)JPRadioFrequency的縮寫。圖中，71.是流式細胞盒；75是鞘套流束；76是樣本(粒子)流束；78是表示聚焦透鏡；79.90°光散射或螢光探測裝置；710是前向光散射及軸向光損失檢測裝置。對粒子內部組成成分和結構敏感的測試方法有90度光散射(SLS)，射頻法(RF)，螢光染色技術，後向光散射(BLS)等。其中又以後向光散射最為敏感，只是由於技術上的瓶頸目前還沒有解決，至今在市場上的高端血液分析儀器只利用了其它幾種方法，如CoulterMAXM、STKS等用VCS技術，即Volume(DC)，Conductivity(RF/DC)，和Scattering(FLS)。SysmexSE-9000,XE-2100等則用了DC、LS和螢光染色技術，ABBOTT則有90度光散射的專利，它的儀器一般用DC、FLS和SLS。本發明的高端血液分析儀器只用DC、FLS和BLS，是迄今世界上第一次把後向光散射用於商業化的實用高端血液分析儀器。6、後向光散射在雷射散射粒子分析技術中，相對於其它方向的散射，後向散射對粒子的內部結構具有更高的敏感性。1979年，KerkerM，參考文獻幻等指出，只有後向光散射對細胞內部形態和結構有敏感性，1983年Kerker，參考文獻幻，從對彈性光散射理論基礎的回顧進一步指出，有關細胞的形狀和內部結構的信息可以最好的從後向的光散射信號來獲得。1986年，Sloot和Figdor，參考文獻4)在其理論文章中指出，為了最優化的探測混雜在一起的有核血細胞中不同的細胞類型，需要同時探測前向、側向和後向的散射光。文中的計算表明，後向散射光的強度取決於細胞核對細胞質的比例及細胞核和細胞質的光學密度的變化。文中的分析特別強調了後向散射光的強度與細胞核的透明度之間的直接相關性。2004年DakotaWatson，參考文獻5)等也對各個方向的光散射強度與細胞形態的關係作了較詳細的論述，並作了相應的實驗。在以上這些工作的基礎上，近年也有一些關於後向光散射的美國專利，如USPatent6743634B2(Kramer,June1，2004)和USPatent6869569B2(Kramer,March22,2005)0這些專利所給出的方法，都是用多根光纖和多個光電倍增管作後向散射光信號的探測，其結構和成本都與實用的商業儀器的要求相距甚遠。
發明內容本發明提供了一種創新的照明方式，即對經典的庫爾特微孔直接的共軸軸向照明，共軸軸向照明的意思就是光束傳播的方向的光軸與庫爾特微孔軸重合(同軸)的照明，這種照明方式的採用，可以徹底摒棄現有的基於流式細胞儀原理的血細胞分析儀器中所必不可少的昂貴的流式細胞盒和複雜的流體聚焦系統，使對粒子內部組成成分和結構特別敏感的後向光散射探測首次應用到商業血液分析儀器中，從而極大的提高了儀器的鑑別能力，不僅能完成血細胞的五分類分析計數，還能提供更多參數的綜合檢測和分析，使本發明的儀器成為一臺高性價比的高端血液分析儀器(HematologyAnalyzer)。本發明的高端血液分析儀器只用直流脈衝信號(DC)，前向光散射信號(FLS)和後向光散射信號(BLS)，是迄今世界上第一次把後向光散射用於商業化的實用高端血液分析儀器。為了實現上述目的，本發明提供一種全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，它使光散射法可以直接應用於傳統的庫爾特微孔，其特徵在於，將照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸。另外，為使庫爾特原理的微孔池能形成光束的通道以照明庫爾特微孔，微孔管改制成把微孔池分隔為兩部分的微孔板，並在微孔池相對微孔的前後開兩個光學窗口。進一步所述微孔池相對微孔的前後的兩個光學窗口，每一所述光學窗口可以是一光學平板或一對透鏡或其它光學元件。本發明也提供一種庫爾特微孔的共軸照明血液分析儀器，它包括照明光學系統、安裝有通光窗口的微孔池、前向和後向散射光信號探測光學系統，其特徵在於，所述照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸。本發明的優點及達到的技術效果表現在以下幾個方面1)定義整個庫爾特微孔區為探測敏感區，探測敏感區可以包括整個庫爾特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的後部，或微孔的幾個部分的組合。2)由於微孔池壁上的光學窗口離庫爾特微孔中心(聚焦雷射束的光腰)的距離較遠，光學窗口上的雷射強度遠小於光腰處的雷射強度，使從光學窗口上反射的光強度大為降低，從而大為降低了後向散射光探測時的噪音背景。這也是基於流式細胞儀原理的血液分析儀器中探測後向散射光時不可克服的技術瓶頸(usPatent6646742,Gangsteadetal.,Nov.11，2003)。如圖8所示，在探測後向散射光時，聚焦雷射束要先照到長方柱體的表面(距庫爾特微孔中心約2mm)，然後再照到庫爾特微孔的園柱形表面(距庫爾特微孔中心約25微米)，因為這裡的聚焦雷射束強度很大，反射的光強度相應也較大，使原本強度就很弱的後向散射光(比前向散射光強度小約3個數量級)的探測因器壁反射產生的噪音背景太大而無法達到可接受的信噪比要求。而本發明的照明方法正可克服這一後向散射光探測的技術瓶頸。3)如
背景技術：
5中所述，現今世界上所有基於流式細胞儀原理的光散射血細胞分析儀都是用的正交照明方式。在本發明由於照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸，這樣光束與粒子相互作用的區域就為整個庫爾特微孔，這在光束與粒子相互作用的區域和時間上，本發明的共軸照明方式具有絕對的優勢。例如，本發明的共軸照明方式中，光束與粒子相互作用的區域為整個庫爾特微孔(見圖9右，標號4a，約100微米長，直徑50微米的圓柱)，而在正交照明方式中，光束與粒子相互作用的區域僅為約20微米的聚焦光束尺寸(見圖9左，標號94)。光束與粒子相互作用的時間，本發明的共軸照明方式約為正交照明方式的5倍，所探測到的散射光信號的時間寬度也相應的增寬，這就對探測器的時間響應的要求相應的下降，從而可以使用較大面積的光電探測器，及增加接收角度範圍的選擇性。4)以上共軸照明方式的優點，可使散射光信號強度至少增加5倍，再結合下述的只對空間某特定區域敏感的信號探測光學系統，可以使後向散射光信號的信號對噪音比(S/N)大為提高，從而大為提高了儀器對不同種類細胞的鑑別能力。5)本發明使用只對空間某特定區域敏感的信號探測光學系統，即只對圖5中的探測敏感區中的粒子(圖中血細胞B)產生的光散射信號有響應，對探測敏感區外的粒子(圖中血細胞A、C、D)，即使處於照明光束中，其所發出的光散射信號也不能到達光電探測器。至於從微孔池壁上的光學窗口(圖3、4中元件37)反射的構成後向散射的背景噪音更無法進入光電探測器。這一特殊設計的光學系統使本發明的儀器特別在後向僅有極低的噪音，後向散射光的信號對噪音比(S/N)甚至高於DC的(S/N)，如圖13所示。6)本發明是對庫爾特微孔直接照明，因而徹底擯棄了現有的基於流式細胞儀原理的血細胞分析儀器中所必不可少的昂貴的流式細胞盒和複雜的流體聚焦系統，所以有「簡單的結構、低故障、低成本、易操作「等一系列優點。本發明以獨特的照明方法巧妙的結合了庫爾特阻抗法和光散射法，不需任何附加的試劑處理和螢光染色等增加儀器操作複雜性的任何方法，以其後向光散射探測而得到的高鑑別率、簡單的結構、低故障、低成本、易操作等一系列優點，與世界上現有的佔市場主導地位的基於流式細胞儀原理的高端血液分析儀器相比，具有明顯的性價比和市場優勢。這種方法不僅可以用於血液分析儀器中，還可用於其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，及對材料有顆粒度及粒子內部成分有要求的各個工業領域，諸如食晶、製藥、化工、石化工業等。航空航天工業中同樣也可用來檢測燃料的純度等。圖1是說明本發明的雷射束光軸與庫爾特微孔軸同軸的共軸照明。其中標號說明41.庫爾特微孔(直徑50微米)42.圓片(100微米厚的庫爾特微孔板)43.雷射光束光軸與庫爾特微孔軸(同軸)44.血細胞45.聚焦雷射束圖2是庫爾特原理示意圖。其中21.庫爾特微孔池22.庫爾特微孔管23.血細胞懸浮液24.血細胞25.庫爾特微孔26.外電極27.內電極28.微孔電流29.真空圖3是具有光通道的庫爾特微孔池的示意圖。其中，31.庫爾特微孔池32.庫爾特微孔板33.血細胞懸浮液34.血細胞35.庫爾特微孔36.內外電極37.光學窗口38.微孔電流39.真空圖4是用透鏡做窗口的庫爾特微孔池的示意圖。其中，31.庫爾特微孔池32.庫爾特微孔板33.血細胞懸浮液34.血細胞35.庫爾特微孔36.內外電極37.透鏡用作光學窗口38.微孔電流39.真空圖5是光散射信號敏感區的示意圖。其中，51.直徑50微米的庫爾特微孔52.雷射束53.敏感區54.敏感區後部55.敏感區中部56.敏感區前部57血細胞A、B、C、D58.雷射束光軸與庫爾特微孔軸(同軸)59.前向光散射信號510.後向光散射信號511.100微米厚園片庫爾特微孔板圖6是表示血液的組成成分的示意圖。其中，61.血漿62.血液的有形成分63.血小板64.紅血球65.白血球0091]66中性粒細胞0092]67.嗜酸粒細胞0093]68.嗜鹼粒細胞0094]69.淋巴細胞0095]610.單核細胞0096]圖'是分基於流式細胞儀的光散射血分析儀的基本原理圖，其中0097]71.流式細胞盒0098]72.庫爾特微孔0099]73.電極0100]74.微孔電流0101]75.鞘套流束0102]76.樣本(粒子)流束0103]77.雷射光源0104]78.聚焦透鏡0105]79.90°光散射或螢光探測裝置0106]710.前向光散射及軸向光損失檢測裝置0107]圖6是流式細胞盒的示意圖，其中0108]81.雷射束0109]82.鞘套流束0110]83.園錐0111]84.微通道(Orifice)0112]85.樣本(粒子)流束0113]圖9是共軸照明方式與正交照明方式的比較示意圖。其中0114]91.正交照明方式0115]92.血細胞0116]93.正交照明方式中庫爾特微孔中心處的橢園型高斯聚焦雷射光斑0117]94.正交照明方式中雷射與細胞(粒子)相互作用區域0118]4a.共軸照明方式中雷射與細胞(粒子)相互作用區域0119]95.庫爾特微孔壁0120]96.庫爾特微孔0121]97.流式細胞盒中庫爾特微孔的長度0122]98.庫爾特微孔直徑0123]99.圓錐0124]910.共軸照明方式0125]911.共軸照明方式中庫爾特微孔的長度0126]912庫爾特微孔直徑0127]913.共軸照明方式中聚焦雷射束光腰0128]圖10是使用本發明的共軸照明方式的檢測系統的具體實施例，其中0129]1.微孔電流2.電極3.庫爾特微孔4.血細胞5.血細胞懸浮液6.光學窗口7.聚焦雷射束8.照明光學系統9.照明雷射強度的實時監測光學系統10.後向散射光接收光學系統11.分光板12.光纖13.雷射器14.前向散射光接收光學系統圖11是使用本發明的共軸照明方式的檢測系統的另一具體實施例，其中1.微孔電流2.電極3.庫爾特微孔4.血細胞5.血細胞懸浮液6.光學窗口7.聚焦雷射束8.照明光學系統9.照明雷射強度的實時監測光學系統10.後向散射光接收光學系統11.分光板12.光纖13.雷射器14.前向散射光接收光學系統圖12是本發明的照明方法的標準粒子的前向散射光和直流脈衝信號的示波器記錄圖，其中，下軌跡為直流脈衝(DC)信號，上軌跡為前向散射光(FLS)信號。前向的直流背景920毫伏。圖13是本發明的照明方法的標準粒子的後向散射光和直流脈衝信號的示波器記錄圖，其中，下軌跡為直流脈衝(DC)信號，上軌跡為後向散射光(BLS)信號。後向的直流背景9.60毫伏。圖14是本發明的照明方法的質控血樣的後向散射光和直流脈衝信號的示波器記錄圖，其中，下軌跡為直流脈衝(DC)信號，上軌跡為後向散射光(BLS)信號。中軌跡為後向散射光(BLS)經濾波後的信號。後向的直流背景M毫伏。具體實施方法下面結合附圖及其實施例，對本發明的作詳細描述。11本發明的實施主要是把照明光學系統、安裝有通光窗口的微孔池、前向和後向散射光信號探測光學系統等直接涉及本發明的部分，按儀器設計要求與僅用基於庫爾特阻抗法的三分類儀器適當合理的整合起來，從而成為一臺僅用庫爾特阻抗法和光散射法的具有高鑑別力的高端全功能血液學分析儀器。本發明的區別特徵在於所述照明光束傳播方向與庫爾特微孔的軸線一致。參見圖1，在本發明中，照明雷射光束45的傳播方向的光軸與庫爾特微孔41的軸線同軸，它使光散射法可以直接應用於經典的庫爾特微孔。在一片幾毫米直徑、厚100微米的紅寶石圓片42的中心打一個50微米直徑的通孔41，就成了一個經典的庫爾特微孔。把沿庫爾特微孔軸傳播的光束45聚焦到微孔41的中心(如圖1所示)。這種照明方式在庫爾特原理髮明至今近60年的世界血液分析儀器歷史上尚屬首創。其優越性在本說明書的其餘部分將得到充分的闡述。血細胞44可以通過通孔41。當然，上述圓片42的材料和尺寸、微孔的直徑可根據具體要求設定。再參見圖1，由於照明光束45的傳播方向的光軸與庫爾特微孔41的軸線同軸，所以圖中軸線43既是照明光束45轉播方向的光軸，也是空心圓柱型的庫爾特微孔41的圓柱的中心軸。上述方法使用的照明光源，可以是雷射器(氣體雷射器，如He-Ne雷射器，Ar離子雷射器，半導體雷射器，光纖藕合半導體雷射器，固體雷射器，光纖藕合固體雷射器，半導體雷射泵浦固體雷射器，可調諧雷射器，光纖雷射器等)，也可以是發光二極體(LED)，氣體放電光源、自灼光源等。上述使用的光源的波長範圍，根據不同的應用，可以從紫外、可見到紅外波段中的一種或幾種。當照明光束沿庫爾特微孔軸傳播時，應使用適當的光學系統把光束聚焦到均勻地充滿整個庫爾特微孔。當使用的光源為雷射器時，應使聚焦雷射束在焦點處的光腰大小略小於庫爾特微孔的直徑，而其瑞利範圍(RayleighRange)則大於幾個庫爾特微孔的長度。圖3是根據庫爾特原理(參見圖2、的微孔池能形成光束的通道以照明庫爾特微孔，將圖2的微孔管22改制成把微孔池31分隔為兩部分的微孔板32，並在微孔池31相對微孔35的前後開兩個光學窗口37，如圖3所示，窗口37上可以是如圖3所示的一對光學平板，也可以是如圖4所示一對透鏡或其它光學元件。該光學元件可將光源的光束聚光到微孔35中。由此可見，本發明的微孔池31可以在常用的庫爾特原理微孔池上稍加改進。在圖3、圖4中，33表示血細胞懸浮液，34代表血細胞，36.代表內外電極，38是產生的微孔電流。微孔池31表示真空39(例如，真空度可為6」Hg)。由此可見，由於上述微孔池壁上的光學窗口37離庫爾特微孔35的中心(聚焦雷射束的光腰)的距離較遠，光學窗口37上的雷射強度遠小於光腰處的雷射強度，使從光學窗口37上反射的光強度大為降低，從而大為降低了後向散射光探測時的噪音背景。這也是基於流式細胞儀原理的現有的血液分析儀器中探測後向散射光時不可克服的技術瓶頸(USPatent6646742,Gangsteadetal.，Nov.11,2003)。再如圖8所示，在現有技術的情況，在探測後向散射光時，聚焦雷射束要先照到長方柱體的表面(距庫爾特微孔中心約2mm)，然後再照到庫爾特微孔的園柱形表面(距庫爾特微孔中心約25微米)，因為這裡的聚焦雷射束強度很大，反射的光強度相應也較大，使原本強度就很弱的後向散射光(比前向散射光強度小約3個數量級)的探測因器壁反射產生的噪音背景太大而無法達到可接受的信噪比要求。而本發明的照明方法正可克服這一後向散射光探測的技術瓶頸和技術缺陷。大為降低了後向散射光探測時的噪音背景。如圖5所示，本發明的整個庫爾特微孔區可以定義為探測敏感區53，探測敏感區53可以包括整個庫爾特微孔，也可以是微孔的中部55、微孔的前部56、微孔的後部M，或微孔的幾個部分的組合。它的光源可採用雷射束52。從而可產生的前向光散射信號59、後向光散射信號510。雷射束52的光軸與圓片511的庫爾特微孔51的軸方向同軸，當然，本文中所謂的「共軸」或「同軸」實際上是表明方向上的一致，都是在一定的加工和調校的精度下所能實際達到的限度內而言的，不可能是幾何上、理論上的100%的共軸或同軸。本實施例中，圓片511是採用100微米厚園片庫爾特微孔板。當然，上述圓片的材料和尺寸、微孔的直徑可根據具體要求設定。再參見圖5，由於雷射光束52的傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸，所以圖中軸線58既是雷射光束轉播方向的光軸，也是空心圓柱型的庫爾特微孔的圓柱的中心軸。本發明的信號探測系統具有隻對某特定空間區域敏感的特點，即只對圖5中的探測敏感區中的粒子產生的光散射信號有響應，對探測敏感區外的粒子，即使處於照明光束中，其所發出的光散射信號也不能到達光電探測器。本發明的只對某特定空間區域敏感的信號探測系統包括，但不限於，光學的、機械的、電子學的、光-電的、光-機的、及以上幾種結合的方法，或其它可以這到對某特定空間區域敏感的任何方法加以實現。本發明所用的光學探測接收系統，具有對空間特定區域選擇性接受散射光信號的特點，從而實現了後向光散射信號的成功探測。對前向、後向散射光信號信號的探測，可以是對不同角度區間，或幾個不同角度區間的組合的探測。前向的光信號包括前向散射光、軸向光損失(AxialLightLoss，簡稱ALL)等信號。對前向、後向散射光信號的探測，可以是單波長的探測，也可以是多波長光譜儀分光探測。也可以在前向、後向進行單色或多色的螢光信號探測，或非彈性光散射信號，如拉曼散射、反斯託克斯拉曼散射等的信號探測。參見圖9，與現有的正交照明方式91相比，本發明的共軸照明方式910在光束與粒子相互作用的區域和時間上具有絕對的優勢。如圖9所示，在本發明的共軸照明方式中，光束與粒子相互作用的區域為整個庫爾特微孔(見圖9右，標號4a，約100微米長，直徑50微米的圓柱)。而在正交照明方式中，光束與粒子相互作用的區域僅為約20微米的聚焦光束尺寸(見圖9左，標號94)。另外，光束與粒子相互作用的時間，本發明的共軸照明方式約為正交照明方式的5倍，所探測到的散射光信號的時間寬度也相應的增寬，這就對探測器的時間響應的要求相應的下降，從而可以使用較大面積的光電探測器，及增加接收角度範圍的選擇性。圖9中，92表示血細胞；93表示正交照明方式中庫爾特微孔中心處的橢園型高斯聚焦雷射光斑；9表示庫爾特微孔壁；96表示庫爾特微孔；97表示流式細胞盒中庫爾特微孔的長度；98表示庫爾特微孔直徑；9表示圓錐；910表示共軸照明方式；911表示共軸照明方式中庫爾特微孔的長度；912表示庫爾特微孔直徑；913表示共軸照明方式中聚焦雷射束光腰。圖10、圖11是本發明提供的兩個具體實施例的示意圖，它們是在圖3或圖4的微孔池的基礎上，採用本發明的共軸照明方式的檢測系統的實施例的示意圖。該實施例僅是舉例說明，但實際應用可不限於這些實施例。具體如下實施例1)參見圖10，雷射器13，例如光纖藕合雷射器，的輸出經光纖12輸出的光經分光板11進入照明光學系統8，聚焦光束7經微孔池光學窗口6(右邊的)聚焦到微孔中心的血細胞4上。照射光與血細胞相互作用產生的前向散射光(FLS)或軸向光損失(ALL)經微孔池光學窗口6(左邊的)進入前向散射光接收光學系統14。照射光與血細胞4相互作用產生的後向散射光(BLS)經微孔池窗口6返回進入後向散射光接收光學系統(包括照明光學系統8、分光板11和後向散射光接收光學系統10)，照明雷射強度的實時監測光學系統9用於實時監測照明雷射的強度變化。於是，每個血細胞通過微孔時，就可以同時得到至少3到4個有關血細胞信息的信號(DC、FLS、BLS、ALL)，這些信號即以其高鑑別力用於血細胞的五分類和其他多項參數的測量。圖中，5是血細胞懸浮液。1是微孔池產生的微孔電流。圖中，A、B為庫爾特微孔池被庫爾特微孔分隔成的兩個部分。實施例2):參見圖11，本實施方法與具體實施方法1)的不同在於照明光學系統和後向散射光接收光學系統沒有共用的部分，微孔池的設計也不同於上述實施方法1)。光纖藕合雷射器13的輸出經光纖12先進入照明光學系統8，然後經分光板11後變成聚焦光束7經微孔池的光學窗口6(右邊的)聚焦到微孔中心的血細胞4上。照射光與血細胞相互作用產生的前向散射光(FLQ或軸向光損失(ALL)經微孔池光學窗口6(左邊的)進入前向散射光接收光學系統14。照射光與血細胞4相互作用產生的後向散射光(BLS)經微孔池窗口6(右邊的)返回，由分光板11反射進入後向散射光接收光學系統10。照明雷射強度的實時監測光學系統9用於實時監測照明雷射的強度變化。於是，每個血細胞通過微孔時，就可以同時得到至少3到4個有關血細胞信息的信號(DC、FLS、BLS、ALL)，這些信號即以其高鑑別力用於血細胞的五分類和其他多項參數的測量。部分實驗結果示例1)直徑7微米的標準粒子的庫爾特直流脈衝信號(DC，下軌跡)與前向散射光信號(FLS，上軌跡)的示波器記錄顯示(實驗結果)，見圖12。注意前向光散射信號的直流背景為920毫伏。2)直徑7微米的標準粒子的庫爾特直流脈衝信號(DC，下軌跡)與後向散射光信號(BLS，上軌跡)的示波器記錄顯示(實驗結果)，參見圖13。3)質控血樣的庫爾特直流脈衝信號(DC，下軌跡)與後向散射光信號(BLS，下軌跡，經濾波後的BLS，中軌跡)的示波器記錄顯示(實驗結果)，參見圖14。注意後向光散射信號的直流背景僅為M毫伏。對比前向光散射信號的直流背景920毫伏，降低了34倍。後向光散射信號的信號噪音比(S/N)甚至比直流脈衝的(S/N)還高，這充分說明本發明的照明方式和後向光學探測系統的設計的無比優越性。通過上述實施例，可以看出，本發明是對庫爾特微孔直接照明，因而徹底擯棄了現有的基於流式細胞儀原理的血細胞分析儀器中所必不可少的昂貴的流式細胞盒和複雜的流體聚焦系統，所以有「簡單的結構、低故障、低成本、易操作」等一系列優點。當然，利用本發明的庫爾特微孔的共軸照明方法，不僅可以用於上述血液分析儀器中，還可製成各種測量和檢測儀器來應用於其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，及對材料有顆粒度及粒子內部成分有要求的各個工業領域，諸如食晶、製藥、化工、石化工業等。航空航天工業中同樣也可用來檢測燃料的純度等。參考文獻DHaematologyTimetable(1995),JanePittaway,MedLabPrac1CXAlOl,UCDavis.2)KerkerΜ,etal.，「Lightscatteringandfluorescencebysmallparticleshavinginternalstructure.",JHistochenCytochem,1979Jan；27(1)250-63.3)KerkerΜ,"Elasticandinelasticlightscatteringinflowcytometry",Cytometry,1983.Tul；4(1):1_10。4)P.Μ.A.SlootandC.G.Figdor,"Elasticlightscatteringfromnucleatedbloodcells:rapidnumericalanalysis",AppliedOptics,Vol.25,Issue19,pp.3559-3565(1986).5)Dakotaetal.,"ElasticLightScatteringfromSingleCellsOrientationalDynamicsinOpticalTrap",BiophysicalJournal,Vol.87,August2004，ppl298-1306.權利要求1.全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，它使光散射法可以直接應用於經典的庫爾特微孔，其特徵在於，將照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸。2.根據權利要求1所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，所述照明光束的照明光源，可以是下列任一種或幾種雷射器、發光二極體(LED)，氣體放電光源、自灼光源；所述雷射器可以是下列任一種或幾種氣體雷射器，如He-Ne雷射器，Ar離子雷射器，半導體雷射器，光纖藕合半導體雷射器，固體雷射器，光纖藕合固體雷射器，半導體雷射泵浦固體雷射器，可調諧雷射器，光纖雷射器。3.根據權利要求1所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，所述照明光束的照明光源的波長範圍，根據不同的應用，可以從紫外、可見到紅外波段中的一種或幾種。4.根據權利要求1到3任一所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，當照明光束沿庫爾特微孔軸傳播時，光束聚焦到均勻地充滿整個庫爾特微孔。5.根據權利要求1到3任一所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，當使用的光源為雷射器時，聚焦雷射束在焦點處的光腰大小略小於庫爾特微孔的直徑，而其瑞利範圍(RayleighRange)則大於幾個庫爾特微孔的長度。6.根據權利要求1所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，為使庫爾特原理的微孔池能形成光束的通道以照明庫爾特微孔，微孔管改造成把微孔池分隔為兩部分的微孔板，並在微孔池相對微孔的前後開兩個光學窗口。7.根據權利要求6所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，所述微孔池相對微孔的前後的兩個光學窗口，每一對所述光學窗口可以是一對光學平板或一對透鏡或其它光學元件。8.根據權利要求1、4和5所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，整個庫爾特微孔區為探測敏感區，探測敏感區可以包括整個庫爾特微孔，也可以是微孔的中部、微孔的前部、微孔的後部，或微孔的幾個部分的組合。9.根據權利要求1和8所述的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，信號探測系統具有隻對某特定空間區域敏感，即只對探測敏感區中的粒子產生的光散射信號有響應，對探測敏感區外的粒子，即使處於照明光束中，其所發出的光散射信號也不能到達光電探測器。10.根據權利要求9的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，只對某特定空間區域敏感的信號探測系統可以是光學的、機械的、電子學的、光-電的、光-機的、及以上幾種的結合的方法，或其它可以達到對某特定空間區域敏感的任何方法加以實現。11.根據權利要求9的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，具有對空間特定區域選擇性接受散射光信號的特點，從而實現了後向光散射信號的成功探測。12.根據權利要求9和11的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，對前向、後向散射光信號信號的探測，可以是對不同角度區間，或幾個不同角度區間的組合的探測。13.根據權利要求9、11、12的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，前向的光信號包括前向散射光、軸向光損失(AxialLightLoss，簡稱ALL)等信號。14.根據權利要求9、11、12、13的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，對前向、後向散射光信號的探測，可以是單波長的探測，也可以是多波長光譜儀分光探測。15.根據權利要求9、11、12、13的全功能血液分析儀器中庫爾特微孔的共軸照明方法，其特徵在於，也可以在前向、後向進行單色或多色的螢光信號探測，或非彈性光散射信號，如拉曼散射、反斯託克斯拉曼散射等的信號探測。16.一種庫爾特微孔的共軸照明血液分析儀器，它包括照明光學系統、有通光窗口的微孔池、前向和後向散射光信號探測光學系統，其特徵在於，在微孔池中所述照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線一致。17.—種庫爾特微孔的共軸照明的應用，所述照明光束傳播方向的光軸與庫爾特微孔的軸線同軸，它不僅可以用於血液分析儀器中，還可用於其他細胞、動物血細胞、其他微小粒子，及對材料有顆粒度及粒子內部成分有要求的各個工業領域，諸如食晶、製藥、化工、石化工業的檢測以及航空航天工業中可用來檢測燃料的純度等。全文摘要一種庫爾特微孔的共軸照明方法及其血液分析儀器，以與庫爾特微孔的軸線同軸的照明光束直接對庫爾特微孔進行共軸照明的特殊設計，使對粒子內部組成成分和結構特別敏感的後向光散射探測應用到商業血液分析儀器中成為可能，從而極大的提高了儀器的鑑別能力；它不需昂貴的流式細胞盒和複雜的流體聚焦系統，它也不需附加的試劑處理和螢光染色等增加儀器操作複雜性的任何方法，僅用庫爾特阻抗法和光散射法，就不僅能完成血細胞的五分類分析計數，還能提供更多參數的綜合檢測和分析。與世界上現有的佔市場主導地位的基於流式細胞儀原理的高端血液分析儀器相比，具有明顯的性價比和市場優勢。文檔編號G01N15/12GK102087197SQ20101014250公開日2011年6月8日申請日期2010年3月9日優先權日2009年12月8日發明者龔維燕申請人:龔維燕