幹擾素溶液的製作方法

2023-09-10 13:28:55 2

專利名稱：幹擾素溶液的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種適合於非腸道用藥的幹擾素α水溶液。幹擾素溶液的生產涉及許多問題，這些問題是由有效成分對物理和化學因素的敏感性引起的而且至今尚未得到滿意的解決。與其它蛋白質相似，水溶液中的幹擾素受到化學降解機理的作用如蛋白酶解、氧化、二硫化物交換、寡聚、脫醯胺作用和β-消去，以及物理機理的作用如聚集、沉澱和吸附。因此，幹擾素含有用來抵消這些作用的添加劑。例如，人血清白蛋白(HSA)在商用製品中用作穩定劑，但這也有問題，因為有病毒汙染的危險和聚集體的形成，這反過來會導致抗體形成。所以，已推薦一些幹擾素溶液，它們避免使用HSA，而且除其它物質以外，還含有其它輔助劑即非離子洗滌劑(參見國際專利申請WO89/04177和日本專利申請61-277633)。而且還已知，保持特定的pH值對幹擾素溶液的穩定很重要。例如，在專利申請WO89/04177提到4.0-6.0的pH範圍。最後，與在其它注射液中一樣，還需要賦形劑，例如，用來調節等滲溶液的試劑，以及防腐劑。
由於幹擾素活性高而且以最小濃度存在於藥物製劑中，所以幹擾素製品的穩定性和保證有效成分的恆定濃度尤為重要。已經發現，為保證最佳利用性能，幹擾素溶液的賦形劑必須從眾多有潛力的適宜試劑中精心選擇而且相互間必須相配。例如，在pH5-6下幹擾素α2a在玻璃表面上的吸附最大，所以這樣的pH原則上似乎是不利的。另一方面，在此pH下共價降解反應進行得最小。商用的用HSA穩定的溶液pH為7。許多不相關的因素以不可預料的方式影響幹擾素溶液的利用性能。
現已發現，含有(a)一種幹擾素α；(b)一種非離子洗滌劑；(c)一種調節pH為4.5-5.5的緩衝液；(d)苄醇；以及，可選擇地(e)一種等滲劑的不含HSA的幹擾素α水溶液顯示出最佳利用性能，例如貯藏穩定性和公布量有效成分的生物利用率。
對本發明中的應用，可使用任何幹擾素α，例如，歐洲專利No.43980中公開的幹擾素α(其中稱為成熟人白細胞幹擾素A，也參見J.Pharm.Biomed，Analysis Vol.7，No.2，233-238(1989))。
本發明中採用的幹擾素α可以結合到聚合物上，例如聚亞烷基二醇(取代的或未取代的)如聚乙二醇上，形成PEG-幹擾素α。可用本技術中已知的各種接頭完成這種結合，特別是用諸如歐洲專利申請EP-A-0510356和A-0593868中公開的那些接頭。優選為聚乙二醇這樣的聚合物的分子量可在300至30,000道爾頓之間變化，一或多種接頭、優選一至三種接頭結合到幹擾素α上。用幹擾素α2a形成優選的幹擾素α結合物。
用於本發明的優選幹擾素α是幹擾素α2a和聚乙二醇化(PEG)幹擾素α2a。優選的是，按照本發明的溶液每毫升含有106-108、特別是1－36×106國際單位(IU)的幹擾素α。
本發明製劑中使用的非離子洗滌劑的例子有吐溫，例如吐溫20或吐溫80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯)。本發明溶液中洗滌劑的量約為0.01-0.5mg/ml，優選0.05-0.2mg/ml。優選的緩衝物質是乙酸銨和乳酸鈉。這些緩衝物質的適宜濃度約為10-15毫摩爾濃度。優選的是，把本發明的幹擾素溶液調至pH5.0±0.1。本發明溶液中苄醇含量約為8-20mg/ml，特別是10mg/ml。可以特別考慮的等滲劑有氯化鈉、甘露糖醇、甘油和胺基酸，特別是精氨酸、賴氨酸、組氨酸和蛋氨酸，以及乙醇胺。氯化鈉或甘露糖醇是優選的。達到等滲所需的這些輔助劑的量取決於溶液的組成，並且可用常規技術確定。
用下列實施例進一步闡述本發明。
實施例1PEG-IFNα2a的製備PEG化用10升由含120mM NaCl的5mM乙酸鈉pH5.0組成的緩衝液透析IFNα2a兩次。用摩爾比為3∶1的固體PEG試劑α-甲基-ω-〔2-〔〔(3-甲基-2-吡啶氧基)羰基〕氨基〕乙氧基〕聚(氧基-1，2-亞乙基)SRU 110將1g材料(7.26mg/ml)PEG化。加入1/10體積的100mM四硼酸鈉(pH10.7)，調節溶液的pH。室溫下保溫1小時後，加入1M甘氨酸至甘氨酸最終濃度為20mM，這樣來終止反應。加入1/20體積的pH為.0的1M乙酸鈉，最終pH達5.0-6.0。用由40mM乙酸銨(pH4.5)組成的緩衝液將蛋白質溶液稀釋4倍。純化以19ml/min流速向用40mM乙酸銨(pH4.5)平衡過的333mlCM纖維素柱上加入稀釋的PEG化混合物。用8個柱體積的0-250mM NaCl梯度洗脫PEG化幹擾素。按照SDS-PAGE結果，收集含PEG-IFN的級分。最終收集液含291mg，濃度為0.831mg/ml。收集的材料通過採用YM10(截留分子量10000)膜的Amicon攪拌細胞超濾單元濃縮至3.96mg/ml。
把濃縮材料(238mg)加到用40mM乙酸銨和125mM NaCl平衡過的6.3LS-200凝膠過濾柱上。流速為20ml/min。收集級分，用SDS-PAGE分析。S-200柱收集物含有480ml，濃度為0.48mg/ml。S-200柱收集物的一份等分試樣用Amicon攪拌細胞濃縮至8.7mg/ml。該材料用於製備實施例4和5的製劑。
實施例2幹擾素溶液組分 每毫升的量幹擾素α2a1-36×106IU乙酸銨0.77mg氯化鈉7.21mg苄醇 10.0mg吐溫800.2mg乙酸達pH 5.0±0.1 適量NaOH0.1N達pH5.0±0.1 適量注射用水 達1.0ml生產方法無菌條件下，在帶螺帽的50ml無菌聚丙烯管中的層流界面中製備製劑。賦形劑溶於注射用水中，調節pH，溶液中通入氮氣。接著，在緩慢攪拌下加入幹擾素本體溶液，如需要，再調pH，並且加入注射用水調至終體積。用低蛋白結合0.2μm過濾器把溶液無菌過濾到新的聚丙烯管中，注入2ml I型小玻璃瓶中。向小瓶中通入氮氣，用丁基橡膠瓶塞密封，該瓶塞是用惰性氟代聚乙烯膜壓製成的。
實施例3幹擾素溶液組分 每毫升的量幹擾素α2a 1-36×106IU乙酸銨 0.77mg甘油 20.0mg苄醇 10.0mg吐溫80 0.2mg乙酸達pH5.0±0.1 適量NaOH0.1N達pH5.0±0.1 適量注射用水 達1.0ml生產方法如實施例2中所述。
實施例4幹擾素溶液組分 每毫升的量PEG-幹擾素α2a 1-18×106IU乙酸銨 1.0mg氯化鈉 5.0mg苄醇 10.0mg吐溫80 0.05mg乙酸達pH5.0±0.1 適量NaOH0.1N達pH5.0±0.1 適量注射用水 達1.0ml生產方法如實施例2中所述。
實施例5幹擾素溶液組分 每毫升的量PEG-幹擾素α2a 1-18×106IU乙酸銨 1.0mg氯化鈉 3.0mg甘露糖醇 30.0mg苄醇 10.0mg吐溫80 0.05mg乙酸達pH5.0±0.1 適量NaOH0.1N達pH5.0±0.1 適量注射用水 達1.0ml生產方法如實施例2中所述。
為比較的目的，按照實施例2中給出的生產方法製備含3×106IU IFNα2a(A/3)、6×106IU IFNα2a(A/6)、9×106IU IFN α2a(A/9)、18×106IU IFNα2a(A/18)和36×106IU IFNα2a(A/36)的各種幹擾素α2a溶液以及不含苄醇的相應溶液(B/3-36)，並於5、25和35℃下貯藏於暗處。貯藏3個月後，測定小瓶中幹擾素α2a含量。通過0.45μm過濾器過濾樣品，並用反相HPLC分析殘留的主要成分幹擾素α2a。HPLC法的標準偏差大約為5％。貯藏試驗的結果列於表1。
表1溶液/下列溫度下3個月後，主要成分IFNα2 a的含量x106IU IFN (以％計)α2a每ml.
5℃25℃35℃A/393.8 60.743.5A/691.2 73.954.6A/994.1 80.361.6A/18 94.1 84.569.0A/36 91.9 88.571.1B/381.0 41.08.2B/688.9 55.18.5B/989.1 63.325.8B/18 92.2 62.826.8B/36 95.2 72.841.2
非常明顯，在更高的貯藏溫度下，溶液A的貯藏穩定性越高。
類似地，製備實施例4的含3×106IU聚乙二醇化幹擾素α2a的聚乙二醇化IFN溶液(C/3)和相應的不含苄醇的溶液(D/3)，在5和25℃下貯藏24個月。貯藏試驗的結果列於表2。
表2溶液/下列溫度下24個月後，主要成分PEGx106PEGIUIFN IFNα2a的含量(以％計)α2a每ml 5℃25℃C/379.6 55.8D/360.1 5.8從這些實驗明顯看出，加入苄醇而製備的溶液的貯藏穩定性更高。
實施例6如上面所提及的，不含HSA的幹擾素溶液公知於國際專利申請WO89-04177和日本專利公開61-277633。把本發明溶液的穩定性與類似於已知溶液而製備的幹擾素α2a溶液的穩定性進行比較。製備下列組成的溶液溶液X幹擾素α2a3-36×106IU乙酸銨0.77mg氯化鈉8.77mg吐溫800.3mg乙酸達pH5.0±0.1 適量NaOH0.1N達pH5.0±0.1 適量注射用水 達1.0ml溶液Y幹擾素α2a3-36×106IU琥珀酸0.27mgDi-琥珀酸鈉 0.73mgD-甘露糖醇40.0mg土溫800.1mgHCl0.1N達pH5.0±0.1 適量NaOH0.1N達pH5.0±0.1 適量注射用水 達1.0ml溶液X和Y相當於上面文獻中所述的溶液，採用3，6，9，18和36×106IU幹擾素α2a代替幹擾素β或幹擾素β。各種貯藏溫度下3個月後所得結果列於下表3中。
表3溶液/下列溫度下3個月後，主要成分IFNx106IUIFN α2a的含量(以％計)α2a5℃25℃35℃X/3 72.5 13.70.0X/6 72.8 3.1 0.0X/9 83.7 42.61.7X/18 86.5 50.52.6X/36 88.0 54.14.5Y/3 67.1 32.70.0Y/6 80.0 53.50.0Y/9 84.9 63.44.3Y/18 89.0 59.513.7Y/36 90.7 60.018.9從這些數據清楚地看出，當把上面提到的技術水平的文獻中所述的技術用於幹擾素α2a時，不能達到可接受的貯藏穩定性。
權利要求
1.一種幹擾素水溶液，含有(a)一種幹擾素α；(b)一種非離子洗滌劑；(c)一種調節pH在4.5-5.5的緩衝液；(d)苄醇；以及，可選擇地(e)一種等滲劑。
2.一種根據權利要求1的幹擾素溶液，其中幹擾素α的量為106-108IU/ml；非離子洗滌劑的量約為0.01-0.5mg/ml；緩衝液濃度約為10-15毫摩爾濃度；苄醇的量約為8-20mg/ml。
3.一種根據權利要求1或2的幹擾素溶液，含有(a)幹擾素α2a或聚乙二醇-幹擾素α2a；(b)聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯；(c)乙酸銨或乳酸鈉；(d)苄醇；以及(e)氯化鈉、甘露糖醇、甘油、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、蛋氨酸或乙醇胺。
4.一種根據權利要求1或2的幹擾素溶液，每ml含有(a)1-36×106IU的幹擾素α2a；(b)0.2mg聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯；(c)10mM乙酸銨或乳酸鈉；(d)10mg苄醇；以及(e)用量足以提供一種等滲溶液的氯化鈉。
5.一種根據權利要求1或2的幹擾素溶液，每ml含有(a)1-36×106IU聚乙二醇-幹擾素α2a；(b)0.05mg聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯；(c)13mM乙酸銨；(d)10mg苄醇；以及(e)用量足以提供一種等滲溶液的氯化鈉或甘露糖醇。
6.一種根據權利要求1-5任一項的幹擾素溶液，pH為5.0±0.1。
全文摘要
一種幹擾素水溶液，含有(a)一種幹擾素a；(b)一種非離子洗滌劑；(c)一種調節pH在4.5-5.5的緩衝液；(d)苄醇；以及，可選擇地(e)一種等滲劑。
文檔編號A61K47/26GK1141808SQ9610054
公開日1997年2月5日 申請日期1996年4月4日 優先權日1995年4月6日
發明者G·格羅斯, S·D·特佐, S·K·庫瑪 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司