一種基於MPN與PCR的食品中沙門氏菌快速定量方法與流程
2023-09-15 19:40:40 4
本發明屬於檢測領域，涉及沙門氏菌的檢測方法。
背景技術：
沙門氏菌分布廣泛，學界共識認為該菌是食品中汙染程度最高的一類菌，在世界各地的細菌性食物中毒病例統計中，由沙門氏菌引起的案例數常佔首位或次位。迄今為止，世界範圍內已經報導的沙門氏菌血清型大於2600種。沙門氏菌導致的傷寒、副傷寒、發熱等是發展中國家最為常見的疾病，在環境衛生條件較差的地區甚至會導致死亡。有報導顯示，每年全球有大約9400萬例腸胃炎以及15.5萬例死亡病例均是由沙門氏菌導致，其中有85%是食物引起的。
在中國，沙門氏菌對食品安全的汙染同樣嚴重，作為首要的食源性致病因素，沙門氏菌導致了近70%~80%的食源性疾病。Yang等結果顯示，在全國範圍內抽檢的539份即食食品中，有19份檢出了沙門氏菌，總檢出率達3.52%，大部分陽性樣本汙染程度為0.3~10 MPN/g，部分樣本甚至汙染水平高達110 MPN/g。申請人項目組為了解本省（江西省）食品中食源性沙門氏菌汙染情況，抽檢本省13類3437份食品，並對分離的沙門菌進行血清型鑑定試驗。結果顯示，所檢3437份食品中檢出受沙門菌汙染樣本155份，沙門菌檢出率達4.51%，其中生禽肉、生畜肉中的沙門菌檢出率分別高達27.4%、13.7%，意味著，在我省平均每4份生禽肉樣本就有1份汙染了沙門氏菌。綜上所述，沙門氏菌在全國乃至世界範圍內對食品安全構成了嚴重威脅，而我省的汙染情況尤為嚴重。
常規的檢測沙門氏菌的方法為培養法，該方法涉及到前增菌、選擇性增菌培養、生化鑑定以及血清分型等後續鑑定步驟。此法雖是目前微生物鑑定和仲裁結果判定的標準方法，但通常需要花費數天的檢測時間，需要特殊的操作環境及繁瑣的步驟，且方法為定性方法，無法實現定量檢測，無法滿足食品安全風險評估等工作對食品樣本中沙門氏菌定量檢測的需要。
另外，也有研究者採用免疫學或者螢光定量的分子生物學手段實現了沙門氏菌的定量檢測，但方法定量均依賴於預設的標準曲線，一旦檢測環境、試劑、操作步驟、檢測樣本等出現改變就會導致定量結果出現偏差。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種食品及相關樣本中的沙門氏菌攜帶量（汙染量）的評估方法。
本發明所提供的方法基於MPN（Most Probable Number，最大或然數）及PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈式反應）的技術原理。所述方法不依賴於預設標準曲線，在實現沙門氏菌的定量的前提下又兼具PCR方法的快速、準確的優點。
整個檢測過程可以在兩個工作日內完成，相比傳統基於培養的方法可有效縮短檢測流程、節省工作量；相比其他沙門氏菌定量方法，本法無需建立標準曲線，規避了不同樣本及檢測環境的差異的影響。方法簡便易操作，結果準確，特別適用於食品安全風險評估等工作中對鮮活生冷等食品樣本中沙門氏菌汙染劑量或帶菌水平的快速估計。過程見圖1。
技術方案具體如下：
一種基於MPN與PCR的食品中沙門氏菌快速定量方法，包括以下步驟：（1）食品樣本的梯度稀釋；（2）菌的復甦及增菌培養；（3）DNA的提取；（4）沙門氏菌屬特異性引物PCR擴增及PCR結果檢測；（5）MPN法估計原樣本中沙門氏菌濃度；
食品樣本的梯度稀釋過程包括：稱取25g或25mL食品樣本加入225mL無菌BPW中，拍擊式均質25s或其他方式充分震搖混合，使食品樣本表面或內部可能存在的沙門氏菌散布於BPW中，靜置數秒所得上清液作為1:10樣本稀釋液。吸取1:10稀釋液1 mL，注入含有9 mL BPW的試管內，振搖試管混勻，製備1:100的稀釋液。另取1 mL滅菌吸管，按上條操作依次製備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管；
菌的復甦及增菌培養過程包括：根據對檢樣汙染情況的估計，選擇三個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度接種3支含有9mL BPW的試管，每管接種1 mL。置36 ℃±1 ℃恆溫箱內，培養8 h～18 h；
DNA的提取過程包括但不限於：分別取上述增菌液1 mL，8000 r/min離心，棄去上清液以去除有機酸等細菌代謝產物對PCR的不利影響，無菌水重懸後採用玻璃珠法、磁珠法、微柱法或有機溶劑萃取法提取並純化細菌DNA；
沙門氏菌屬特異性引物PCR擴增及PCR結果檢測步驟包括但不限於：將前述步驟得到的DNA樣本作為模板，以沙門氏菌屬特異性引物進行PCR擴增，擴增可直接採用或螢光定量PCR法或PCR-電泳法或在擴增體系中加入不影響擴增的DNA染料，擴增後直接於激發光下觀察螢光強度以確證每份擴增中是否有PCR擴增產物的存在；
MPN法估計原樣本中沙門氏菌濃度步驟包括：根據PCR為沙門氏菌陽性的試管管數，查MPN檢索表（附表1）或通過MPN軟體，報告每g（mL）食品樣品中沙門氏菌的MPN值。
有益效果
本發明相比現有技術具有如下優點：
1、本發明所述方法省時省力，有效縮短了檢測流程及檢測人員工作量。
2、本發明所述方法結合了MPN法及PCR法，實現了食品及相關樣本中沙門氏菌的定量化，且定量不依賴於標準曲線，結果受檢測條件等影響小，準確可靠。
3、採用非選擇性、低營養含量的培養基進行增菌，既有效防止樣本中攜帶的微量死菌DNA引起的假陽性現象，也能有效復甦「活的不可培養」狀態的沙門氏菌，避免導致假陰性結果帶來的定量不準。
附圖說明
圖1是檢測流程圖
圖2是本方法在不同牛奶樣本中加標回收實驗結果圖。
具體實施方式
實施例1
1、樣本預處理（生肉樣本為例）
用無菌剪刀與無菌鑷子剪取生肉樣本有代表性部位樣品25 g置於盛有225 mL BPW（緩衝蛋白腖水）的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min～2 min，製成樣本1:10稀釋液。如樣本為冷凍產品，應在45 ℃以下不超過15 min，或2 ℃～5 ℃不超過18 h解凍。
用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1 mL，注入含有9 mLBPW的試管內，振搖試管混勻，製備1:100的稀釋液。
另取1 mL滅菌吸管，按上條操作依次製備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1 mL滅菌吸管。
根據對檢樣汙染情況的估計，選擇三個連續的適宜稀釋度，每個稀釋度接種3支含有9mL BPW的試管，每管接種1 mL。置36 ℃±1 ℃恆溫箱內，培養8 h～18 h。
、增菌液核酸提取
取培養後增菌液1 mL，8000 r/min離心，棄去上清液以去除有機酸等細菌代謝產物對PCR的不利影響，無菌水重懸至108~109 CFU/mL(約0.5~1 OD)。
取1 mL菌懸液，加入玻璃珠少許，充分旋轉混合震搖1 min，於沸水浴中加熱10min。13000 r/min，離心10 min。
將上清液小心地移至新的潔淨1.5ml離心管，作為後續PCR反應模板。如有必要，可進一步用微柱、磁珠等商業化產品進行純化，以去除PCR反應抑制物。該模板可以4 ℃存放過夜，若長久保存需-20 ℃凍存。
、PCR螢光定量擴增
對步驟2中提取到的核酸進行PCR螢光定量檢測。為確保檢測方法的特異性，避免假陽性結果的出現，選擇屬間特異性高、屬內敏感度好的基因序列擴增是十分有必要的。本發明根據沙門氏菌的invA基因實施檢測，採用的引物序列為：F:CGCCCTGTCTACTTATACATGCT; R:GGTCAAAATAGCCGTAACAACCAATAC。擴增片段長度為190 bp。
螢光定量PCR的反應體系如下(25 μL)：
SYBR Premix Ex Taq (2×) 12.5 μL，上、下遊引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ(50×) 0.5 μL，DNA模板5.0 μL，dd水6.0 μL
擴增條件如下：
（1）預變性：95℃，30 s;
（2）變性: 95℃，10 s；
（3）退火、延伸：60℃，40 s；
（4）（2）~（3）步驟擴增40個循環，在每個循環的60℃延伸後收集螢光信號。
（5）完成最後一個循環後，採用熱熔解曲線法檢驗擴增為特異性的。
本擴增體系中，將Ct值小於等於35的擴增算作陽性結果。
、 MPN法估計樣本中沙門氏菌含量
根據步驟3中，螢光定量PCR的檢測結果。統計每個稀釋度中陰性結果和陽性結果個數，查MNP表來計算得到沙門氏菌的個數，MNP表見附表1。跟據相應稀釋度換算後查表所得數值即為每克（毫升）原樣本中沙門氏菌含量。
附表1 最可能數（MPN）檢索表
每g（mL）檢樣中沙門氏菌最大可能數（MPN）檢索表
、加標回收實驗
申請者採用傳統國標法篩選出10份不含沙門氏菌，但含有其他高背景微生物的生牛乳樣本。
在上述10份生牛乳中分別添加平板計數後的純培養沙門氏菌至濃度為每毫升（生牛乳）：6.0×100、6.0×101、6.0×102、6.0×103、6.0×104、6.0×105。
按照本發明所述方法分別對這10份生牛乳沙門氏菌含量進行測定，得到每毫升生牛乳中沙門氏菌的含量。將測得的沙門氏菌含量結果（計算每個加標濃度下的平均值及各樣本間標準差）以原始添加濃度為因變量作圖，見附圖2。
從附圖2可以看出，通過本發明建立的方法和標準添加的沙門氏菌量有極高的相關性，R2=0.9918，相同加標濃度下不同牛奶樣本檢測結果偏差也較小。說明本方法在不同樣本及不同的沙門氏菌菌含量時均具備較高的準確度。