一種dna低溫保存溶劑及其保存方法
2023-09-16 10:48:05 1
專利名稱：一種dna低溫保存溶劑及其保存方法
技術領域：
本發明涉及一種DNA (deoxyribonucleic acid,脫氧核糖核酸)的保存,特別是涉及一種DNA低溫保存溶劑及其保存方法。
背景技術：
DNA是染色體的重要組成充分，是遺傳信息的載體，含有物種個體的遺傳信息，是最重要的生物信息分子，可用於構建基因組文庫、分離所需的基因和檢測相關的分子標記等。基因組DNA是沒有組織特異性的，即無論從何種生物組織製得的DNA都是一樣的。由於DNA所含的遺傳信息量大，並且容易獲取，具有極其穩定的化學性質，是目前種質資源和遺傳資源收集和保存的主要內容之一。DNA分子的序列結構具有三個重要特性:(I)不同個體序列不一樣；(2)終生不變；同一生物各不同部位細胞中的DNA序列相同。因此DNA分子本身具備檔案的特性，即具有長期穩定性、信息屬性、個體特異性和可以備查的屬性。實際上，在疾病基因組學、藥物基因組學、群體遺傳學和進化等研究領域，DNA是最可靠的證據和研究過程的基本材料，被廣泛應用。同時生命科學研究者日益認識到保存DNA對於今後系統生物醫學的發展的重要性，各國紛紛開始保存DNA。世界上最早開始實施大規模DNA保存的是冰島的Decode公司，全部DNA樣本極其相關資料來自於將近1/3的冰島成年人和90%以上的冰島老年人。利用其建立的生物樣本庫，Decode找到了心肌梗塞等20多種疾病的致病基因。隨後英國、美國、以色列等國家研究單位建立了類似的遺傳資源樣本庫，並且以色列對外銷售這些資料齊全的人DNA樣本。
為了維持DNA結構的完整性，避免DNA大規模斷裂和降解，DNA最佳保存方法是乾粉_80°C或者液氮低溫保存，但要製成乾粉則需要大量的DNA，取材困難，在實際DNA樣本資源收集中不具有操作性。而用無水乙醇保存DNA，雖然可以事先分裝保存，但也存在反覆凍融問題。而固相DNA保存技術是最近提出的新概念，適用於永久保存，並且這種方法的保存基質是否影響DNA後續實驗、保存具體效果，目前無這方面的任何數據，尚有待時間考驗。並且對於保存期間需要多次使用的樣本，需要重新提取DNA，操作複雜，並且容易導致DNA斷裂，將導致一些對DNA質量要求高的檢測實驗無法進行。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種DNA保存溶劑及其保存方法。利用該DNA保存溶劑，可以很簡單地、長期保存DNA，並且DNA提取方便、避免DNA的反覆凍融、成本低廉，為今後基因組學研究、身份鑑別、基因診斷、基因治療、器官移植等提供最原始的DNA記錄。為解決上述技術問題，本發明的DNA保存溶劑，其組分包括:所述小牛血清的終體積為0.1% 1% ;甘油的終體積為10% 24%，優選15% ;二甲基亞碸終濃度為30% 50 %，優選30 %;甜菜鹼的終濃度為IM 7M，優選5M ；TE緩衝液的終濃度為I X 5 X TE，pH是6 8。
上述甘油、二甲基亞碸和甜菜鹼作用主要是維持液態環境。另外，本發明的DNA保存方法，包括步驟:(I)提取 DNA;其中，該DNA可從生物的任何細胞、按照常規的提取方法進行提取及純化；(2)將DNA溶於如上所述的DNA保存溶劑中進行保存。其中，DNA保存的最終濃度可以為0.1 10μ g/L，如6μ g/L左右，優選I 3 μ g/L。如DNA保存濃度很低，如直接大用量實驗，保存溶劑中高濃度的二甲基亞碸和甘油有可能影響後續的實驗，而高保存濃度的DNA在實際應用中需要進一步稀釋後才能實驗，不影響後續實驗。所述保存溫度 可以為-20°C _196°C。與傳統的DNA保存技術相比較，本發明具有如下優點:(I)製作簡單、成本低廉，只需要低溫冰凍保存即可；(2)由於含有保護溶劑，使得DNA—直處於液態環境中，避免機械切割力損害，從而能有效地防止DNA降解，因此，DNA保存效果好、保存期長。(3)由於DNA保存於液態環境中，從冰箱或液氮中拿出來後，不需溶解，就可直接取樣或分裝，從而避免了反覆凍融。因此，本發明能長期低溫保存DNAjB 20年以上。
具體實施例方式以下實施例中的甘油、二甲基亞碸、TE中的組分(Tris鹼、HC1、EDTA)、甜菜鹼都是
市售產品。
附圖是實施例3的基因組DNA電泳圖，其中，孔I為實施例3中按照實施例1保存的DNA，孔2為實施例3中按照實施例1保存的DNA，孔3為DNA分子標記。實施例1一、樣本DNA的提取採用FlexiGene DNA Kit(QIAGEN, Cat.N0.51206)試劑盒抽提小鼠外周血中的基因組DNA。具體步驟如下:向300 μ I血液樣本中加入750 μ I Buffer FGl，上下顛倒5次使其混勻。接著在12，OOOrpm轉速下離心Imin0離心後倒掉上層清液，再加入150 μ IBuffer FG2及1.5 μ I蛋白酶溶液，立即振蕩，直至沉澱完全溶解。接下來離心3 5s，然後65°C水浴5min。當溶液從紅色變為橄欖綠色後，加入150 μ I 100%異丙醇，上下充分顛倒離心管，使其混合，直至DNA析出，呈肉眼可見的線狀或塊狀。然後在12，OOOrpm轉速下離心3min。離心後倒掉上層清液，再加入150 μ I 70%乙醇,並振蕩5s。接著重新在12，OOOrpm轉速下離心3min,離心後倒掉上層清液，自然風乾沉澱，直至所有的液體都蒸發掉。二、保存向上述含有DNA的離心管中加入500 μ I的DNA冰凍保存溶劑後，37°C過夜，保證DNA充分溶解，然後於-80°C冰箱保存。
其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為:終體積為15 %的甘油、終濃度為IXTE(pH7.6)、終濃度為5mol/L的甜菜鹼、終濃度為30%的二甲基亞碸。實施例2採用實施例1中的DNA抽提方法，抽取實施例1的小鼠外周血300 μ I進行DNA抽提，然後向含有該DNA的離心管中加入500μ I的IXTE (pH7.6)，37°C過夜，保證充分溶解後，於-80°C冰箱保存。實施例3實施例1和實施例2中的DNA保存I個月後，每個工作日的10點和16點將實施例I和實施例2保存的DNA取出，置於37°C溫箱15分鐘，使實施例1和實施例2中的DNA充分溶解後，然後-80度保存，連續反覆凍融4月，進行加速實驗。各取反覆凍融4個月後，取按照實施例1和實施例2保存的DNA 3 μ 1，用0.8%(0.8g/100ml)瓊脂糖進行電泳鑑定，電泳結果如說明書附圖所示。從電泳圖中看出，實施例1保存的DNA經過連續4個月反覆凍融後，孔I電泳結果顯示基因組DNA未降解；而實施例2保存的DNA經過連續3個月反覆凍融後，孔2電泳結果顯示基因組DNA —片彌散，降解明顯。實施例4採用實施例1中的DNA抽提方法，將得到的小鼠肝臟DNA中加入DNA冰凍保存溶齊IJ，使DNA的最終濃度為2 μ g/L, 37°C過夜，保證DNA充分溶解，然後於_20°C冰箱保存。其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為:終體積為25 %的甘油、終濃度為I X TE (pH6)、終濃度為6mol/L的甜菜鹼。 本實施例中所保存的DNA分子結構無破壞，能滿足下遊實驗(如PCR、基因晶片等)需要。實施例5採用實施例1中的DNA抽提方法，將得到的培養皿細胞DNA中加入DNA冰凍保存溶劑，使DNA的最終濃度為3 μ g/L, 37°C過夜，保證DNA充分溶解，然後於_196°C保存。其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為:終體積為80 %的甘油、終濃度為5 X TE (pH8)、終濃度為lmol/L的甜菜鹼。本實施例中所保存的DNA分子結構無破壞，能滿足下遊實驗(如PCR、基因晶片等)需要。實施例6採用實施例1中的DNA抽提方法，將得到的人肝臟DNA中加入DNA冰凍保存溶劑，使DNA的最終濃度為10 μ g/L, 37°C過夜，保證DNA充分溶解，然後於_120°C保存。其中，DNA冰凍保存溶劑的組成為:終體積為60 %的甘油、終濃度為2XTE(pH7.5)、終濃度為5mol/L的甜菜鹼。本實施例中所保存的DNA分子結構無破壞，完全能滿足下遊實驗(如PCR、基因晶片等)需要。
權利要求
1.一種DNA保存溶劑，其特徵在於:該DNA保存溶劑的組分包括:小牛血清、甘油、TE緩衝液、二甲基亞碸、甜菜鹼。
2.如權利要求1所述的DNA保存溶劑，其特徵在於:所述小牛血清的終體積為0.1% I %，甘油的終體積為10% 24%，二甲基亞碸終濃度為30% 50%，甜菜鹼的終濃度為IM 7M，TE緩衝液的終濃度為IX 5XTE，pH是6 8。
3.如權利要求1和2所述的DNA保存溶劑，其特徵在於:所述TE緩衝液的終濃度為ΙΧΤΕ,ρΗ 值為 7.6。
4.如權利要求1 和2所述的DNA保存溶劑，其特徵在於:所述甜菜鹼的終濃度為5mol/L0
5.如權利要求1和2所述的DNA保存溶劑，其特徵在於:所述甘油的終濃度為15%。
6.如權利要求1和2所述的DNA保存溶劑，其特徵在於:所述二甲基亞碸的終濃度為30%。
7.如權利要求1-6任意一項所述的DNA保存方法，包括步驟: (1)提取DNA ； (2)將DNA溶於如權利要求1所述的DNA保存溶劑中進行保存。
8.如權利要求5所述的DNA保存方法，其特徵在於:所述保存溫度為_20°C _196°C。
9.如權利要求5所述的DNA保存方法，其特徵在於:所述DNA保存的最終濃度為0.1 10 μ g/Lo
10.如權利要求9所述的DNA保存方法，其特徵在於:所述DNA保存的最終濃度為I .3 μ g/Lo
全文摘要
本發明公開了一種DNA低溫保存溶劑及其保存方法，該DNA保存溶劑的組分包括小牛血清、甘油、TE緩衝液、二甲基亞碸、甜菜鹼。其中，小牛血清的終體積為0.1％～1％，甘油的終體積為10％～24％，二甲基亞碸終濃度為30％～50％、甜菜鹼的終濃度為1M～7M，DNA保存溶劑pH範圍為6.0～8.0。該DNA保存方法，包括步驟(1)提取DNA；(2)將DNA溶於DNA保存溶劑中進行保存。本發明操作簡單、成本低廉，而且DNA保存效果好、保存期長，並能避免反覆凍融，為科學研究、身份鑑別、醫療診斷提供最完整的DNA。
文檔編號C12N15/10GK103173433SQ20111044229
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優先權日2011年12月26日
發明者郜恆駿, 盛海輝 申請人:上海芯超生物科技有限公司