梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒及其製備方法
2023-09-16 15:08:20 2
專利名稱：梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，尤其是涉及一種梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒及其 製備方法。
背景技術：
梅毒(Syphilis)是一種由梅毒螺旋體(Tr印onema pallidum, TP)引起的性傳播 性疾病，其病原體是梅毒螺旋體，屬螺旋體科。梅毒螺旋體主要通過性接觸、輸血、創口或者 胎盤等途徑傳播。梅毒螺旋體從感染區附近的淋巴結進入血液，播散全身，使機體幾乎所有 的組織及器官受累，臨床表現為全身性，可分為不同臨床階段，包括一期、二期、三期和潛伏 期。世界衛生組織(WHO)曾樂觀地預言「由於有高敏度檢測方法和高效的治療方案，梅毒 是一種能夠通過公共衛生措施得到成功控制的性傳播性疾病」。遺憾的是，至今梅毒依然是 世界範圍的公共衛生問題，缺乏有效的行政控制措施，每年全球大約有1200萬的患者，其 中60萬孕婦患者([1]林麗蓉，楊波，潘錫濤，等.潛在的血源傳播患者梅毒血清學檢測方 法的選擇.中華醫院感染學雜誌.2010,20(10) :1491-1494)。事實上，梅毒的感染現狀可 能要比想像中的更讓人悲觀。調查發現，梅毒感染者已經較廣泛地存在於普通人群中。梅毒螺旋體尚不能進行體外培養，梅毒診斷與流行病學調查主要依賴於血清學試 驗，包括特異性抗體和反應素檢測兩大類型。梅毒特異性抗體IgM(TP-IgM)和IgG(TP-IgG) 抗體分別於2周和4周後產生，即使患者經過足夠治療，其仍能長期存在，甚至終身不消 失([2]林麗蓉，但冰，付左根，等.潛在血源傳播患者梅毒血清學TRUST/TPPA與IgM抗體 聯合檢測.中國皮膚性病學雜誌.2010，152 (0 =446-448)；而另一種抗體物質反應素產 生較晚，一般在受感染後5 7周產生，而且晚期梅毒、梅毒治療後期以及潛伏梅毒可能 陰性，因此梅毒特異性抗體的陽性率、敏感性顯著高於反應素。TP-IgM是梅毒感染後，機 體最先出現的特異性抗體。只要有活的梅毒螺旋體存在，其TP-IgM將會維持在一定的水 平。MartinaH 等([3]MartinaH, Daan W N, Mart Μ, et al. Comparison of a Treponema pallidum IgM immunoblot with a 19Sfluorescent treponemal antibody absorption test for the diagnosis of congenital syphilis[J]. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2007, 59 :61-66.)認為TP-IgM是梅毒早期感染並活動的一項血清 學標誌，李步榮等([4]李步榮，賀軍濤，張毅，等.梅毒螺旋體IgM抗體檢測的臨床意義 [J].第四軍醫大學學報，2007，觀(16) :1495-1497)認為TP-IgM與TP-DNA —樣，代表著梅 毒傳染性指標。在排除近期抗梅毒治療的前提下，TP-IgM若不轉陰，提示體內可能殘存梅 毒螺旋體或治療不徹底。TP-IgM陰轉者隨訪時再轉陽性，表明再次感染梅毒([5]RaWStr0n SA, Mehta S，Bromberg K，et al. Evaluation of a Treponema pallidum2specificIgM enzyme immunoassay and Treponema pallidum western blot antibody detection in thediagnosis ofmaternal and congenital syphilis [J]. Sex Transm Dis，2004， 31 (2) :123-126)。儘管TP-IgM陰性不能完全排除傳染性，但TP-IgM陽性必定提示該患者具有傳染性。TP-IgG的出現要遲於IgM，能長期存在，甚至終身不消失，因此，TP-IgG 是梅毒診斷和流行病學調查的一項重要指標( ]Li-Rong Lin, Zuo-Gen Fu, Bing Dan, Guang-Jun Jing,Man-Ii Tong,De-TengChen,Yang Yu,Chang-Gong Zhang,Tian-Ci Yang, Zhong-Ying Zhang. Development of a co1Ioidalgo1d-immunochromatography assay to detect Immunoglobulin G Antibodies to Treponemapallidum with TPN17 and TPN47. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 2010,68 :193-200.)。早期的血清學方法使用完整梅毒螺旋體作為抗原，研究和診斷用的TP是以TP感 染兔睪丸獲得，這種方法存在花費大、獲得的TP量少且不純(混有宿主蛋白)、與其他病原 體存在交叉反應等缺點，因此假陽性也時有發生。隨著分子生物學技術的普及及梅毒螺旋 體抗原的相繼克隆，將重組抗原應用於梅毒實驗已經越來越多。目前研究比較多的TP抗 原有 TPNl7、TPN47、TPNl5、TPN44. 5、TPN36、TP0453、TP0684 及 TPr 家族。採用重組 DNA 技 術製備的重組抗原可以克服完整TP抗原的缺點，能快速、經濟地製備無限量特異重組TP抗 原。梅毒特異性抗體檢測方法包括梅毒螺旋體特異性抗體明膠凝集試驗(TPPA)、 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、螢光密螺旋體抗體吸收試驗(FTA-ABS)及免疫印跡技術 (Western-Blot)等，其特異性均較高。一般地，TPPA，ELISA作為臨床初篩，當血清學陽性， 或臨床診斷有困難時，需要採用FTA-ABS &Wfestern-bl0t作為確認試驗。其中，FTA-ABS需 要螢光顯微鏡，而且其結果判斷需要訓練有素和較豐富經驗的專業人員才能完成，因此，其 應用推廣受到一定的限制。採用Western-blot方法製成的試劑盒，一般常規實驗室均可完 成，不需要特殊設備，判讀也簡單明了。現市售的Western-blot試劑均為進口試劑，價格昂
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發明內容
本發明的目的是提供一種梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒及其製備方法。本發明所述梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒設有載體板、硝酸纖維膜、梅毒特 異性總抗體檢測線、對照線，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在 梅毒特異性總抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人總抗體；辣根過 氧化物酶標記抗人Ig抗體。所述梅毒特異性重組抗原可為TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47等。所述載體板可採用PVC板。所述梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的製備方法，包括以下步驟1)製備梅毒特異性重組抗原採用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，並插入大腸桿菌中使其 表達，得梅毒特異性重組抗原；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜總檢測線上包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人Ig抗 體，晾乾；3)製備抗人Ig單克隆抗體以人Ig為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人Ig單克隆抗體的雜交瘤細胞株；4)抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記採用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記；5)製備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設在 硝酸纖維膜上；在梅毒特異性總抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被 人Ig抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人Ig抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性總 抗體免疫印跡試劑盒。在步驟1)、2)、5)中，所述梅毒特異性重組抗原為TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、 TPN47 等。在步驟2)中，所述梅毒特異性重組抗原和人總抗體的濃度可為1 ％ig/mL ；點樣 量可為1 μ L/cm。在步驟3)中，採用ELISA的方法鑑定McAb效價在1 IO7以上。在步驟4)中，所述辣根過氧化物酶的底物可由0.03% (W/V)的過氧化氫和 0. 07% (W/V)的二氨基聯苯胺組成。本發明提供了一種採用免疫印跡技術建立梅毒特異性總抗體檢測試劑盒，可用於 全血、血清、血漿及腦脊液等標本中梅毒特異性總抗體的檢測。該檢測方法所需的標本量極 小，不需要特殊儀器，肉眼直接判讀結果，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠， 成本低，應用廣泛。
圖1為本發明所述梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒中膜條實施例的結構組成 示意圖。圖2為實驗結果模式示意圖。在圖2中，I為使用前的示意圖，H為無效試驗(產 品質量問題)，G為陰性結果，A F為TP-總抗體陽性結果；2為梅毒特異性TPN-15-總抗 體檢測線，3為梅毒特異性TPN-17-總抗體檢測線，4為梅毒特異性TPN-37-總抗體檢測線， 5為梅毒特異性TPN-44. 5-總抗體檢測線，6為梅毒特異性TPN-47-總抗體檢測線，7為對照 線。
具體實施例方式以下實施例將結合附圖對本發明作進一步的說明。參見圖1，本發明所述梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒實施例設有載體板1、梅 毒特異性總抗體檢測線2 6，對照線7和硝酸纖維膜(NC膜)8。硝酸纖維膜8粘貼在載體板1上表面，梅毒特異性總抗體檢測線2 6和對照線 7依次設在硝酸纖維膜8上；在梅毒特異性總抗體檢測線處分別包被梅毒特異性重組抗原 TPNl5, TPNl7, TPN37、TPN44. 5 和 TPN47，在對照線 7 處包被人 Ig 抗體。所述載體板採用PVC板。所述梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的製備方法，包括以下步驟1)製備 TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5 和 TPN47 梅毒特異性重組抗原
採用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，並插入大腸桿菌中使其 表達，得TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5和TPN47梅毒特異性重組抗原。2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜總抗體檢測線上包被TPW5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47梅毒 特異性重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體，晾乾。3)製備抗人Ig單克隆抗體以人Ig為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人Ig單 克隆抗體的雜交瘤細胞株。採用ELISA的方法鑑定McAb效價在1 IO7以上。4)抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶(HRP)標記採用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶(HRP)標記。5)製備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設在 硝酸纖維膜上；在梅毒特異性總抗體檢測線處包被TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅 毒特異性重組抗原，在對照線處包被人總抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人Ig抗 體及其底物共同組裝成梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒。以下給出採用梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒檢測患者的臨床標本1)標本採用0. 01mol/L PBS緩衝液進行1 50稀釋。2)封閉採用5%脫脂奶粉(0. Olmol/LPBST緩衝液配製)作為封閉液，於室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內，並編號。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。於室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩衝液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結合物(採用辣根過氧化物酶 標記的抗人Ig單克隆抗體為檢測抗體)，於室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩衝液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，於室溫(18 25V )在 搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結果判斷將檢測膜條放置在結果判定模板中，風乾後判斷結果。任何蛋白靶標出 現的特異性條帶，均可判斷為陽性，確診為梅毒(見圖2)。以下給出梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的性能檢定1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應膜平整、乾淨無汙染斑點、無裂縫，膠帶無 開膠，無切斜現象。2)陽性標本符合率用TP-總抗體陽性的不同滴度的陽性參比血清各50份採 用梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比血清的確定採用 FTA-ABS(德國歐蒙公司)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比血清檢定，計算陽性符合率。陰性參比血清的確定採用TPPA(日本富士株式會社)法確定的臨床標本。4)批內差異同一批次梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，用特徵性血清檢測， 要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，用特徵性血清檢測， 要求陽性血清檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性血清檢測的結果陰性。6)幹擾試驗檢測結果不受標本溶血(n = 50)、脂血(n = 50)和黃疸(n = 50) 的幹擾。7)交叉反應採用本梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，進行系統性紅斑狼瘡(η =30)、類風溼病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統疾病的檢測，未發現交叉反應。8)穩定性檢測應用Arrhenius法則，將梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒放置 370C 20天後檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫乾燥條件下保存，有效期為 18個月。以下給出具體實施例。實施例1將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設在 硝酸纖維膜上；在梅毒特異性總抗體檢測線處包被TPm5、TPm7、TPN37、TPN44. 5、TPN47梅 毒特異性重組抗原，在對照線處包被人總抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人Ig及 其底物共同組裝成梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒。1)標本採用0. 01mol/L PBS緩衝液進行1 50稀釋。2)封閉採用5%脫脂奶粉(0. Olmol/LPBST緩衝液配製)作為封閉液，於室溫 (18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。3)血清溫育取出所需的膜條，將其放入溫育槽內，並編號。在溫育槽中分別加入 1. 5ml已稀釋樣本。於室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。4)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩衝液清洗膜條3 次，每次5min。5)加酶結合物在溫育槽中加入1. 5ml已稀釋的酶結合物(採用辣根過氧化物酶 標記的抗人Ig單克隆抗體為檢測抗體)，於室溫(18 25°C )在搖擺搖床上溫育30min。6)清洗吸去槽內液體，在搖擺搖床上用1. 5ml 0. 01mol/L PBS緩衝液清洗膜條3 次，每次5min。7)底物溫育在溫育槽中分別加入1. 5ml底物液(DAB)，於室溫(18 25V )在 搖擺搖床上溫育IOmin。8)終止吸去槽內液體，用蒸餾水清洗膜條3次，每次lmin。結果判斷將檢測膜條放置在結果判定模板中，風乾後判斷結果。任何蛋白靶標出 現的特異性條帶，均可判斷為陽性，確診為梅毒(見圖2)。實施例2與實施例1相似，其區別在於硝酸纖維膜檢測線僅由TPW5、TPNl7, TPN37、 TPN44. 5梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPN47梅毒特異性重組抗原。結果判斷與實施例 1相同。
實施例3與實施例1相似，其區別在於硝酸纖維膜檢測線僅由TPW5、TPNl7, TPN37、TPN47 梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPN44. 5梅毒特異性重組抗原。結果判斷與實施例1相 同。實施例4與實施例1相似，其區別在於硝酸纖維膜檢測線僅由TPW5、TPNl7, TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPN37梅毒特異性重組抗原。結果判斷與實施例1 相同。實施例5與實施例1相似，其區別在於硝酸纖維膜檢測線僅由TPm5、TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPW7梅毒特異性重組抗原。結果判斷與實施例1 相同。實施例6與實施例1相似，其區別在於硝酸纖維膜檢測線僅由TPm7、TPN37、TPN44. 5、 TPN47梅毒特異性重組抗原組成，不含有TPW5梅毒特異性重組抗原。結果判斷與實施例1 相同。實施例7與實施例1相似，其區別在於待檢標本為腦脊液標本，結果判斷與實施例1相同。實施例8性能驗證試驗按實施例1的方案製備梅毒特異性IgM抗體免疫印跡試劑盒，然後 進行性能驗證。1)外觀檢查試劑盒無破損，包被反應膜平整、乾淨無汙染斑點、無裂縫，膠帶無 開膠，無切斜現象。2)陽性標本符合率用梅毒特異性總抗體陽性的不同滴度的陽性參比標本各50 份採用梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒檢定，計算陽性符合率。陽性參比標本的確定採 用FTA-ABS (德國歐蒙公司)法確定的臨床標本。3)陰性標本符合率用50份陰性參比標本檢定，計算陽性符合率。陰性參比標本 的確定採用TPPA(日本富士株式會社)法確定的臨床標本。4)批內差異同一批次梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，用特徵性標本檢測， 要求陽性標本檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標本檢測的結果陰性。5)批間差異不同批次梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，用特徵性標本檢測， 要求陽性標本檢測結果顯示色帶的顏色深淺一致，陰性標本檢測的結果陰性。6)交叉反應採用本梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，進行系統性紅斑狼瘡(η =30)、類風溼病(n = 30)、免疫性肝炎(n = 30)等自身免疫系統疾病的檢測，未發現交叉 反應。7)穩定性檢測應用Arrhenius法則，將梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒放置 370C 20天後檢測，以上各項指標無顯著變化，確保成品在室溫乾燥條件下保存，有效期為 18個月。
權利要求
1.梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，其特徵在於設有載體板、硝酸纖維膜、梅毒特異 性總抗體檢測線、對照線，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在梅 毒特異性總抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人總抗體；辣根過氧 化物酶標記抗人Ig抗體。
2.如權利要求1所述的梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，其特徵在於所述梅毒特異 性重組抗原為 TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47。
3.如權利要求1所述的梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒，其特徵在於所述載體板採 用PVC板。
4.如權利要求1所述的梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的製備方法，其特徵在於包 括以下步驟1)製備梅毒特異性重組抗原採用基因克隆技術，PCR擴增編碼梅毒螺旋體抗原的DNA，並插入大腸桿菌中使其表 達，得梅毒特異性重組抗原；2)硝酸纖維素膜的點樣在硝酸纖維素膜總檢測線上包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人Ig抗體，晾乾；3)製備抗人Ig單克隆抗體以人Ig為抗原免疫Balb/c小鼠，通過雜交瘤技術，篩選獲得穩定分泌抗人Ig單克隆 抗體的雜交瘤細胞株；4)抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶標記採用過碘酸鈉法進行辣根過氧化物酶標記；5)製備免疫印跡試劑盒將硝酸纖維膜粘貼在載體板上表面，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸 纖維膜上；在梅毒特異性總抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人Ig 抗體，用切條機切成條狀，和酶標記的抗人Ig抗體及其底物共同組裝成梅毒特異性總抗體 免疫印跡試劑盒。
5.如權利要求4所述的梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的製備方法，其特徵在於在 步驟1) >2)、5)中，所述梅毒特異性重組抗原為TPm5、TPNl7, TPN37、TPN44. 5、TPN47。
6.如權利要求4所述的梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的製備方法，其特徵在於在 步驟2)中，所述梅毒特異性重組抗原和人總抗體的濃度為1 ％ig/mL ；點樣量為1 μ L/cm。
7.如權利要求4所述的梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的製備方法，其特徵在於在 步驟3)中，採用ELISA的方法鑑定McAb效價在1 IO7以上。
8.如權利要求4所述的梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒的製備方法，其特徵在於在 步驟4)中，所述辣根過氧化物酶的底物由0.03% (W/V)的過氧化氫和0.07% (W/V)的二 氨基聯苯胺組成。
全文摘要
梅毒特異性總抗體免疫印跡試劑盒及其製備方法，涉及一種試劑盒。試劑盒設有載體板、硝酸纖維膜、梅毒特異性總抗體檢測線、對照線，梅毒特異性總抗體檢測線和對照線依次設在硝酸纖維膜上；在梅毒特異性總抗體檢測線處包被梅毒特異性重組抗原，在對照線處包被人總抗體；辣根過氧化物酶標記抗人Ig抗體。先製備梅毒特異性重組抗原，再硝酸纖維素膜的點樣，然後製備抗人Ig單克隆抗體，在標記抗人Ig單克隆抗體的辣根過氧化物酶後製備免疫印跡試劑盒。可用於全血、血清、血漿及腦脊液等標本中梅毒特異性總抗體的檢測。該檢測方法所需的標本量極小，不需要特殊儀器，且檢測簡便快速，特異性強，靈敏度高，準確可靠，成本低，應用廣泛。
文檔編號G01N33/558GK102095859SQ20111002742
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月25日 優先權日2011年1月25日
發明者劉莉莉, 張忠英, 楊天賜, 林麗蓉 申請人:廈門大學附屬中山醫院