一種編碼人類白細胞抗原a*11的新等位基因a*110104全長多核苷酸序列及其用途的製作方法
2023-09-16 09:32:50
專利名稱：一種編碼人類白細胞抗原a*11的新等位基因a*110104全長多核苷酸序列及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全長多核苷酸序列及其用途。
背景技術：
毋容置疑，器官移植與造血幹細胞移植已經成為迄今為止醫治各種器官功能衰竭、臟器惡性腫瘤和多種惡性血液病等頑症的行之有效的重要措施之一。由於供-受者間組織相容性抗原(MHC，在人類則稱人白細胞抗原(HLA))差異的主要作用，當然還有其它諸多已知與未知因素如次要組織相容性抗原(mH)、組織特異性抗原等等影響，不可避免的要發生宿主抗移植物(HVGD)和移植抗宿主病(GVHD或GVHR)，這是導致同種異體組織器官移植失敗的最根本、最重要的原因之一！因此，HVGD和GVHD已成為臨床上同種異體組織器官移植領域面臨的最大障礙！業已證實，組織器官移植後，移植物能否存活很大程度上取決於供-受體之間HLA型別是否相符。在腎臟移植中，各HLA座位的重要性依次為HLA-DRB1、HLA-B、HLA-A。在造血幹細胞移植中，HLA的匹配程度與GVHR發生的密切程度更大，一般狀況下必須選擇HLA完全相同的個體作為供者。然而在進行異基因臟器移植時，首先遇到的最大障礙就是難以尋找到一個白細胞抗原(HLA)完全相匹配的適宜供體，這已成為迄今為止似乎難以逾越和遠未得以圓滿解決的一個關鍵性問題！究其根本原因，則是由於人類主要組織相容性抗原(在人類稱為HLA)的高度複雜性、多態性(polymorphism)、多樣性(diversity)等遺傳特點所決定的。
我們知道，人類白細胞抗原是一個複合體，是人體內最為複雜和最具多態性的基因遺傳系統。迄今為止，已發現了1972個等位基因，其編碼的抗原參與機體的免疫應答、免疫反應和免疫調節，並決定組織相容性，是人體啟動一系列免疫應答與免疫反應的門戶與樞紐。在正常情況下，HLA抗原與外來抗原(如病原微生物，細菌、病毒等)結合所形成的複合物可被自身T淋巴細胞識別，引發免疫應答反應，並將病原微生物殺滅或排出體外，從而保證人體的健康。當機體出現腫瘤等疾病時，HLA可與腫瘤抗原相結合而被自身T淋巴細胞識別，從而殺傷或殺死腫瘤細胞，起到自身免疫監視的作用。當機體免疫系統出現異常時，HLA與自身正常組織的抗原結合，導致自身T細胞攻擊自身的器官或組織，從而引發自身免疫病，如糖尿病、類風溼性關節炎等。在進行器官及造血幹細胞移植時，若供受體的HLA型別不匹配，移植後將會引發移植排斥反應，從而導致移植失敗和病人死亡等嚴重後果。因此，移植前進行精細的HLA分型對於防止移植排斥反應、延長患者生命和提高移植成功率具有重要意義。另外，由於HLA抗原就如同人的指紋一樣具有個體特異性，並以單倍體緊密連鎖的方式遺傳給下一代，因此HLA在法醫學鑑定以及人類學和遺傳學研究等方面同樣具有重要意義。
應著重指出的是，為提高HLA分型的準確性、避免漏檢尚未被發現的HLA等位基因，發現和鑑定特定人群中新的HLA等位基因已成為當前國際上HLA研究領域中的重要課題和研究熱點。
自1958年法國科學家Dausset首次發現並報導了人類存在HLA現象後，直至十年後的1968年國際上才開始對HLA這一系統進行統一命名。最初僅是發現並鑑定出10個HLA-I類抗原。此後有關HLA結構與功能研究的發展是十分驚人的。現已證明，HLA複合體位於人第6號染色體短臂6p21.31，基因片段長度約4分摩或3600kb，佔人體整個基因組的1/3000。HLA複合體的結構十分複雜且具有多基因性、多態性和連鎖不平衡性。迄今為止，HLA複合體內共鑑定出224個基因座位，其中有產物表達的功能性基因為128個。39.8％的基因是與免疫系統有關，特別是II類區域中幾乎所有基因均顯示免疫相關功能。在已完成基因克隆並被命名的HLA基因座位數就已達100個之多，其中至少有18個基因座位顯示復等位性，也就是說這些基因座位還各自有數量不等的等位基因，每種等位基因編碼相應的HLA抗原產物，由此構成了人體內多態性最為豐富的基因系統。
在早期，對HLA基因產物的研究是以檢測抗原特異性的血清學為基礎的，並輔以細胞學分型的技術。而對HLA基因座位的等位基因進行系統的研究則是從1987年開始的，當時僅發現十幾個等位基因；到1989年僅兩年的時間有關HLA-I、II類等位基因的數量猛增到100個和50個；而到了1990年HLA-I、II等位基因的數量分別已達100個。隨後，有關HLA-I、II等位基因數量的揭示呈指數方式攀升。2000年HLA-I、II等位基因的數量已達1028個，2002年4月其總數達1528個。截止到2005年1月其總數高達1972個，其中A位點349個、B位點626個、C位點182個、E位點5個、F位點2個、G位點15個、DRA位點3個、DRB位點470個、DQA1位點28個、DQB1位點60個、DPA1位點22個、DPB1位點116個、DMA位點4個、DMB位點6個、DOA位點8個、DOB位點8個，此外TAP1和TAP2位點還各有7個和4個、MICA位點還有57個。由此可見，即使僅以HLA-I、II類12個主要的功能基因來計算的話，如果各個座位基因的組合是隨機的話，那麼，人群中可能出現的HLA基因型就高達108-1010個之多。因此從理論上講，在無血緣關係的隨機人群中要尋找到一個HLA基因型(等位基因型水平)完全一致的供體是十分不易的！不過，由於HLA複合體是一個緊密連鎖的基因群，這些連鎖在一條染色體上的基因很少發生同源染色體間的交換。並且在遺傳過程中，HLA單倍體是作為一個完整的遺傳單位由親代傳給子代。而且，在隨機婚配的群體中，在無新的突變和自然選擇的情況下，HLA各等位基因的頻率可代代維持不變。更況，事實上各基因並非隨機地組成單倍體。所以也就會出現在不同的地域、不同的種族、不同的民族人群中保持各自的HLA等位基因頻率。因此，也就不難理解不同的學者、不同的骨髓庫會報導出不同的無關供體間HLA相匹配的概率，諸如1/400、1/10000、1/1000000乃至於幾十萬分之一。如此看來，只要在各國、各地、各民族所建立的骨髓庫/臍血庫中儲有一定數量的供體，在無血緣關係的隨機人群中尋找到一個HLA基因型(非等位基因水平)完全一致的供體則又不是不可能的。這已被國際骨髓庫十餘年的經驗所證實。
隨著我國無血緣關係供受體移植病例的迅猛增加，發現中國人群中特有的HLA等位基因，以提高HLA配型的精確度就顯得格外重要。尤為重要的是，努力發掘中國人群中特有的HLA基因多態性，使得器官及造血幹細胞移植患者能夠更加準確地進行HLA精確配型以尋找最佳匹配供體，防止移植排斥反應發生和延長患者生命。同時，還將闡明人體中存在不同HLA抗原形式的具體意義，並且可廣泛應用於法醫學鑑定、人類種族遷移等相關研究中。
在這裡應強調指出的是，HLA-A*11抗原是最早被檢測出來的HLA抗原之一，在蒙古人種(中國人歸屬蒙古人種)、高加索人種以及黑人中的基因頻率分別為10％-30％，4％-8％和＜1％，故可被看作是中國人種的優勢特有抗原。因此，HLA-A*11新等位基因的發現對於人體免疫應答與調控、移植免疫、種族遷移研究以及法醫學鑑定等都有十分重要的意義。
發明內容
本發明的一個方面，涉及一種編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全長多核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
本發明的又一方面，還涉及所述編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104用於移植前進行精細的HLA分型的用途。
本發明的再一方面，涉及一種用於移植前進行精細的HLA分型的的試劑盒，其含有所述編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
本發明的另一方面，涉及所述編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104用於法醫學鑑定以及人類學和遺傳學研究的用途。
本發明的又一方面，還涉及一種用於法醫學鑑定以及人類學和遺傳學研究的試劑盒，其含有所述編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
本發明的再一方面，涉及所述編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104用於製備診斷或治療腫瘤和/或自身免疫疾病的藥物的用途。
圖1顯示HLA-A*110104擴增片段的瓊脂糖凝膠電泳結果。其中泳道M為DNA分子量大小Marker，泳道1為陰性對照，泳道2和3為HLA-A*110104陽性擴增結果，泳道4為HLA-A*110101的擴增結果。HLA-A*110104特異性擴增片段大小為366bp，而內對照為HLA-DRB1內含子的序列，擴增片段為796bp。從電泳結果可以看出，本發明已成功建立了HLA-A*110104的PCR-SSP分型方法。
圖2A、B、C和D顯示血清學反應格局表，其是新等位基因編碼的抗原表達於細胞膜表面，表現出與HLA-A11抗原相似的血清學反應特性的血清學檢測結果。
圖3A和圖3B為根據2個家系HLA-A，B，C，DRB1，DQB1基因分型的結果，分別繪製的家系遺傳圖譜。從家系一的遺傳圖譜來看，HLA-A新等位基因來源於父親，而且為HLA-A*11特異性，有二代遺傳，在遺傳選擇上具有一定優勢；從家系二來看，HLA-A新等位基因來源於祖母，而且為HLA-A*11特異性，有三代遺傳，在遺傳選擇上具有一定優勢。
圖4顯示為鑑定HLA-A位點新等位基因，採用位於5′及3′端非翻譯區的序列位引物進行該位點全長cDNA序列的擴增的擴增產物電泳圖。圖中M代表DNA分子量大小，HLA-A位點全長cDNA序列為1098bp，加上兩端的5′及3′端非翻譯區的序列，長度增至1323bp。從電泳圖來看，擴增片斷的大小位於2000bp與1000bp之間，與理論值相符。
圖5顯示為驗證所構建的載體中有無目標片段插入，以及插入片段的大小是否正確而對擴增質粒進行了酶切鑑定的電泳結果。從圖中可以看到，1、4、5、6、7電泳道的標本均出現酶切結果，片段大小均為1323bp。
圖6顯示為證實本發明所建細胞株均未汙染可作為永久性的標本來源，對所建細胞株進行支原體檢測的結果。
實施例以下結合具體實施例進一步闡明但不意在限制本發明的保護範圍。
本發明實施例中涉及的反應試劑按如下所述配製1)RPMT1640培養液的配製1小包裝RPMT1640(GIBCOTMInvitrogen，10.4g含L-glutamine)溶於置於三角瓶內的1000ml三蒸水至充分溶解，通入CO2使PH值達到6.0左右，此時溶液呈桔黃色，待瓶底無未溶解的顆粒，加入NaHCO32g左右，使PH值回升到7.1-7.2左右，溶液由桔黃色轉為桔紅色。在超淨工作檯內用0.45μm膜過濾滅菌、分裝，並記錄抽濾日期。抽濾後的1640培養液，在4℃放置不要時間太長，一般抽濾一次1-2月內儘可能用完，如需保存時間較長，可放在-20℃下保存。抽濾時留3-5ml檢菌(37℃，三天)2)抗菌素條件好的實驗室可以不用抗菌素。一般濃度均為10000單位/ml。青黴素1000000單位，鏈黴素1g＝1000000單位，加生理鹽水100ml溶解，過濾滅菌，分裝小瓶，-20℃保存。用時每100ml全培養液基加1ml。
3)抗凝劑採血時所用抗凝劑是肝素，一般採用每毫升血加25單位肝素。每毫升全血加肝素也可少於25單位。市售肝素鈉每2ml含12500單位，取肝素鈉0.8ml(5000單位)加生理鹽水99.2ml配成0.8％的肝素溶液。取0。8％肝素溶液0.5ml作抗凝劑，採5ml外周血後，置室溫(25℃-30℃)2-3天後轉化效果都很好。
4)穀氨醯胺稱穀氨醯胺5.846g加三蒸水200ml(濃度為200mM)，分裝成小瓶，-20℃保存。每100ml培養基加0.5ml-1.0ml。終濃度為1mM-2Mm。
5)胎牛血清美國HyClone公司生產的特級或優級FBS。購買血清時要注意是否對血清進行過內毒素、支原體、細菌和黴菌檢測，使用前還需要進行血清滅活處理(+56℃，30分鐘)。
6)1M Hepes液稱Hepes23.85g，溶解在100ml三蒸水中，用1N NaoH調到PH到7.0，抽濾滅菌，分裝小瓶，4℃保存。
7)淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque，Plus)Pharmacia(17-1440-02)產品，分裝在10ml的試管內，每管4ml，避光保存。使用前在37C水浴中加溫用前要充分搖勻，注意一定要選擇無菌、低內毒素產品。
8)環孢黴素A(Cyclosporine A)商品名Sandimem，瑞士生產。每支5ml含250mg。將5ml環孢黴素分裝成小瓶，4C保存。使用時取，濃度為50mg/ml的原液20μl加入50ml已經0.45μ膜抽濾滅菌的1640內，配製成20μg/ml的貯存液，分裝成0.4-0.8ml小管內，-20C保存。如轉化時樣品量大，也可分裝在10ml的大管中。使用時終濃度為2μg/ml。
9)Epsteim-Barr Virus(EBV)製備復甦B-958細胞株；所用培養液同細胞株的培養液相同，逐步增加培養液到所需要的毫升數時，飢餓細胞4-7天後，收集上清液，-70℃及37℃凍融3次，離心每分鐘1800轉/15分，過濾(0.2μm)，除去細胞碎片，分裝後放置-70℃冰箱內保存待用。
10)PHA國產試劑，10mg，加生理鹽水5ml，+4℃保存。
11)二甲基亞碸注意避光保存，室溫下二甲基亞碸對細胞有毒。
12)全培養基全培養基內含RFMI 1640+15％胎牛血清1％雙抗+1.6％ 1M Hepes液，需要說明的是如果培養箱不通CO2則Hepes應少加一些。通常是500ml 1640、90ml胎牛血清、6ml雙抗，6ml穀氨醯胺，9ml Hepes液。在第一次轉化每100ml全培養液中0.5ml PHA。
13)凍存液95％的胎牛血清，5％的二甲基亞碸，經0.2μm抽濾，避光保存(在4℃或-20℃)。凍存細胞時，一般1ml為一保存管為好(可控制復甦時的時間)。
實施例1 帶有HLA-A位點新等位基因的家系標本獲得及分析一、實驗標本在5000例來我室擬進行造血幹細胞移植前HLA配型的供受體中發現了2例HLA-A位點新等位基因的家系標本。為全面研究這2個新等位基因的家族遺傳史及其相關免疫遺傳特性尤其是為今後器官移植HLA配型試劑設計所需要，本研究抽取了這兩個家系祖孫三代共13人的外周血標本，分別採用肝素抗凝和EDTA抗凝。
二、DNA提取採用QIAGEN公司提供的QIAamp Blood試劑盒進行提取。取0.5％EDTA抗凝全血200μl Buffer AL，200μl PK混勻，56℃溫育10min，加入200μl無水乙醇混勻，轉移至樹脂柱，8000r/min離心1min，加入500μl Buffer AW1，1,8000r/min離心1min，加入500μl BufferAW2，8000r/min離心3min，將樹脂柱轉移至1.5ml離心管中，加入200μl Buffer AE，室溫放置1min，8000r/min離心1min，-20℃保存。
三、PCR-SSP基因分型1 HLA-A、B、C位點PCR-SSP基因分型方法採用美國PEL-FREEZ公司提供的微量SSPTMHLA-A、B、C位點SSP-PCR基因分型試劑盒。先在微量管(D-MIX管)中加入去離子水270μl，再加入7.5μl(5U/μl)的Taq DNA聚合酶，混合後取8μl加入分型板的陰性對照孔中，取80μl DNA(75-125ng/μl)加入微量管中混勻，在分型板每個反應孔中加入8μl上述混合液，陰性孔不加，用封口膜密封。將反應板置於PE-9700 PCR儀上進行PCR反應，反應參數為(96℃ 60秒)×1個循環→(96℃ 25秒 70℃ 50秒 72℃ 45秒)×5個循環→(96℃ 25秒 65℃ 50秒 72℃ 45秒)×21個循環→(96℃ 25秒 55℃ 60秒 72℃ 120秒)×4個循環。取10μl PCR反應產物加入2.0％瓊脂糖凝膠電泳孔內，電壓140V，10min，在紫外檢測儀下觀察結果，分析電泳帶格局，指定等位基因(參見圖1)。
2 HLA-DR、DQ位點PCR-SSP基因分型方法採用美國PEL-FREEZ公司提供的微量SSPTMHLA-DR、DQ位點PCR-SSP基因分型試劑盒。先在微量管(D-MIX管)中加入去離子水90μl，再加入2.5μl(5U/μl)的Taq DNA聚合酶，混合後取8μl加入分型板的陰性對照孔中，取27μl DNA(75-125ng/μl)加入微量管中混勻，在分型板每個反應孔中加入8μl上述混合液，陰性孔不加，用封口膜密封。將反應板置於PE-9700 PCR儀上進行PCR反應，反應參數為(96℃ 60秒)×1個循環→(96℃ 25秒 70℃ 50秒 72℃ 45秒)×5個循環→(96℃ 25秒 65℃ 50秒 72℃ 45秒)×21個循環→(96℃ 25秒 55℃ 60秒 72℃ 120秒)×4個循環。取10μl PCR反應產物加入2.0％瓊脂糖凝膠電泳孔內，電壓140V，10min，在紫外檢測儀下觀察結果，分析電泳帶格局，指定等位基因(參見圖1)。
四、血清學實驗為檢驗新等位基因所編碼抗原是否為功能抗原，對家系標本進行了血清學實驗。本實驗採用美國One-lambda公司生產的螢光免疫磁珠法，即取2.5ml肝素抗凝外周血與已標記好的B細胞磁珠60-100μl以及2.5ml PBS(PH7.0)混勻，放入特製磁力架上，靜置2min，吸棄所有混合液；之後加入PBS(PH7.0)4ml，混勻後靜置2min，吸棄所有混合液；重複洗滌一次；加PBS(PH7.0)調細胞濃度為2000-2500個/μl，取1μl細胞液加入已含有HLA-A，B，C抗體和兔補體的72孔反應板中，37℃作用1h；加入反應終止液，2h後螢光倒置顯微鏡下觀察結果。
血清學實驗表明，該新等位基因編碼的抗原表達於細胞膜表面，表現出與HLA-A11抗原相似的血清學反應特性，血清學結果詳見反應格局表(圖2A，B，C和D)。
實施例2.EBV轉化建立永生化細胞株為獲得永久性的標本來源，同時方便與國際間的交流與合作，本文建立了HLA新等位基因的永生化細胞株。具體過程如下.
1.採集標本如實施例1所述靜脈採血5ml，肝素抗凝，1ml血提取DNA，4ml血轉化用。
2.分離淋巴細胞4m1肝素抗凝血加2ml RPMI1640(Sigma，PH7.0)混勻，然後緩緩加入到已加有4ml淋巴細胞分離液(Ficoll-Paque，Plus，Pharmacia(17-1440-02))的10ml離心管中，2500r/min 30min；吸淋巴細胞層於另一離心管中，加入5ml RPMI1640(Sigma，PH7.0)混勻，1500-1800r/min，10min，洗3次。
3.EBV轉化向分離的淋巴細胞中加入2ml完全培養基，1.2ml EBV上清(中科院遺傳所徐久瑾教授惠贈)，0.4ml環孢酶素A(PHA 0.5％)，5％ CO2，37℃孵育。
轉化成功的標誌在EBV感染24小時，首先為淋巴細胞增大，明顯母細胞化；其次是增生的淋巴母細胞凝集現象迅速發生。在轉化3-4天後，培養液PH值發生變化，呈橙黃色。
4.培養(1)懸浮培養培養液的體積不超過培養瓶的2/3。
(2)注意培養液的PH值的變化，一般從橙紅色變化為橙黃色，如果2-3天內，PH值沒有變化，說明細胞狀態不太好；如果變化得太快，可能是加液量不夠。
(3)半量換液培養瓶內的培養液達到了瓶體積的2/3時，就需要半量換液。從培養瓶中吸取液體體積的一半量或更多一點培養液棄去，加入等量的培養液或多一點。細胞量逐漸增多，可分瓶培養，一般情況一周兩次加液或半量換液。
5.凍存細胞株凍存必要條件是細胞要達到一定的數目。當本細胞株細胞數達到300-600萬/cm3就可以凍存(用計數板計數，健康活細胞應達到90以上)。凍存前一天需加新鮮的培養液。凍存細胞離心速度不超過1000轉/分，凍存液保持4℃，細胞進入凍存液後，放置-70℃的冰箱1小時後或隔夜進入液氮櫃中保存。凍存管上應標記細胞株的名稱字母代碼、順序號數、凍存日期。
6復甦將細胞從液氮櫃中取出，放入保溫瓶或其他保溫的容器中轉移到實驗室。在37℃水浴中解凍注意只浸沒凍存管的下半部分，輕輕晃動，不要讓水平面靠近凍存管蓋，當凍存管中尚存有少量冰塊(黃豆粒大小)時，用1％的新潔爾滅擦拭凍存管進入超淨臺中，整個時間約1分鐘左右，解凍後的細胞直接進入全培養液中，無須離心洗滌。核對培養瓶上標記的細胞代碼、號數及凍存日期後，進入37℃培養箱內。復甦成功標記(1)復甦3小時後，活細胞在50％以上；(2)24小時後pH值明顯發生變化，細胞集合成團狀。
支原體檢測支原體汙染會嚴重抑制細胞的生長。文獻報導，世界各國有不少實驗室的細胞株支原體汙染率在17％-63％之間。檢測支原體汙染的方法有很多，如細胞培養法、免疫檢測法、間接DNA染色(Hoechst33258染色)法及PCR法，各有千秋。本發明中採用的是細胞培養方法。
具體方法選美國GIBCOTMInvitrogen公司支原體檢測試劑盒。其原理基於支原體和宿主哺乳動物細胞的生化差異，支原體含有大量的腺苷三磷酸酶，而哺乳動物細胞中含量甚微。腺苷三磷酸酶可以將6-MPDR(一種非毒性的腺苷同類)轉化為兩種物質6-甲基嘌呤和6-甲基嘌呤核苷，這兩種物質對哺乳動物細胞均有害。
若檢測細胞株中有無支原體汙染，可通過其培養物與6-MPDR共同孵育後，檢測哺乳動物的細胞毒性來判斷。指示細胞選用的是VERO(非洲綠猴腎細胞，中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞庫)，其對支原體的感染十分敏感。具體步驟如下a)用無抗生素DMEM培養基(GIBCOTMInvitrogen)培養指示細胞(VERO)，當其密度為2.0×104個細胞/ml時，可將細胞移至24孔板中，使每孔密度為3.0×104個細胞/1.5ml；b)將24孔板防於37℃，5％ CO2孵箱中培養，2h，使VERO細胞吸附於孔底；c)24孔板的第一行第一列作為陰性對照孔(用NC表示)，每孔均加入0.2ml的DMEM培養基；d)各行任選一孔為陽性對照孔(用Pc表示)，每孔各加入0.2ml的陽性對照稀釋液(1mM腺苷三磷酸)；e)其餘每縱行的三個孔可加入同一樣品，做平行對比實驗。取無抗生素培養的待檢細胞株懸液加入同一縱列的三個孔中，每孔0.2ml。
f)37℃ 5％ CO2孵箱中培養24h；g)24h後，向第2、3行每孔中分別加入50μl的6-MPDR稀釋液h)37℃ 5％ CO2孵箱中培養72-96h，直至陰性對照孔中細胞融合成片；i)吸出培養基，不要破壞單細胞層，j)加入10％ PBS(PH7.2)配製的0.2％龍膽紫於各孔中，室溫孵育20mink)吸出染料，生理鹽水衝洗至乾淨為止，空氣中乾燥。
l)光鏡下觀察結果(參見圖6)實施例3、提取人外周血總RNA並RT-PCR(reverse transcriptpolymerase chain reaction)合成cDNA第一鏈肝素抗凝外周血5ml，淋巴細胞分層液分離單個核細胞，使用TRIZOL(GIBCOTMInvitrogen)一步法試劑盒提取人外周血總RNA，溶於30μl無核酶水。
採用RT-PCR試劑盒(GIBCOTMInvitrogen)反轉錄合成cDNA第一鏈，反應體系如下總RNA 100ng，OligodT16-18(500μg/ml)1μl，10mMdNTPMIX1μl，加滅菌水至10μl，65℃ 5min；冰浴大於1min，加入10×Buffer 2μl，25mM MgCl24μl，0.1M DTT 2μl，Rinaseout(40U/μl)1μl，混勻後離心，42℃ 2min，加SuperscriptII(200U/μl)，42℃ 50min，冰浴，加1μl RNAH(2U/μl)，37℃ 20min.
實施例4、位點特異性引物擴增HLA-A位點全長cDNA序列以cDNA為模板，PCR擴增HLA-A位點基因全序，反應體系如下1×pyrobest buffer(含2.5mM MgCl2)，0.2mM dNTPs，cDNA第一鏈3μl，HLA-A位點全長cDNA序列的上下遊引物(A-upper5′-GGACTCAGATTCTCCCCAGACGCCGAGG-3′，A-lower5′-AGGGAGCACAGGTCAGCGTGGGA AG-3′)各10pM，pyrobest DNA高保真聚合酶(5U/μl)0.25μl，加去離子水至50μl。(94℃ 30sec，66℃ 30sec，72℃ 120sec)×10循環→(94℃ 30sec，61℃ 30sec，72℃ 120sec)×20循環→72℃ 7min→4℃∝。所用試劑均為Takara公司生產。
cDNA擴增結果為鑑定HLA-A位點新等位基因，本研究採用位於5′及3′端非翻譯區的序列位引物進行該位點全長cDNA序列的擴增，擴增結果見圖4實施例5 連接、轉化、克隆鑑定並DNA序列測定採用promega公司生產的pGEM-T easy載體連接試劑盒。由於pyrobest DNA高保真聚合酶合成的PCR產物為平末端，故需加「A」尾才能與T載體連接。加「A」尾步驟如下PCR產物3μl，25mM MgCl21μl，10×buffer 1μl，TaqDNA polymerase(5U/μl)1μl，去離子水3μl，70℃ 30min。連接pGEM-Teasy載體過程如下2×ligasebuffer 5μl，T4 vector 1μl，加「A」尾產物3μl，T4 ligase(5U/μl)1μl，4℃，連接過夜。轉化、克隆與酶切鑑定見分子克隆。
將擴增片斷純化回收後，連接T-easy載體，為驗證載體中有無片斷插入，以及片斷大小是否正確，本研究對擴增質粒進行了酶切鑑定，由於該載體在插入片斷的兩端是先加入EcoRI酶切位點，故採用該核酸內切酶就可以將插入片斷切下。酶切片斷的鑑定結果參見圖5。
最後將鑑定克隆送Invitrogen公司測序鑑定。
HLA-A*11新等位基因的核苷酸序列如下1 ATGGCCGTCA TGGCGCCCCG AACCCTCCTC CTGCTACTCT CGGGGGCCCT GGCCCTGACC61CAGACCTGGG CGGGCTCCCA CTCCATGAGG TATTTCTACA CCTCCGTGTC CCGGCCCGGC121 CGCGGGGAGC CCCGCTTCAT CGCCGTGGGC TACGTGGACG ACACGCAGTT CGTGCGGTTC181 GACAGCGACG CCGCGAGCCA GAGGATGGAG CCGCGGGCGC CGTGGATAGA GCAGGAGGGG241 CCGGAGTATT GGGACCAGGA GACACGGAAT GTGAAGGCCC AGTCACAGAC TGACCGAGTG301 GACCTGGGGA CCCTGCGCGG CTACTACAAC CAGAGCGAGG ACGGTTCTCA TACCATCCAG361 ATAATGTATG GCTGCGACGT GGGGCCGGAC GGGCGCTTCC TCCGCGGGTA CCGGCAGGAC421 GCCTACGACG GCAAGGATTA CATCGCCCTG AACGAGGACC TGCGCTCTTG GACCGCGGCG481 GACATGGCAG CTCAGATCAC CAAGCGCAAG TGGGAGGCGG CCCATGCGGC GGAGCAGCAG541 AGAGCCTACC TGGAGGGCCG GTGCGTGGAG TGGCTCCGCA GATACCTGGA GAACGGGAAG601 GAGACGCTGC AGCGCACGGA CCCCCCCAAG ACACATATGA CCCACCACCC CATCTCTGAC661 CATGAGGCCA CCCTGAGGTG CTGGGCCCTG GGCTTCTACC CTGCGGAGAT CACACTGACC721 TGGCAGCGGG ATGGGGAGGA CCAGACCCAG GACACGGAGC TCGTGGAGAC CAGGCCTGCA781 GGGGATGGAA CCTTCCAGAA GTGGGCGGCT GTGGTGGTGC CTTCTGGAGA GGAGCAGAGA841 TACACCTGCC ATGTGCAGCA TGAGGGTCTG CCCAAGCCCC TCACCCTGAG ATGGGAGCTG901 TCTTCCCAGC CCACCATCCC CATCGTGGGC ATCATTGCTG GCCTGGTTCT CCTTGGAGCT961 GTGATCACTG GAGCTGTGGT CGCTGCCGTG ATGTGGAGGA GGAAGAGCTC AGATAGAAAA1021 GGAGGGAGTT ACACTCAGGC TGCAAGCAGT GACAGTGCCC AGGGCTCTGA TGTGTCTCTC1081 ACAGCTTGTA AAGTGTGAHLA-A*11新等位基因編碼的推定胺基酸序列如下MAVMAPRTLLLLLSGALALTQTWAGSHSMRYFYTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNVKAQSQTDRVDLGTLRGYYNQSEDGSHT
IQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAAHAAEQQRAYLEGRCVEWLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLRWELSSQPTIPIVGIIAGLVLLGAVITGAVVAAVMWRRKSSDRKGGSYTQAASSDSAQGSDVSLTACKV從測序結果來看，出現HLA-A*11新等位基因的2個家系的測序結果完全一致，是同一個HLA-A*11新等位基因，而且出現在安徽與山西兩個省份的2個不同家系中，可見該等位基因在中國人群中具有一定的頻率和普遍性，而非罕見的HLA等位基因。
實施例6、1.同源序列比較並註冊Genbank本發明在克隆HLA-A*11新等位基因全長cDNA並測序分析後，先登陸Genbank進行同源序列比較，然後登陸GenBank國際網站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html，獲得登錄號AY786585。
2.註冊IMGT，最終獲得WHO正式命名註冊IMGT(EMBL:http://www.ebi.ac.uk/Submissions/index.html)生物信息學網站，WHO HLA命名委員會正式命名AY786585為HLA-a*110104，並將公布於Human Immunology、European J Immunogenetics、Tissue Antige雜誌上。
實施例7、建立HLA-A*110104新等位基因的PCR-SSP基因分型方法根據突變的鹼基位於第三外顯子的第8位(C-T)，故將下遊引物的3′端設計為A，又依據上下遊引物的Tm值大小設計了如下引物對上遊引物5′-GGGACCAGGAGACACGGAATG-3′，下遊引物5′-GCAGCCATACATTATCTGGATGGTA-3′，擴增片斷長度為366bp。實驗中設立內對照，其PCR產物為HLA-DRBl內含子片段，長度為796bp，上下遊引物分別為5′-ACGGAATGTGAAGGCCCAG-3′和5′-GCATCTTGCTCTGTGCAGATT-3′。反應體系如下基因組DNA 1μl(200ng/μl)，25mM MgCl24μl，10×buffer 5μl，2mM dNTPMIX5μl，HLA-A*110104特異性引物對1μl(20pmol/μl)，內對照引物對1μl(10pmol/μl)，TaqDNA polymerase(5U/μl)1μl，去離子水加至50μl，將反應板置於PE-9700 PCR儀上進行PCR反應，反應參數為(96℃ 25秒 66℃ 50秒 72℃ 60秒)×10個循環→(96℃ 25秒 61℃ 50秒 72℃ 60秒)×20個循環。取10μl PCR反應產物加入2.0％瓊脂糖凝膠電泳孔內，電壓100V，10min，在紫外檢測儀下觀察結果，分析電泳帶格局，指定等位基因。電泳結果如圖1所示。
實施例8 HLA-I，II類基因分型結果本研究為探討HLA新等位基因的來源，分別對2個家系三代標本進行了HLA-I，II類低解析度基因分型，結果詳見表1及表2。從表1中可以看到，SBW(先證者)的HLA-A新基因來自其父親，而其祖父與祖母的HLA-A位點並未出現新的HLA等位基因，也就是說該新等位基因在家系一中表現為2代遺傳。從表2中可以看到，NWW(先證者)的HLA-A新基因來自其父親，而其父親是由其祖母遺傳而來，也就是說該新等位基因在家系二中表現為3代遺傳。
本研究為證實HLA新等位基因低解析度的分型結果，對SBW、SRS、NHL、NWW及RXZ標本的HLA-A位點進行了高分辨基因分型。從結果來看，高分辨分析結果中無論指定A11或其它基因，均有缺孔出現，這進一步證明了HLA-A位點新等位基因的確存在。
表1.家系一的HLA-I、II類低解析度基因分型結果
表2.家系二的HLA-I、II類低解析度基因分型結果
實施例9 繪製家系遺傳圖譜為進一步研究新等位基因的來源及其遺傳選擇的優勢，本研究根據2個家系HLA-A，B，C，DRB1，DQB1基因分型的結果，分別繪製了其家系遺傳圖譜。從家系一的遺傳圖譜來看，HLA-A新等位基因來源於父親，而且為HLA-A*11特異性，有二代遺傳，在遺傳選擇上具有一定優勢；從家系二來看，HLA-A新等位基因來源於祖母，而且為HLA-A*11特異性，有三代遺傳，在遺傳選擇上具有一定優勢(參見圖3A和B)。
討論八十年代未隨著分子生物學的飛速發展和在免疫遺傳學研究領域中的廣泛滲透，對HLA結構與功能以及配型應用領域的研究也帶來巨大變化，PCR技術及DNA序列測序方法的建立，已極大地改善了人們發現並鑑定HLA基因座位和等位基因的數量。同時也使配型的準確性和解析度得到了極大地改觀。回顧性對比研究已確證，既往被確定為完全相合的許多供-受體實質上其HLA等位基因並不相同。因為對於等位基因的檢測而言，血清學方法根本無法實現。配型解析度的極大提高和不斷發現的大量新等位基因是空前的，從而極大地動搖了人們所講的「臨床」HLA相合的概念。由於HLA基因分型方法比傳統的HLA血清學分型方法準確，故已取代後者並被廣泛用於骨髓移植中的HLA分型。根據HLA基因分型的精細程度，一般被分為低分辨分型和高分辨分型兩種。低分辨分型是指被鑑定的等位基因相當於HLA抗原分解物(split)水平，即通常所說的HLA亞型(即組基因)。在WHO基因命名中，HLA亞型相當於星號後2位數的水平。高分辨分型是指精確到核苷酸順序水平，即WHO命名的星號後4位數。臨床資料表明，骨髓移植供者和受者的HLA-A、B、DR抗原相合程度越高，發生移植物抗宿主反應(GVHD)的機會越低，移植存活率也高。因此，為提高HLA分型的準確性、避免漏檢尚未被發現的HLA等位基因，發現和鑑定特定人群中新的HLA等位基因已成為當前國際上HLA研究領域中的重要課題和研究熱點。
近些年無關供者骨髓庫和臍血庫的迅猛成功發展給許多病人提供了挽救其生命的可能機遇。目前僅美國骨髓庫(NMDP)就註冊登記3.5萬之多，國際骨髓庫(BMDW)的庫容已超過7百多萬份。這些庫容登記資料包括HLA配型結果，絕大多數庫的資料可通過www.marrow.org及www.bmdw.org在網站上進行查詢。從NMDP所查獲的遴選供體HLA的配型資料＞80％均為HLA-A、B、DR中分辨水平。隨後移植中心可獲取候選供體及病人的新鮮標本再進行高分辨及更多信息的配型。美國西雅圖華盛頓大學和Fred Hutchinson癌症研究中心的經驗表明，從所篩選到的候選供體中一般約50-60％的病人能從中找到在等位基因水平相匹配的供體。然而，從國際上更多移植中心的查詢結果來看，更多的病人則只能找到HLA基因位點部分匹配的供體。應強調指出的是，這些確證的統計資料只適用於歐洲大陸和北美高加索人，因為無論是NMDP也好還是BMDW也罷，其絕大部分供體的來源組成就是由這些人種所構成的。言外之意也就是說，從上述庫中找到與其它種族或少數民族相匹配供者的極率是很小很小。因此，應必須加快在世界各國進行無關供體捐贈的籌建。隨著我國無血緣關係供受體移植病例的迅猛增加，發現中國人群中特有的HLA等位基因，以提高HLA配型的精確度就顯得格外重要。尤為重要的是，努力發掘中國人群中特有的HLA基因多態性，使得器官及造血幹細胞移植患者能夠更加準確地進行HLA精確配型以尋找最佳匹配供體，防止移植排斥反應發生和延長患者生命。
的確在無關供體骨髓庫或臍血庫中能夠尋找到HLA相匹配的供體對等待接受造血幹細胞移植的病人來講是一個非常重要的治療選擇。但對於如何有效確定無關供-受體間HLA匹配程度的可接受範圍以及這種移植的利和弊目前仍是亟待解決的難點之一。迄今為止對於HLA最小匹配度的可納性尚無令人信服和意見統一的指導原則，當然這也是極其難做的大問題，需要大規模大宗的移植病例進行雙盲隨機的臨床移植實驗研究方能得出科學公正的結論。因為這種移植的結果會在不同年齡的病人、不同的病種、不同的病期、不同的預處理方案有明顯的區別。1998年在國際《血液》雜誌上刊發了由美國Fred Hutchinson癌症研究中心及西雅圖華盛頓大學聯合對300例接受無關供體造血幹細胞移植的CML病人進行了HLA等位基因錯配對移植排斥反應影響的研究結果，總的排斥率為5.6％，而HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位點等位基因完全匹配者的排斥率僅為2％；當II類的一個DR或DQ等位基因的不匹配時並未出現排斥反應；相反，當供-受體間I類基因如有2個或更多等位基因不合時則移植排斥率明顯增加可高達20％。此結果與該研究所1997年所發表的結果相一致，即I類A、B或C等位基因的不合比II類DR或DQ等位基因不合所引起的移植排斥會更高。
值得注意的是，同年日本學者在《新英格蘭醫學雜誌》上首次報告了HLA等位基因匹配度與GVHD及生存率關聯的報告，這組473例病人是日本無關供體庫(JMDP)的受體。由美國Fred Hutchinson癌症研究中心及西雅圖華盛頓大學在國際《血液》雜誌上報導的300例無關供受體主是高加索人。兩組報告的結論均認為，移植後GVHD的發生率及死亡率可因供-受體HLA-A、B、C、DRB1和DQB1等位基因的完全匹配而明顯減少，多位點等位基因的不匹配與移植後顯著高發的併發症、低生存率相關。日本人的結果明顯提示，aGVHD和死亡率的高危險指數與A位點相關。而美國西雅圖的結果卻表明，DRB1或DQB1位等位基因的不合是發生GVHD較大的因素，而與I類單一等位基因的匹配與否無關，aGVHD最危險的因素在美國西雅圖是與I、II類等基因不匹配相關。同樣，生存率更明顯地受至少一個I類等位基因和一個II類等位基因的影響，而單個I類或一個II類等位基因的不合併不明顯減少生存率，兩個或更多的I類等位基因的不合則會使生存率減少。為什麼GVHD在日本人的研究中與HLA-A位點的等位基因不合相關，而在美國西雅圖卻與DRB1或DQB1位點的等位基因密切相關。使人信服的理由是，這兩組病人在種族遺傳上有明顯的不同可以解釋臨床結果的不同。顯然，在日本移植病人錯匹的A位點等位基因和在美國高加索病人配錯的A位點的等位基因是不一樣的。這一發現提示，不同錯配的等位基因可能導致不同的同種免疫反應，也就更加加支持某些等到位基因是可允許錯配「permissive mismatches」的這一觀點。
根據國際骨髓供者協會(WBDA)以及歐洲免疫遺傳學聯盟(EFI)的標準[5，6]，在大規模的骨髓庫供者分型中，一般只要求鑑定到WHO命名星號後2位數，即HLA抗原特異性亞型水平。但是對於患者及其HLA配合的供者，應該做高分辨分型。此外，在HLA-I類基因中還應該包括C座位。在選擇供者是，HLA-I類基因主要看抗原特異性是否配合；HLA-DRB1基因要求儘量達到WHO命名星後4位數全相同。如果無其他選擇，取DR抗原相同者為佳。
HLA-A*11抗原是中國人群常見的抗原，其在中國人群中的發生頻率為10％-30％，而在高加索人種以及黑人中的頻率僅分別為4％-8％和＜1％。HLA-A*11抗原屬於HLA-I類抗原，表達於所有有核細胞表面，是人體重要的移植抗原，在器官與造血幹細胞移植排斥反應中發揮重要作用。所以，在中國人群中發現HLA-A*11新等位基因就具有特別重要的意義。本研究所發現的HLA-A*110104新等位基因出現在安徽與山西兩個省份的2個不同家系中，而且均有兩到三代遺傳史，可見該等位基因在中國人群中具有一定的頻率和普遍性，而非罕見的HLA等位基因，所以更具有重要的醫學與人類學研究價值。尤為重要的是，本研究所發現的HLA-A*110104新等位基因具有幾種不同遺傳編碼形式，這可能會造成其編碼抗原的不表達、低表達或引發細胞內信號傳導的改變，從而造成不同的免疫應答現象，對於這一方面的深入研究正在進行之中。
總之，HLA-A*110104新等位基因的發現不僅為人類遺傳基因庫增添了新的成員，而且，使得器官及造血幹細胞移植患者能夠更加準確地進行HLA精確配型以尋找最佳匹配供體，防止移植排斥反應發生和延長患者生命。同時，這項新發現還將闡明人體中存在不同HLA抗原形式的具體意義，並且可廣泛應用於法醫學鑑定、人類種族遷移等相關研究中。
權利要求
1.一種編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全長多核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
2.權利要求1所述的編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104用於移植前進行精細的HLA分型的用途。
3.一種用於移植前進行精細的HLA分型的的試劑盒，其含有權利要求1所述的編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
4.權利要求1所述的編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104用於法醫學鑑定以及人類學和遺傳學研究的用途。
5.一種用於法醫學鑑定以及人類學和遺傳學研究的試劑盒，其含有權利要求1所述的編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104或其片段。
6權利要求1所述的編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104用於製備診斷或治療腫瘤和/或自身免疫疾病的藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及一種編碼人類白細胞抗原A*11的新等位基因A*110104，其全長多核苷酸序列及其用途。
文檔編號C07K16/28GK1834244SQ20051005560
公開日2006年9月20日 申請日期2005年3月18日 優先權日2005年3月18日
發明者奚永志, 孫玉英, 梁飛, 金荔 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院附屬醫院