改進的生物柴油生產工藝的製作方法

2023-09-16 12:36:10 1

專利名稱：改進的生物柴油生產工藝的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種從微生物來源的油類獲得用於柴油循環發動機的燃料的工藝及 產生所述的油類的微生物。本發明同樣旨在所述產油微生物及其選擇工藝和由此獲得的多 聚核苷酸。
背景技術：
目前生物柴油的生產是基於來自植物(向日葵、油菜籽、棕櫚樹和其他物種)的 甘油三酯和低分子量的醇(甲醇、乙醇)的酯交換(醇解)反應從而產生脂肪酸甲酯/乙 酯和甘油。任何醇類的酯化作用都是可行的，但實際上此工藝僅使用了甲醇和乙醇(EP 523767)。由於成本低和物理化學性質允許其與任何低酸油脂反應，甲醇最常使用。生物柴油的產品由甘油三脂和醇生產，其重量比為10/1。因此，由1噸油，可獲得 約1噸生物柴油和約IOOkg的粗甘油。純度為70-85%的粗甘油可以通過調節相來純化，除了中和步驟，為了達到濃度增 加到90-95%的目的，還進行了一個蒸發步驟。最後，該濃縮產物經過柱純化，得到高純度甘 油，其主要目的是用於醫藥和化妝品行業。然而，最近的生物柴油市場每年增長超過50%， 導致甘油的世界市場已經飽和。這種情況在不久的將來會變得更糟，如果遵守用公共生物 製成的生物柴油取代目前燃料的目標，那麼將引起粗甘油在世界市場的過剩。在這種情況 下，由於純化工藝過於昂貴而難以在一個飽和的市場下競爭，對其通過純化方法的商業開 發，似乎對於生物柴油廠而言並不能成為最具有吸引力的解決方案。由於這種情況，儘管從 環保角度出發存在弊端，但已經開始考慮甘油的其他應用，例如可能作為燃料使用。此外，目前生物柴油的生產工藝中，大多使用含油種子或植物油，所以其生產成本 在很大程度上取決於原材料價格，這些價格佔生產成本的50-60%。儘管使用廢油，或另一 類型的脂肪，可以降低原材料的價格，但是該工藝需要一系列額外的步驟，以精煉這些油。 因此，探索降低生物價格價格，尤其是那些減少步驟數、提高產量和使用較便宜的原料的新 戰略是有必要的。最近已經提議將非食用油脂的使用作為生產生物柴油的替代儲備，特別是麻風樹 (Jatropa curcas)、7_K黃皮(Pongamia pinnata)或 Madhuca indica 禾中子中的油月旨(Shah et al. ,Energy fuels,2004,18,154-159 ；Karmee SK et al. ,2005,Bioresource Technol, 96,1425-1429 ；Ghadge SV et al. , Bioresource Technol，2006，97，379-384)。然而，由於 氣候或地理條件這些替代品並非在所有國家都可行。目前，源於產油的耕地作物或者具有高油含量的木本植物的甘油三酯的產量為每 年1. 2億噸。如果達到生物柴油市場增長的預期水平，那麼這些甘油三酯的供應將處於極 端的狀態，甚至能夠威脅到食品和傳統油脂化學工業的供應。生產這種類型的更多作物需 要大量可耕種土地，而這種情況在許多地區是不可能實現的。因此，生物柴油行業需要甘油三酯的替代儲備，其可以通過其他途徑獲得，特別是 那些可連續操作且不需要大量耕地的替代儲備。
微生物油脂的生產已經作為研究對象很長時間了。有些真菌、酵母菌和藻 類能夠在代謝應激過程中，在細胞內積累大於生物量70%的油脂(Ratledge C, Acta Biotechnol, 1991，11，似9_438)，這與植物種子發生的方式類似，因此它們被稱為產油微生 物(Ratledge，Biochemie，2004，86，807-815)。一些屬於薔薇色酵母屬(Rhodotorula)、紅冬孢酵母屬(Rhodosporidium)、耶羅維 亞酵母屬(Yarrowia)、隱球酵母屬(Cryptococcus)、德巴利(氏)酵母屬(Debaryomyces)、 假絲酵母屬(Candida)或油脂酵母屬(Lypomyces)和小球藻屬(Chlorella)的酵母積累含 有C16和C18脂肪酸骨架的甘油三酯(例如，棕櫚酸、硬脂酸、油酸)，其與植物油，例如油 菜籽和大豆中的油十分類似。因此，由於其符合EN 14214標準，來源於這些微生物的油類 (微生物源油類，SCO)有可能被用來生產生物柴油。關於由微生物生產的脂類生產生物柴油的信息幾乎沒有報導。近年來報導了 一些使用微藻(microalga)Chorella starkey 的工藝(Bioresource Technol, 2006,97, 841-846)和一些使用酵母的工藝(J Chem Technol Biotechnol，2007，82，775-780)。然而， 在這兩種情況下，使用的原料為葡萄糖，因此工藝的經濟平衡是不可行的。通過使用微生物或酶，從農產品，森林或工業部門的工業生產過程中產生的有機 副產品/廢物，可作為生產高附加值化合物的原料。來自生物柴油工業的粗甘油將包括在 這些副產品中。基於這些背景文獻，需要在生物柴油工業中建立一種改進的工藝，其從戰略、經濟 和技術方面解決下列問題-粗甘油巨額過剩所產生的問題。-使用的涉及高價格或者過大的耕種面積的原料的缺點。發明簡述本發明的作者已經建立了一種新的用於以甘油作為碳源的生物柴油的生產工藝， 其達到了與已知工藝中相同的產量，但是提高了產品的質量並且降低了生產工藝中的成 本。特定地，該工藝允許從高甘油三酯含量的微生物中獲得一種脂肪酸酯混合物，其適合作 為柴油發動機的易燃物或燃料。因此，本發明的第一目的在於一種獲得生物柴油的工藝，其包括a)通過利用一種以甘油作為碳源的產油微生物，獲得具有甘油三酯含量等於或大 於乾重20%的微生物生物量；b)將步驟a)中獲得的生物量中的甘油三酯轉化成脂肪酸酯的混合物。在一個具體的實施例中，部驟a)中微生物生物量的獲得受限於所含甘油三酯的 分離狀況，其隨後將根據步驟b)轉化成脂肪酸酯混合物.在一具體的實施例中，獲得步驟a)中的微生物生物量具有甘油三酯的含量在幹 重的20%和70%之間。在本發明的另一具體的實施例中，在獲得脂肪酸酯混合物之前，向微生物生物量 中添加產油植物種子。本發明同樣旨在一種獲得生物柴油的工藝，其包括a.通過利用以甘油為碳源的含油微生物獲得具有甘油三酯的含量等於或者大於 乾重的20%的微生物量；
b.可選地，從微生物生物量中分離甘油三酯；c.通過在酸性培養基中醇解，將步驟a)中獲得的包含在生物量中的甘油三酯或 者在步驟b)中分離的甘油三酯轉化成脂肪酸酯混合物，以獲得一個包括脂肪酸酯的相和 另一個包括甘油和細胞殘留物的相；d.對在步驟C)中獲得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和細胞殘留物的相進行第 一次分離；e.中和步驟d)中分離出的脂肪酸酯的相，以便獲得一個包括脂肪酸酯的相和一 個包括水及醇剩餘物的相；f.對在步驟e)中獲得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和水及醇剩餘物的相進行 第二次分離；g.純化步驟f)分離出的中包含脂肪酸酯的相。在另一方面，本發明旨在一種能夠使用甘油作為碳源並能積累甘油三酯的產油微 生物。本發明的還一方面涉及篩選出一種能夠以甘油作為唯一碳源並能積累甘油三酯 的含油微生物的方法，其包括獲得能夠在以甘油作為唯一碳源的培養基上生長的菌株；選擇步驟(i)中產生甘油三酯的菌株。發明詳述在本發明中，術語「生物量」或者「微生物生物量」指的是培養基中一次生長的微 生物的細胞集合。根據ASTM(美國材料與試驗協會)的說明，生物柴油是一種生物燃料，可再生燃 料，如來源於可再生脂類(例如植物油或動物脂肪)中的長鏈脂肪酸(具有8個以上碳原 子)的單烷基酯，並且其用於壓燃式發動機(柴油發動機)中。在本發明中，所述油類來自 先前定義的微生物生物量。在本發明中，「產油微生物」涉及一種其能夠在代謝應激下，在細胞內積累脂類的 酵母、絲狀真菌或微藻(薔薇色酵母屬、紅冬孢酵母屬、耶羅維亞酵母屬、隱球酵母屬、德巴 利(氏)酵母屬、假絲酵母屬、油脂酵母屬或小球藻屬)。在第一方面，本發明的目的在於一種獲得生物柴油的工藝，其包括a)通過利用一種以甘油作為碳源的產油微生物，獲得具有甘油三酯含量等於或大 於乾重20%的微生物生物量；b)將在步驟a)中獲得的生物量中的甘油三酯轉化成脂肪酸酯的混合物。在一個具體的實施例中，對步驟a)中獲得的微生物生物量中所含甘油三酯進行 分離，其隨後被轉化成脂肪酸酯混合物。該分離優選包括提取。在步驟a)中獲得微生物生物量的工藝包括在燒瓶中或生物反應器中培養產油微 生物直到甘油三酯含量等於或大於乾重的20%。在一優選實施例中，微生物在18°C和30°C之間的溫度下培養2到5天，優選在 23°C和30°C之間的溫度下不斷攪拌培養。一旦細胞內甘油三酯含量達到最大值，通過任一 常規工藝收集細胞，諸如，例如，過濾或離心。在一優選實施例中，生物量中的甘油三酯含量包含在乾重的20%和70%之間。
在本發明的一優選實施例中，用於生產生物量的微生物是一種酵母。在更優 選的實施例中，所述酵母特別優選是紅冬孢酵母屬和圓紅冬孢酵母菌(Miodosporidium toruloides)CECT 13006 和圓紅冬孢酵母菌(Rhodosporidium toruloides)CECT 13007 菌株。微生物在以甘油作為碳源的培養基中生長，該甘油相對於在相同的培養基中的氮 源是過量的。氮源可以是酵母提取物、蛋白腖、玉米漿、尿素、穀氨酸鈉或不同的無機氮源， 例如，銨鹽等，但其不限於此。除了甘油，其他碳來源，例如，葡萄糖、糖蜜、蔗糖、果糖、澱粉或脂肪酸，也能存在 於培養基中，但碳源並不僅僅局限於這些。根據本發明的一個具體的實施例，在發酵培養基 中甘油作為碳源，優選地甘油的量為使用碳水化合物的總量的70-100%。出於經濟原因，優 選使用的甘油為粗甘油，即具有純度在大約70%和85%之間的甘油。在本發明的另一具體實施例中，本發明的工藝還包括向步驟a)中獲得的微生物 生物量中添加含油植物種子的步驟，此步驟在獲得脂肪酸酯的混合物的步驟之前。合適的 植物種子例如葵花籽、油菜籽、棕櫚、大豆、白菜型油菜(turnip rape)或椰子種子。相應地，脂肪酸酯的混合物通過直接醇解在步驟a)中獲得的微生物生物量中所 包含的甘油三酯或者從微生物生物量中分離出來的甘油三酯來製備。在該反應中可以使用 一種催化劑去提高反應速率和終產量。醇解反應優選在酸性培養基中進行，也就是說使用 酸作為催化劑。酸化可以在任何酸介質中，諸如，例如，硫酸、鹽酸或磷酸中進行，但不限於 此。反應中使用的醇優選為相對於生物量重量的5到40倍，更優選在10到30倍之間。在 一個具體實施例中，允許反應在連接攪拌下進行20至36小時，溫度在40°C和70°C之間，優 選在50°C和70°C指間。同樣優選地，生物量的醇解所使用的醇具有1、2、3或4個碳原子。 甚至更優選地，醇是甲醇或者乙醇，甲醇為最優選的醇。除了先前所述的均相酸型催化劑，在本發明的其他實施例中還是用了非均相酸催 化劑(例如，沸石、磺酸型樹脂、S04/Zr02, W03/Zr02)、非均相鹼性催化劑(例如，MgO, CaO, Na/Na0H/Al203)、均相鹼性催化劑(例如，Κ0Η、NaOH)或者酶催化劑(脂肪酶，例如，假絲酵 母、青黴菌、假單胞菌)。本發明同樣旨在一種獲得生物柴油的工藝，其包括a.通過利用甘油作為碳源的含油微生物獲得具有甘油三酯的含量等於或者大於 乾重的20%的微生物量；b.可選地，從微生物生物量中，分離甘油三酯；c.通過在酸性培養基中醇解，將步驟a)中獲得的包含在生物量中的甘油三酯或 者在步驟b)中分離的甘油三酯轉化成脂肪酸酯混合物，以便獲得一個包括脂肪酸酯的相 和另一個包括甘油和細胞殘留物的相；d.對在步驟C)中獲得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和細胞殘留物的相進行第 一次分離；e.中和在步驟d)中分離出的包括脂肪酸酯的相，以便獲得一個包括脂肪酸酯的 相和一個包括水及醇殘留物的相；f.對在步驟e)中獲得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和水及醇殘留物的相進行 第二次分離；
g.純化步驟f)分離出的包含脂肪酸酯的相。
如前所述進行步驟a)、b)和C)。在本發明一具體的實施例中，通過離心工藝執行相分離的步驟d)。將步驟e)中的含有脂肪酸酯的相通過中和來除去過量的醇，如果有酸，除去酸。 中和過程適於通過加入到一定量的水中的弱鹼性溶液進行，例如氫氧化鈉、氫氧化鉀或氫 氧化銨，使用水的量範圍優選為步驟d)中分離到的含有脂肪酸酯的相體積的1/3到1/10 之間。在本發明的一具體實施例中，所述中和反應可以通過幾個步驟進行，例如，第一步 添加濃度相當於所添加的水重量的0. 05-0. 3%的鹼，第二步添加濃度相當於水重量的 0. 01-0. 的鹼。在一個具體實施例中，在中和過程步驟中，以勻速進行機械攪拌大約15-60分鐘 以防止乳液形成。在一個具體實施例中，步驟f)中進行的相的第二次分離通過重力沉澱作用進行， 一個相由水和醇殘留物組成，一個相含有獲得的脂肪酸酯。通過在蒸發器中除去水和醇殘留物來淨化所述酯。蒸發少量的水和酯，通常為甲 醇或乙醇，需要一個較低能量的工藝，因為它需要的溫度比在酯類的純化過程中用於酯的 蒸餾的溫度低。如果其含水量大於標準14214中所規定的值，所獲得的生物柴油可以進行再循 環。產油微生物如上所述，獲得生物柴油的工藝包括利用以甘油作為碳源的產油微生物。因此，在 另一方面，本發明旨在一種以甘油作為碳源並能夠能夠積聚甘油三酯的微生物。在另一具體實施例，所述微生物能夠積聚甘油三酯的含量等於或大於乾重的 20%，優選在20%和70%之間。在本發明的背景下，產油微生物可以是一種酵母，一種絲狀菌或者一種微藻。在本 發明的優選實施例中，所述微生物是一種酵母。在更優選的實施例中，所述酵母是紅冬孢酵 母屬的，更為優選是圓紅冬孢酵母菌CECT 13006和圓紅冬孢酵母菌CECT 13007。本發明中微生物的國際保藏單位是西班牙普通微生物保藏中心 (Coleccion Espanola de Cultivos Tipo-CECT)。在另一方面，本發明涉及篩選一種以甘油作為唯一碳源並能夠積聚甘油三酯的含 油微生物的方法，其包括(i)獲得能夠在以甘油作為唯一碳源的培養基上生長的菌株；(ii)選擇步驟(i)中產生甘油三酯的菌株。在步驟(i)中，任何本領域中已知的甘油培養基都可以用於篩選菌株，例如薔薇 色酵母屬、紅冬孢酵母屬、耶羅維亞酵母屬、隱球酵母屬、德巴利(氏)酵母屬、假絲酵母屬、 油脂酵母屬或小球藻屬。甘油培養基優選包括MMG培養基(每升6. 7g無氨基酵母氮源 (YNB) ；47g粗甘油；補充氯黴素(50 μ g/mL))。在步驟(ii)中，通過抽樣染色的方法篩選生產甘油三酯的菌株，如通過尼羅紅染 色後進行螢光分析。本發明中限定的酵母菌株已經通過核糖體DNA 26S亞基的D1/D2區域的對應核苷酸序列以及位於18S和26S亞基之間的總ITS區域的片段進行鑑定。因此，在另一方面，本發明涉及一種多聚核苷酸，其特徵在於具有如SEQ ID NO=I 所示的序列，對應於圓紅冬孢酵母菌株CECT 130076核糖體DNA 26S亞基D1/D2的區域。在另一方面，本發明涉及一種多聚核苷酸，其特徵在於具有如SEQ IDNO 2所示的 序列，其對應於圓紅冬孢酵母菌株CECT 13006的18S和26S亞基之間的總ITS區域。在另一方面，本發明涉及一種多聚核苷酸，其特徵在於具有如SEQ IDNO :3所示的 序列，其對應於圓紅冬孢酵母菌株CECT 13007的核糖體DNA26S亞基D1/D2的區域。在另一方面，本發明涉及一種多聚核苷酸，其特徵在於具有如SEQ IDNO :4所示的 序列，其對應於圓紅冬孢酵母菌株CECT 13007的18S和26S亞基之間的總ITS區域。正如本領域技術人員所知，本發明中的多聚核苷酸可以用作探針，或由此設計引 物或探針，用於鑑定紅冬孢酵母屬的其他種類。具體實施例1.能夠以粗甘油作為唯一碳源進行生長的微生物的選擇通過兩種策略從Rio Tinto(韋爾瓦)河岸採取的土壤樣本中分離這些微生物。向 試管中的Ig樣品中添加IOmL鹽水溶液並劇烈攪拌10分鐘。由此開始，準備用鹽溶液進行 1 10倍的連續稀釋過程，將0. ImL接種於含有YPG培養基(每升10g酵母提取物、20g 細菌蛋白腖、47g粗甘油、補充氯黴素(50yg/mL))的平板中以抑制細菌增殖。平板在 下培養4-5天並且將長出的菌落轉移到含有MMG的培養基中(每升6. 7g無氨基酵母氮源 (YNB) ；47g粗甘油；補充氯黴素(50yg/mL))中。平板在下培養5_7天。在第二個策略中，一部分樣品在無菌研缽中研磨，取其中Ig加入到含有50mL補 充添加玫瑰紅(50 μ g/mL)和氯黴素(50 μ g/mL)的MMG培養基的燒瓶中。燒瓶在下， 250rpm培養M小時。然後，0. 5mL該培養物被轉移到另一個含有8%粗甘油的MMG的燒瓶 中，在同樣條件下進行培養。使用含有具有12%粗甘油的MMG培養基重複該過程。來自含 有8-12%甘油的培養物的稀釋液被接種在含有MMG培養基的平板上，然後在下，培養 7天。通過這兩個過程，在YPG培養基中獲得了 470個菌落，從其中選擇出230個能夠在 MMG中生長的菌落。2.能夠以粗甘油作為唯一碳源進行生長並能積累甘油三酯的微生物的篩選通過使用尼紅染色(KimuraK，et al. , 2004, J. Microbiol. Methods, 56, 331-338) 抽樣分析積累甘油三酯的能力。培養物在小尺寸96孔盤中的MMG培養基中生長，在下，250rpm培養72小時。 此後，取出0. 5mL的培養物用等體積的PBS緩衝液稀釋(IOmM磷酸鉀緩衝液，0. 15M KCl，pH 7. 0)。在0. 4mL的懸浮液中加入0. OlmL的尼紅溶液，混合物在室溫下孵育5分鐘，將0. ImL 轉移到微量滴定板中，在600nm下在光吸收酶標儀(Plate Reader)中測定螢光值。有12 個培養物顯示出了高於對照組的螢光測量值，圓紅冬孢酵母菌CBS14，其被選為可能是甘油 三酯的生產者。將這12個菌株和對照菌株做三個重複，在含有50mL的MEM培養基(1升 粗甘油，47g ；酵母提取物，1. 5克；磷酸二氫鉀，0. 75克；硝酸銨，0. 28克；CaCl · 2H20，0. 4 克；MgSO4 · 72H20，0. 4克，用濃鹽酸調節pH至5)中，28°C下，250rpm培養96小時。通過離心收集細胞，排空兩個試管，50°C下在烤箱中放置M小時以測量乾重。其他的試管用定量 濾紙吸乾並用含有0. 75mL氫氧化銨的5mL水進行懸浮。輕輕攪拌懸浮液，在60_70°C的水 浴中培養15分鐘。冷卻並加入5mL乙醇，劇烈攪拌。然後加入12. 5mL乙醚，簡單攪拌。然 後加入同樣體積的石油醚。混合物通過離心進行分離，分離出有機相轉移到一個平底燒瓶 中。有機相在旋轉蒸發器蒸乾，將燒瓶放置在102°C下的烤箱中直至恆重。通過重量測定法，鑑定出兩個能夠積累其乾重25. 3%和27. 2%的甘油三酯的菌 株。兩者均通過對核糖體DNA 26S亞基的D1/D2區域和位於亞基之間的總 ITS(內轉錄間隔區)的一個片段進行測序被確定為兩個不同的紅冬孢酵母菌株，其均示 出了與現有資料庫保藏的該物類的相關序列存在著差異。兩個菌株均保藏在西班牙典型 培養物保藏中心，分別命名為圓紅冬孢酵母菌0376(CECT no. 13006)和圓紅冬孢酵母菌 0770 (CECT no. 13007)。為了擴增對應於核糖體DNA28S亞基的D1/D2區域，使用了序列為SEQ ID N0:5和 SEQ ID NO 7的寡聚核苷酸。同樣，使用序列為SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 8的寡聚核苷 酸擴增位於18S和26S亞基之間的ITS區域。在另一方面，本發明涉及一種寡核苷酸，其特徵在於具有如SEQ ID NO :5所示的序 列。在另一方面，本發明涉及一種寡核苷酸，其特徵在於具有如SEQ ID NO :6所示的序 列。在另一方面，本發明涉及一種寡核苷酸，其特徵在於具有如SEQ ID NO :7所示的序 列。在另一方面，本發明涉及一種寡核苷酸，其特徵在於具有如SEQ ID NO :8所示的序 列。3.通過以粗甘油作為唯一碳源並具有積累甘油三酯能力的微生物發酵生產生物 柴油。將在固體YPG培養基(基於1升的組分酵母提取物10g、細菌蛋白腖20g、粗甘油 47g、瓊脂20g)中生長的圓紅冬孢酵母菌CECT13007細胞，接種在50mL同樣的培養基中。在 定軌振蕩器中培育M小時後QOOrpm )，將25mL該培養物轉移到含有250mL YPG培養 基的長頸瓶中。細胞在定軌振蕩器中再培育M小時O00rpmJ8°C)。然後，將150mL該培 養物轉移到含有1. 35升MEM培養基的發酵罐中。該培養基包括(基於1升)47g粗甘油； 1. 5g 酵母提取物；0. 75g 磷酸二氫鉀；0. 28g 硝酸銨；0. 4gCaCl · 2H20 ；0. 4g MgSO4 · 72H20， 用濃鹽酸調節pH至5。發酵罐維持在^°C，通過以250rpm的轉速進行攪拌將溶解氧的濃度維持在20% 以上。72小時後，發酵罐的生物量濃度為M.4g/L，細胞內甘油三酯的含量為52.3%。通 過氣相色譜分析存在的脂肪酸的組分，發現主要為棕櫚酸(對％)、硬脂酸(8%)、油酸 (55% )和亞油酸(2% )0離心收集細胞，並在50°C下乾燥8小時。在一個帶有冷凝器的圓底燒瓶中加入IOg生物量(5. 2g甘油三酯)和IOOmL在甲 醇中的酸性溶液。懸濁液在60°C下加熱，在常壓下劇烈攪拌20個小時。一旦反應結束，停 止攪拌並且通過離心將混合物分離。由此獲得了兩個相一個輕相含有甲酯和過量的甲醇，一個重相由甘油、甲醇殘留物、催化劑和鹽組成。通過用氫氧化鈉的濃度為所添加水重量的0. 1 %的鹼性水洗滌兩次，進行對輕相 的純化。每次洗滌時，允許輕輕倒出，直到達到有機相和水相良好的分離。除去水相，在 IOOmbar絕對壓強，120°C下，使用真空降膜蒸發器除去甲醇和水殘留物以收集甲酯。獲得的 終量為5. 09g甲酯，其代表了 98%的產量。由此獲得的甲酯適用於在柴油機中作為汽車燃料使用，其符合歐洲標準14214中 關於該類燃料的規定(見表1)。表 1作為SCO甲酯混合物燃料的性質
權利要求
1.一種獲得生物柴油的工藝，其包括a)通過利用一種以甘油作為碳源的產油微生物，獲得具有甘油三酯含量等於或大於幹 重20%的微生物生物量；b)將步驟a)中獲得的生物量轉化成脂肪酸酯的混合物。
2.根據權利要求1所述的工藝，其中在隨後根據步驟b)將其轉化成脂肪酸酯混合物的 步驟之前，對步驟a)中獲得的微生物生物量中所含甘油三酯進行分離。
3.根據權利要求2所述的工藝，其中分離包括提取。
4.根據權利要求1到3中任一項所述的工藝，其中微生物量中的甘油三酯含量包括在 20%和70%乾重之間。
5.根據權利要求1到4中任一項所述的工藝，其中所述微生物是一種酵母菌。
6.根據權利要求5所述的工藝，其中所述微生物是紅冬孢酵母菌屬中的一種酵母菌。
7.根據權利要求6所述的工藝，其中所述微生物為圓紅冬孢酵母菌CECT13006。
8.根據權利要求6所述的工藝，其中所述微生物為圓紅冬孢酵母菌CECT13007。
9.根據權利要求1到8中任一項所述的工藝，其中甘油組成碳源的70-100%。
10.根據權利要求1到9中任一項所述的工藝，還包括在將生物量轉化成脂肪酸酯的步 驟之前，存在將含油植物種子添加到生物量中的步驟。
11.根據權利要求1或2所述的工藝，其中步驟b)通過醇解進行。
12.根據權利要求11所述的工藝，其中，醇解在酸性培養基中進行。
13.根據權利要求11或12所述的工藝，其中，醇解在40°C和70°C之間的溫度下進行。
14.根據權利要求13所述的工藝，其中，醇解在50°C和70°C之間的溫度下進行。
15.根據權利要求11到14中任一項所述的工藝，其中，用甲醇或者乙醇進行醇解。
16.根據權利要求15所述的工藝，其中，用甲醇進行醇解。
17.一種獲得生物柴油的工藝，其包括a)通過一種以甘油作為碳源的含油微生物，獲得具有甘油三酯的含量等於或者大於幹 重20%的微生物量；b)可選地，從微生物生物量中分離甘油三酯；c)通過在酸性培養基中醇解，將步驟a)中獲得的生物量中含有的甘油三酯或者在步 驟b)中分離的甘油三酯轉化成脂肪酸酯混合物，以便獲得一個包括脂肪酸酯的相和另一 個包括甘油和細胞殘留物的相；d)對在步驟c)中獲得的包括脂肪酸酯的相和包括甘油和細胞殘留物的相進行第一次 分離；e)中和步驟d)中分離的包括脂肪酸酯的相，以便獲得一個包括脂肪酸酯的相和一個 包括水及醇殘留物的相；f)對在步驟e)中獲得的包括脂肪酸酯的相和包括水及醇殘留物的相進行第二次分1 ；g)純化步驟f)中分離的包括脂肪酸酯的相，通過以甘油作為碳源的產油微生物獲得 具有甘油三酯含量等於或大於20%乾重的微生物生物量。
18.—種能夠使用甘油作為碳源積累甘油三酯的產油微生物。
19.根據權利要求18所述的含油微生物，其中所述微生物能夠積累的甘油三酯的含量2等於或者大於乾重的20%。
20.根據權利要求18或19所述的微生物，其中所述微生物是一種酵母菌。
21.根據權利要求20所述的微生物，其中所述微生物是紅冬孢酵母菌屬中的一種酵母菌。
22.根據權利要求21所述的微生物，其中所述微生物是圓紅冬孢酵母菌CECT13006。
23.根據權利要求21所述的微生物，其中所述微生物是圓紅冬孢酵母菌CECT13007。
24.一種選擇能夠使用甘油作為唯一碳源積累甘油三酯的含油微生物的方法，其包括(i)獲得能夠在以甘油作為唯一碳源的培養基上生長的菌株； ( )選擇步驟(i)中產生甘油三酯的菌株。
25.根據權利要求M所述的工藝，其中步驟(i)中的培養基包括MMG培:
26.根據權利要求M或25所述的工藝，其中步驟(ii)包括抽樣染色。
27.根據權利要求26所述的工藝，其中步驟(ii)包括螢光分析。
28.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO :1所示的序列。
29.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO 2所示的序列。
30.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO 3所示的序列。
31.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO 4所示的序列。
32.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO 5所示的序列。
33.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO 6所示的序列。
34.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO 7所示的序列。
35.一種3S聚核苷畫1，其特徵在於具有SEQIDNO 8所示的序列。
全文摘要
本發明涉及一種獲得適合作為柴油循環發動機的可燃物或燃料的脂肪酸酯混合物的工藝，其包括a)通過利用甘油作為碳源的產油微生物，獲得具有甘油三酯含量等於或大於20％乾重的微生物生物量；和b)將步驟a)中獲得的生物量中含有的甘油三酯轉化成脂肪酸酯混合物。本發明同樣涉及所述產油微生物及其選擇工藝和由此獲得的多聚核苷酸。
文檔編號C12P7/64GK102046794SQ200980118937
公開日2011年5月4日 申請日期2009年3月25日 優先權日2008年3月25日
發明者Ma·卡門·龍切爾巴雷諾, 何塞路易斯·阿德裡奧範德維爾, 哈維爾·貝拉斯科阿爾瓦拉多, 阿爾韋託·扎夫拉戈麥斯, 馬格達萊納·巴爾迪維索加特 申請人:神經元生物製藥股份公司