肺癌中的ros激酶的製作方法

2023-09-16 02:44:55 2

肺癌中的ros激酶的製作方法
【專利摘要】本發明提供了鑑定哺乳動物中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法。在一些實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是編碼ROS的多核苷酸和編碼第二(非-ROS)多肽的多核苷酸之間融合的結果。描述了ROS的三種不同的融合伴侶，即由FIG基因、SLC34A2基因、和CD74基因編碼的蛋白。本發明實現了用於確定生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的新方法、用於篩選抑制蛋白的化合物的方法、和用於抑制癌症(例如，肺癌)進展的方法。
【專利說明】肺癌中的ROS激酶
[0001]發明背景
本發明總體涉及參與肺癌的蛋白質和基因(例如，人肺癌)，以及肺癌的檢測、診斷和治療。
[0002]許多癌症的特徵在於導致細胞過程(包括生長和增殖)的控制異常的細胞信號傳遞途徑的破壞。這些破壞經常是由於特定的信號傳遞蛋白諸如激酶的活性改變引起的。
[0003]蛋白激酶蛋白的異常表達可以是癌症的病原因素(和驅動因素)。異常表達可以由蛋白(或其激酶部分)與第二種蛋白(或其部分)的融合、蛋白的截短部分的表達或者由全長蛋白的表達的異常調節所引起。
[0004]已知導致產生具有異常信號傳遞活性的激酶融合蛋白的基因易位可以直接導致某些癌症(參見例如，Mitelman 等人，Nature Reviews Cancer 7: 233 - 245, 2007,Futreal 等人，Nat Rev Cancer 4(3): 177 - 183 (2004),和 Falini 等人，Blood 99 (2):409-426 (2002)。例如，BCR-ABL癌蛋白，一種酪氨酸激酶融合蛋白，是病原因素且驅動人慢性髓性白血病(CML)。在至少90-95%的CML病例中發現的BCR-ABL癌蛋白是通過9號染色體上的c-ABL蛋白酪氨酸激酶的基因序列易位到22號染色體上的BCR序列上產生的，產生所謂的 Philadelphia 染色體。參見例如 Kurzock 等人，Λ Engl.J.Med.319: 990-998(1988)。在急性淋巴性白血病(ALL)和急性骨髓性白血病(AML)病例中也能發現易位。這些發現促使FDA批准甲磺酸伊馬替尼(由Novartis以商標Gleevec?銷售)和dasatinig(由Bristol-Mysers Squibb以商標Sprycel?銷售)(ABL激酶的小分子抑制劑)用於治療CML和ALL。這些藥物是設計用來對驅動腫瘤細胞生長的信號傳遞通路進行幹擾的藥物實例。這些藥物的開發相對於CML和ALL的常規療法(化療和放射)而言代表一種顯著的進步，其中常規療法受到眾所周知的副作用的煩擾並且經常具有有限的效果，因為它們不能特異性地靶向癌症的根本原因。
[0005]因此，鑑定驅動癌症的蛋白以便在癌症更可能對治療響應的早期檢測癌症將是有用的。額外地，此類蛋白的鑑定將尤其期望產生新方法來選擇用於靶向治療的患者，以及用於篩選和開發能抑制此類蛋白且因此治療癌症的新藥物。
[0006]受體酪氨酸激酶(RTKs)的致癌作用已牽涉在許多類型的實體瘤(包括肺癌)中。肺癌(其具有幾種亞型，包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌)是全世界男性和女性中由癌症導致的死亡的最常見原因。根據美國國家癌症研究所的數據，在美國每14名男性和女性中接近一名將在其人生的某個點被診斷出肺癌。肺癌的兩種特别致命的形式是小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌。
[0007]不幸的是，肺癌經常無法在早期被診斷，並且它經常完全不能對手術響應，甚至當與化療或放療組合時。例如，在美國，NSCLC是癌症死亡的主要原因，並且佔所有肺癌的約87%。在美國每年有約151，000個NSCLC新病例，並且據估計僅在美國每年超過120，000位患者將死於該疾病。參見「Caflcer Facts and Figures 2005, 」 American Cancer Society。包括三種不同亞型的NSCLC經常僅在它已經轉移以後被檢測到，因此在診斷的兩年內死亡率是75%。[0008]因此，發現在早期鑑定肺癌的新方法和治療肺癌的新方法(和新試劑)將是有用的。
[0009]發明概沭
本發明基於發現癌症、特別是肺癌中異常ROS表達和/或活性。哺乳動物肺癌中ROS的異常表達可能是由於，例如，哺乳動物肺癌中全長ROS激酶的表達，因為健康、正常肺組織和細胞不表達ROS激酶蛋白或ROS激酶活性。哺乳動物肺癌中ROS的異常表達也可能是由於截短ROS (例如，包含ROS激酶的一部分，包括激酶結構域)或本文公開的ROS融合蛋白之一的存在。肺癌中所有公開的ROS的表達導致ROS激酶結構域的表達；因此，所有公開的ROS融合多肽具有活性ROS激酶活性。
[0010]因此，在第一個方面，本發明提供了用於檢測生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。該方法包括以下步驟:獲得來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品；並且利用至少一種特異性結合具有ROS激酶活性的所述多肽的試劑來確定所述多肽是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在所述多肽。
[0011]在另一個實施方案中，所述試劑是抗體。在一些實施方案中，所述試劑(例如抗體)是可檢測地標記的。在另一個實施方案中，所述試劑特異性結合全長ROS多肽。在另一個實施方案中，所述試劑特異性結合ROS激酶結構域。在另一個實施方案中，所述試劑特異性結合ROS融合多肽(例如，特異性結合CD74-R0S融合多肽、SLC34A2-R0S (S)多肽、SLC34A2-R0S(L)多肽、SLC34A2-R0S(VS)多肽、FIG-ROS (L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、或FIG-ROS (VL)多肽。
[0012]在本發明方法的各個實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全長ROS多肽。在另一個實施方案中，所述多肽是ROS融合多肽。在另一個實施方案中，所述ROS融合多肽選自 CD74-R0S 融合多肽、SLC34A2-R0S(S)多肽、SLC34A2-R0S (L)多肽、SLC34A2-R0S (VS)多肽、FIG-ROS (L)多肽、FIG-ROS(S)多肽、和FIG-ROS(VL)多肽。在各個實施方案中，具有ROS 激酶活性的多肽包含 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 60,SEQ ID NO: 28,SEQ ID NO: 7,SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 22 的胺基酸序列。
[0013]在一些實施方案中，以選自流式細胞術測定、體外激酶測定、免疫組織化學(IHC)測定、免疫螢光(IF)測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)和Western印跡分析測定的形式實施所述方法。
[0014]在一個實施方案中，檢測到所述多肽的激酶活性。在另一個實施方案中，所述試劑是重同位素標記(AQUA)肽。在另一個實施方案中，所述重同位素標記(AQUA)肽包含含有ROS融合多肽的融合連接的胺基酸序列。在另一個實施方案中，使用質譜分析法實施所述方法。
[0015]在另一個方面，本發明提供了用於檢測編碼生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。該方法包括以下步驟:(a)獲得來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品並且(b)利用特異性結合編碼具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸的試劑來確定所述多核苷酸是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在編碼具有ROS激酶活性的所述多肽的所述多核苷酸。
[0016]在一些實施方案中，多核苷酸包含選自SEQ ID N0:2、6、8、23、29、55、57和59的核
苷酸序列。
[0017]在一些實施方案中，所述試劑是核酸探針。在一些實施方案中，所述試劑是可檢測地標記的。在另一個實施方案中，核酸探針是螢光原位雜交(FISH)探針且用FISH測定實施所述方法。在另一個實施方案中，核酸探針是聚合酶鏈式反應(PCR)探針且用PCR測定實施所述方法。在進一步的實施方案中，所述試劑是可檢測地標記的。
[0018]在本發明方法的各個實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽是全長ROS多肽。在另一個實施方案中，多肽是ROS融合多肽。在另一個實施方案中，所述ROS融合多肽選自CD74-R0S 融合多肽、SLC34A2-R0S(S)多肽、SLC34A2-R0S (L)多肽、SLC34A2-R0S (VS)多肽、FIG-ROS(L)多肽、FIG-ROS (S)多肽、和FIG-ROS (VL)多肽。在各個實施方案中，具有ROS激酶活性的多肽包含 SEQ ID NO: USEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 56、SEQ IDNO: 60、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 5 或 SEQ ID NO: 22 的胺基酸序列。
[0019]在本發明方法的各個實施方案中，肺癌是人肺癌(例如，非小細胞肺癌或小細胞肺癌)。在進一步的實施方案中，生物樣品選自肺活檢樣品、支氣管肺泡灌洗物、腫瘤切除樣品、細針穿刺物、胸膜滲出液和循環腫瘤細胞。
[0020]在本發明方法的各個實施方案中，哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌是非小細胞肺癌。在各個實施方案中，哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌來自人。
[0021]在本發明方法的各個實施方案中，生物樣品被診斷為來自由ROS激酶活性驅動的哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。在一些實施方案中，哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌可能對ROS抑制性治療劑響應。在各個實施方案中，由其獲得所述生物樣品(其中所述試劑特異性結合所述生物樣品)的患者被診斷為患有由ROS激酶活性驅動的哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。在一些實施方案中，患者被診斷為可能對ROS抑制性治療劑響應。ROS抑制性治療劑的一個非限制性實例為克裡唑替尼(也稱為PF-02341066)。ROS抑制性治療劑的額外的非限制性實例包括 NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CH5424802、CEPl1988、WH1-P131 和 WH1-P154。
[0022]在另一個方面，本發明提供了用於抑制表達具有ROS激酶活性的多肽的哺乳動物癌症或疑似哺乳動物癌症進展的方法，所述方法包括在所述哺乳動物癌症或疑似哺乳動物癌症中抑制所述多肽的表達和/或活性的步驟。
[0023]在另一個方面，本發明提供了用於抑制包括編碼具有ROS激酶活性的多肽的多核苷酸的哺乳動物癌症或疑似哺乳動物癌症進展的方法，所述方法包括在所述哺乳動物癌症或疑似哺乳動物癌症中抑制所述多核苷酸的表達的步驟。
[0024]在各個實施方案中，肺癌或疑似肺癌來自人。在一些實施方案中，所述多肽或多核苷酸的表達和/或活性被ROS抑制性治療劑所抑制，所述ROS抑制性治療劑選自 PF-02341066、NVT TAE-684、AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEPl 1988、CH5424802、WH1-P131和 WH1-PI54ο
[0025]在又另一個方面，本發明提供了將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑑定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者的方法,所述方法包括:將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的試劑接觸，檢測所述試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑑定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者。
[0026]在又另一個方面，本發明提供了治療患有肺癌的患者的方法，所述方法包括:檢測生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在，所述生物樣品來自患有或疑似患有肺癌的患者的肺；並且給患者施用治療有效量的ROS抑制性治療劑，從而治療受試者的肺癌。
[0027]在又另一個方面，本發明提供了治療患有肺癌的患者的方法，所述方法包括:檢測來自患有或疑似患有肺癌的患者的肺的生物樣品中多肽的存在，所述多肽選自具有ROS激酶活性的多肽和具有ALK激酶活性的多肽；並且給患者施用治療有效量的ALK/R0S抑制性治療劑，從而治療受試者的肺癌。
[0028]在一個進一步方面，本發明提供了用於將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑑定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者的方法,所述方法包括:將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的第一試劑和特異性結合具有ALK激酶活性的多肽的第二試劑接觸，並且檢測所述第一試劑或所述第二試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述第一試劑或所述第二試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑑定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者。
[0029]在一個進一步方面，本發明提供了用於將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑑定為可能對ALK-抑制性治療劑響應的患者的方法,所述方法包括:將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合具有ROS激酶活性的多肽的第一試劑和特異性結合具有ALK激酶活性的多肽的第二試劑接觸，並且檢測所述第一試劑或所述第二試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述第一試劑或所述第二試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑑定為可能對ALK-抑制性治療劑響應的患者。
[0030]在各個實施方案中，所述第一試劑特異性結合全長ROS激酶蛋白。在各個實施方案中，所述第二試劑特異性結合全長ALK激酶蛋白。在各個實施方案中，所述第一試劑特異性結合ROS激酶蛋白的激酶結構域。在各個實施方案中，所述第二試劑特異性結合ALK激酶蛋白的激酶結構域。在一些實施方案中，所述第一試劑是抗體。在一些實施方案中，所述第二試劑是抗體。
[0031]在本發明所有方面的各個實施方案中，患者是人患者且肺癌(或疑似肺癌)來自人。在一些實施方案中，肺癌是NSCLC或SCLC。在一些實施方案中，ROS抑制性治療劑或ALK抑制性治療劑是PF-02341066、NVT TAE-684或AP26113。在一些實施方案中，ROS抑制性治療劑或 ALK 抑制性治療劑是 AP26113、CEP-14083、CEP-14513、CEP11988、CH5424802、WH1-P131 和 WH1-P154。
[0032]在各個實施方案中，生物樣品選自肺活檢樣品、支氣管肺泡灌洗物、循環腫瘤細胞、腫瘤切除樣品、細針穿刺物和胸膜滲出液。
[0033]在進一步方面，本發明提供了用於確定化合物是否抑制特徵在於具有ROS活性的多肽的表達的哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的進展的方法，所述方法包括確定所述化合物是否抑制所述多肽在所述癌症中的表達的步驟。在另一個方面，本發明提供了用於抑制特徵在於具有ROS活性的多肽的表達的哺乳動物癌症或疑似哺乳動物癌症的進展的方法，所述方法包括抑制所述多肽在所述哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌中的表達和/或活性的步驟。在一些實施方案中，癌症來自人。[0034]附圖簡述
本專利或申請文件包含彩色圖。經請求且支付必要的費用，具有彩色附圖的此專利或專利申請公開的複印件將由專利局提供。
[0035]圖1 -是人NSCLC細胞系(HCC78)提取物的Western印跡分析，該圖表示了具有比全長/野生型ROS低很多的分子量的ROS型的表達。
[0036]圖2 -顯示在人NSCLC細胞系中siRNA對突變ROS激酶的抑制作用:小圖A顯示在轉染siRNA後細胞抑制圖，小圖B是顯示ROS的特異性敲低(knock- down)和增加凋亡(在突變ROS驅動的細胞系中)的免疫印跡，且小圖C是顯示ROS下遊的信號傳遞分子活性降低的免疫印跡。
[0037]圖3A-3B -顯示SLC34A2基因和ROS基因分別在染色體4p和6q上的位置(圖3A)，和全長SLC34A2和ROS蛋白的結構域位置(圖3B)。
[0038]圖3C -是顯示長SCL34A2-R0S變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1_4與ROS的外顯子32-43相組合。融合連接發生在ROS的跨膜結構域上遊的殘基1750，並且融合連接側翼的核苷酸和胺基酸殘基(分別為SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13)顯示於圖3C的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和胺基酸殘基為常規字體，來自ROS的核苷酸和胺基酸殘基為粗體文本)。
[0039]圖3D -是顯示短SCL34A2-R0S變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1_4與ROS的外顯子32-43相組合。融合連接發生在僅ROS的跨膜結構域上遊的殘基1853，並且融合連接側翼的核苷酸和胺基酸殘基(分別為SEQ ID NO: 14和SEQ ID NO: 15)顯示於圖3D的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和胺基酸殘基為常規字體，來自ROS的核苷酸和胺基酸殘基為粗體文本)。
[0040]圖3E -是顯示預測的非常短SCL34A2-R0S變體的示意圖，其中SCL34A2的外顯子1-4與ROS的外顯子35-43相組合。預測融合連接發生在ROS的跨膜結構域的N-末端邊界處的ROS的殘基1882，並且融合連接側翼的核苷酸和胺基酸殘基(分別為SEQ ID NO: 16和SEQ ID NO: 17)顯示於圖3E的底部(其中來自SCL34A2的核苷酸和胺基酸殘基為常規字體，來自ROS的核苷酸和胺基酸殘基為粗體文本)。
[0041 ] 圖4A -是人SLC34A2-R0S融合蛋白的長變體的胺基酸序列(I字母代碼)(SEQ IDNO:5)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO:6)(下小圖)；SLC34A2部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結構域的殘基為粗體。
[0042]圖4B -是人SLC34A2-R0S融合蛋白的短變體的胺基酸序列(I字母代碼)(SEQ IDNO:7)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO:8)(下小圖)；SLC34A2部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結構域的殘基為粗體。
[0043]圖5 -是人SLC34A2蛋白的胺基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:3) (SwissProt登錄號095436)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO:4) (GeneBank登錄號NM_006424)(下小圖)；參與易位的殘基用下劃線表示。
[0044]圖6A -是人ROS激酶的胺基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:1) (SwissProt登錄號P08922);參與SLC34A2-R0S(長)變體易位的殘基用下劃線表示，用下劃線表示的粗體殘基是參與(短)變體易位的殘基，並且用下劃線表示的粗體紅色殘基是參與預測的(非常短)變體易位的殘基。[0045]圖6B -是人ROS激酶的編碼DNA序列(SEQ ID NO: 2) (GeneBank登錄號NM_002944);參與第一 SLC34A2-R0S(長)變體易位的殘基用下劃線表示，用下劃線表示的粗體殘基是參與第二(短)變體易位的殘基，並且用下劃線表示的粗體大寫殘基是參與(非常短)變體易位的殘基。
[0046]圖7 -是顯示與對照(泳道I和2)相比SLC34A2-R0S融合蛋白(第一(長)變體)在轉染的293細胞(人胚胎腎細胞)中表達的凝膠圖。
[0047]圖8 -顯示⑶74基因和ROS基因分別在染色體5q和6q上的位置(小圖A)，並且全長⑶74和ROS蛋白的結構域位置以及在⑶74-R0S融合蛋白中的位置(小圖B和C (其中SEQ ID NO:30顯示在下面的小圖C中))。融合連接發生在ROS的跨膜結構域上遊的殘某 1853。
[0048]圖9 -是人CD74-R0S融合蛋白的胺基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:22)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO: 23)(下小圖)KD74部分的殘基為斜體，而ROS的激酶結構域的殘基為粗體。
[0049]圖10 -是人CD74蛋白的胺基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO: 24) (SwissProt登錄號P04233)(上小圖)，其中還指明編碼的DNA序列(SEQ ID NO: 25) (GeneBank登錄號NM_001025159)(下小圖)；參與易位的殘基用下劃線表示。
[0050]圖1lA -是人ROS激酶的胺基酸序列(I字母代碼)(SEQ ID NO:1) (SwissProt登錄號P08922);參與⑶74-R0S易位的殘基用下劃線表示。
[0051]圖1lB -是人ROS激酶的編碼的DNA序列(SEQ ID NO:2) (GeneBank登錄號NM_002944);參與⑶74-R0S易位的殘基用下劃線表示。
[0052]圖12 -是描繪通過RT-PCR檢測CD74和ROS易位形成的融合基因的凝膠圖；其中顯示了針對CD74-F1 (頂部)和R0S-GSP3 (底部)的引物序列(分別為SEQ ID NOs: 2627)。
[0053]圖13A-13F -是顯示非小細胞肺癌(NSCLC) FFPE腫瘤組織中ROS蛋白和ROS核酸的免疫組織化學和FISH的照片。ROS蛋白定位的變化顯示如下:(A)瀰漫性胞質，其中插圖(A)中的黃色箭頭說明通過FISH對c-ros基因座的平衡易位。(B)腺癌中ROS的強點狀定位，其中插圖放大(即放大圖像)。(C)大細胞癌中ROS染色的胞質定位和小圖E中相應的蘇木精和伊紅染色。(D)具有獨特胞質染色和膜定位的腺癌，其中顯示膜染色的插圖進行放大。(E)對應於小圖C中的ROS染色的蘇木精和伊紅染色。(F)點狀囊泡染色，其中顯示囊泡染色的插圖放大。
[0054]圖14A和B -是使用雙色斷裂-分離探針(2-color break-a-part probe)通過FISH特異性檢測ROS融合/易位(在人NSCLC細胞系中)的圖像。圖14A顯示了 ROS基因上FISH探針雜交的位置，並且圖14B顯示了人NSCLC細胞系(左)和人NSCLC腫瘤中ROS基因的重排，其導致產生分開的橙色和綠色信號。
[0055]圖15是顯示2個探針組的DNA探針與ROS基因和FIG基因雜交的位置的示意圖。兩個探針組的近端探針(即RP1-179P9)將產生橙色信號，而所有三個遠端探針將產生綠色信號。探針組I源自c-ros，並且如果發生平衡易位，則橙色將與綠色分開；然而如果發生FIG-ROS易位，則綠色信號將消失。探針組2源自c-ros (橙色RP1-179P9)和fig (綠色RP11-213A17)。[0056]圖16A-16F是顯示HCC78細胞(小圖A和B)、U118MG細胞(小圖C和D)和FFPE腫瘤ID 749 (小圖E和F)的FISH分析的結果的照片。用探針組I (A)和探針組2 (B)探測的HCC78細胞顯示了從這些細胞中存在的SLC34A2-R0S融合體預測的結果。黃色箭頭指向表明HCC78細胞中的平衡易位的分開信號，白色箭頭指向完整染色體。用探針組I (C)和探針組2 (D)探測的U118MG細胞顯示了從這些細胞中存在的FIG-ROS融合體預測的結果。用探針組I (E)或探針組2 (F)探測的FFPE腫瘤749與U118MG細胞相同。在用探針組I探測的U-118 MG和腫瘤ID 749兩者中，只有c-ros (橙色)探針退火且缺失區域(綠色探針)不存在(分別為小圖C和E)。在用探針組2探測的U-118 MG和腫瘤ID 749 (分別為小圖E和F)中，c-ros (橙色)和fig(綠色)探針走到一起,表明fig-ros融合。
[0057]圖17顯示了來自腫瘤749的ROS融合蛋白的cDNA測序(在「本序列」行)和其與FIG-ROS(S)核苷酸序列(作為「查詢序列」)的比對的結果。
[0058]圖 18 是顯示在 0nM、3nM、10 nM、30 nM、100 nM、300 nM 或 1000 nM TAE-684 存在的情況下表達FIG-ROS (S)的BaF3 (紅色方形)、表達FIG-ROS (L)的BaF3 (藍色菱形)、表達FLT3ITD的BaF3(綠色三角形)、和Karpas 299細胞(紫色X)的細胞生長響應的線圖。
[0059]圖19是顯示在TAE-684存在的情況下表達FIG-ROS (S)或FIG-ROS (L)的BaF3通過細胞凋亡而死亡的條形圖。
[0060]圖20是顯示TAE-684抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者以及它們的下遊信號傳遞分子的磷酸化的Western印跡分析的描述。
[0061]圖 21 和 21B 是顯示在 0uM、0.01uM、0.03Μ、0.10uM、0.3uM、l.0uM 的 TAE-684(圖21A)或克裡唑替尼(圖21Β)存在的情況下用neo-myc轉導的BaF3細胞(陰性對照；藍色菱形)；表達FIG-ROS (S)的8&?3(紫色乂)、表達？16-1?05仏)的BaF3 (綠色三角形)、表達FLT3ITD的BaF3(紅色方形)和Karpas 299細胞(藍色星號)的細胞生長響應的線圖。
[0062]圖22是顯示克裡唑替尼抑制FIG-ROS(S)和FIG-ROS(L)兩者以及ALK和其他信號傳遞分子的磷酸化的Western印跡分析的描述。
[0063]優選實施方案的詳述
本發明基於在人肺癌中發現異常ROS激酶表達。由於ROS激酶在正常肺組織或細胞中不表達，所以預測異常ROS激酶活性驅動其中其表達的肺癌的增殖和存活。此類癌症可以根據本文提供的教導進行鑑定(例如，診斷)和/或治療。
[0064]基於這些發現，其肺癌(或疑似肺癌)表達具有ROS活性的蛋白(例如，全長ROS蛋白或ROS融合蛋白)的患者(其中健康患者的肺組織不表達此類具有ROS活性的蛋白)可以有利地對ROS抑制劑的施用響應(例如，與患有相同癌症的未經治療的患者相比，癌症的生長可能減緩或停止)。
[0065]本文中提到的公開專利、專利申請、網站、公司名稱和科學文獻確立了本領域技術人員可獲得的知識，且完整地通過引用併入本文，其程度等同於各自被特定且單獨地指示通過引用併入。本文引用的任·何參考文獻和本說明書中的具體教導之間的任何衝突應當以有利於後者的方式來解決。
[0066]在下文中將更詳細地描述本發明的其他方面、優點和實施方案。本文中提到的專利、公開申請和科學文獻確立了本領域技術人員的知識，且完整地通過引用併入本文，其程度等同於各自被特定且單獨地指示通過引用併入。本文引用的任何參考文獻和本說明書中的具體教導之間的任何衝突應當以有利於後者的方式來解決。同樣，詞或短語的本領域理解的定義和本說明書中具體教導的詞或短語的定義之間的任何衝突應當以有利於後者的方式來解決。如本文所使用，以下術語具有所示含義。如本說明書中所使用，單數形式「一(a) 」、「一 (an) 」和「該(the) 」還具體包括它們所指術語的複數形式，除非內容另有清楚指出。術語「約」在本文中用來指接近，在…區間中，粗略地或約。當術語「約」連同數值範圍使用時，它通過延伸所示數值的上限和下限而修改範圍。通常，術語「約」在本文中用來以20%的方差修改所示數值的上限和下限數值。
[0067]本文中使用的科技術語具有本發明所屬領域普通技術人員通常理解的含義，除非本文另有定義。本文參考本領域技術人員已知的各種方法和材料。記載抗體和重組DNA技術的一般原則的標準參考著作(所有這些都通過引用整體併入本文)包括Harlow和Lane，Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1988), Ausubel 等人Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons,New York, N.Y.(1989和更新直至 2010年9 月)，Sambrook等人，Molecular Cloning: ALaboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1989);Kaufman 等人，Eds., Handbook of Molecular and Cellular Methods in Biology inMedicine, CRC Press, Boca Raton (1995); McPherson, Ed., Directed Mutagenesis:A Practical Approach, IRL Press, Oxford (1991)。記載藥學的一般原則的標準參考著作(所有這些都通過引用整體併入本文)包括Goodman和Gilman的The PharmacologicalBasis of Therapeutics,第 11 版，McGraw Hill Companies Inc., New York (2006)。
[0068]在第一個方面，本發明提供了用於檢測生物樣品中具有ROS激酶活性的多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌。該方法包括以下步驟:獲得來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品；並且利用至少一種特異性結合所述具有ROS激酶活性的多肽的試劑來確定所述多肽是否在所述生物樣品中存在，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在所述多肽。
[0069]人ROS激酶蛋白(由ROS`l基因編碼)是2347個胺基酸長的受體酪氨酸激酶，其容易發生異常表達，從而導致癌症。全長人ROS激酶(具有人ROS蛋白的胺基酸序列)的描述可見UniProt登錄號P08922。如圖1中顯示，ROS的信號肽、胞外結構域、跨膜結構域和激酶結構域可見以下SEQ ID NO:1中的胺基酸殘基:
表1__
【權利要求】
1.用於檢測生物樣品中FIG-ROS融合多肽的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌，所述方法包括以下步驟: (a)獲得哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品；並且 (b)利用至少一種特異性結合所述多肽的試劑來確定在所述生物樣品中是否存在所述多肽，其中所述試劑與所述生物樣品的特異性結合的檢測表明所述生物樣品中存在所述多肽。
2.權利要求1的方法，其中所述哺乳動物肺癌是人肺癌。
3.權利要求1的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽與選自下列的多肽95%相同:FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽(SEQ ID NO: 56)和 FIG-ROS(VL)多肽(SEQ ID NO: 60)。
4.權利要求1的方法，其中所述試劑是抗體。
5.權利要求1的方法，其中所述方法以選自流式細胞術測定、免疫組織化學(IHC)測定、免疫螢光(IF)測定、酶聯免疫吸附測定(ELISA)測定法和Western印跡分析測定的形式實施。
6.用於檢測生物樣品中編碼FIG-ROS融合多肽的多核苷酸的存在的方法，所述生物樣品來自哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌，所述方法包括以下步驟: (a)獲得哺乳動物肺癌或疑似哺乳動物肺癌的生物樣品，並且 (b)利用特異性結合編碼所述多肽的所述多核苷酸的試劑來確定在所述生物樣品中是否存在所述多核苷酸，其中所述特異性結合所述編碼所述多肽的多核苷酸的試劑與所述生物樣品的特異性結合 的檢測表明所述生物樣品中存在所述編碼所述多肽的多核苷酸。
7.權利要求6的方法，其中所述哺乳動物肺癌是人肺癌。
8.權利要求6的方法，其中所述FIG-ROS融合多肽與選自下列的多肽95%相同:FIG-ROS(S)多肽(SEQ ID NO: 58)、FIG-ROS (L)多肽(SEQ ID NO: 56)和 FIG-ROS(VL)多肽(SEQ ID NO: 60)。
9.權利要求6的方法，其中所述多核苷酸包含選自SEQID NO: 57、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 59的核苷酸序列。
10.權利要求6的方法，其中所述試劑是核酸探針。
11.權利要求10的方法，其中所述核酸探針是螢光原位雜交(FISH)探針，且所述方法用FISH測定法實施。
12.權利要求6的方法，其中所述試劑包含聚合酶鏈式反應(PCR)引物對，且所述方法用PCR測定法實施。
13.權利要求1或6的方法，其中所述試劑是可檢測地標記的。
14.物質在製備試劑中的用途，所述試劑用於抑制表達FIG-ROS融合多肽的肺癌的進展的方法中，所述方法包括抑制所述多肽在所述癌症中的表達和/或活性的步驟。
15.物質在製備試劑中的用途，所述試劑用於抑制包含編碼FIG-ROS融合多肽的多核苷酸的肺癌的進展的方法中，所述方法包括抑制所述多核苷酸在所述癌症中的表達的步驟。
16.權利要求14或15的用途，其中所述哺乳動物肺癌來自人。
17.權利要求14的用途，其中所述物質是選自PF-02341066、NVTTAE-684和AP26113的治療劑。
18.將患有肺癌或疑似患有肺癌的患者鑑定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者的方法，所述方法包括: 將來自所述患者的肺的生物樣品與特異性結合FIG-ROS融合多肽的試劑相接觸， 檢測所述試劑是否特異性結合所述生物樣品，其中所述試劑與所述生物樣品的結合的檢測將所述患者鑑定為可能對ROS-抑制性治療劑響應的患者。
19.權利要求18的方法，其中所述ROS抑制性治療劑是PF-02341066、NVTTAE-684或AP26113。
20.ROS-抑制性治療劑在製備試劑中的用途，所述試劑用於治療患者的肺癌的方法中，所述方法包括檢測來自患有肺癌或疑似患有肺癌的患者的生物樣品中FIG-ROS融合多肽的存在，並且將有效量的所述試劑施用於所述患者。
21.權利要求20的用途，·其中所述治療劑是PF-02341066、NVTTAE-684或AP26113。
【文檔編號】G01N33/574GK103858011SQ201280036118
【公開日】2014年6月11日 申請日期:2012年5月23日 優先權日:2011年5月23日
【發明者】V.M.林庫納斯, H.哈克, T-L.古, A.郭, A.P.波塞馬託, K.E.克羅斯比, M.A.塔克, C.裡弗斯 申請人:細胞信號科技公司