一種鹽酸萬古黴素的精製方法

2023-09-16 06:17:55

專利名稱：一種鹽酸萬古黴素的精製方法
技術領域：
本發明屬於提純技術領域，具體涉及一種鹽酸萬古黴素的精製方法。
背景技術：
鹽酸萬古黴素是美國禮來公司於1958年開發的，放線菌屬東方擬無枝菌酸菌在適宜的條件下發酵產生的糖肽類抗生素。由於鹽酸萬古黴素與其它抗生素無交叉耐藥，對耐藥的金黃色葡萄球菌等有較強的殺滅作用，始終為臨床醫生所關注。但過去文獻報導認為，萬古黴素有嚴重的腎、耳毒性，故在臨床未被廣泛使用。近年來由於抗生素的大量使用，導致臨床上耐甲氧西林金葡菌(MASA)感染病例日益增多，這種感染對手術後患者，及低免疫力患者是致命的。鹽酸萬古黴素因其所具有的獨特的對革蘭氏陽性菌的抑制機理，被公認為是為數不多的、可用於治療複雜的耐甲氧西林 金葡菌(MASA)感染化學療劑。同時由於近年來新科學技術的不斷發展和運用，使得藥用鹽酸萬古黴素純度在不斷提高。相應的，過去認為鹽酸萬古黴素所具有的嚴重的腎、耳毒性在不斷減少。基於上述這些原因，鹽酸萬古黴素在臨床治療方面起著越來越重要的作用。這樣，建立一個簡便可行、低汙染、適用於工業化生產的精製工藝，製造出高純度的、符合藥用標準的鹽酸萬古黴素有著重要的意義。萬古黴素由其分子化學結構(圖I)上來看，為糖肽類化合物，有很好的水溶性；同時以肽鏈中的酚羥基與二糖成甙鍵，這樣的結構決定了它對酸，鹼尤其是熱的不穩定性，一旦過酸、過鹼，尤其是受熱容易造成甙鍵斷裂，失去二糖。結構還帶有多個游離酚羥基，導致其易氧化成醌式——這可能與終產品常常帶有淺粉紅色有關。同時糖結構上帶有一游離氨基，具有弱鹼性，可與鹽酸形成鹽，而所帶的多個游離酚羥基具有弱酸性，因此是一兩性化合物，有報導稱其等電點是PH 8. I。正是由於萬古黴素化學結構的這些特點，給製造高純度鹽酸萬古黴素造成一定的困難。鹽酸萬古黴素已開發多年，早期的精製方法多採用結晶或沉澱技術，經過濾、熱真空乾燥，得到成品。即往已處理到一定純度的鹽酸萬古黴素溶液中加入能與水互溶的有機溶媒如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇、丙酮、乙腈等使之產生結晶或沉澱，離心或過濾實現固液分離，固體部分經加熱真空乾燥，去除水分及有機溶媒得到產品。採用這種方法所製造的產品純度往往在85 - 93%之間，達不到中國藥典2010版及歐洲藥典6. O版純度在93%以上的要求。近年來各種介質的色譜分離技術在鹽酸萬古黴素純化方面得到廣泛應用，使得純化液中鹽酸萬古黴素純度都能在95%以上。中國專利200710187300. 5採用葡聚糖S印hadexCM-25及瓊脂糖SP Sepharose 或CM Sepharose色譜分離技術,使純度為88%的萬古黴素粗品液純化成純度為95%純化液，純化回收率約為70%。 EP1824874採用反向矽膠(Octadecyl silica gel)分離萬古黴素粗品，可得到純度為97%純化液。W02006/004238使用疏水性吸附樹脂AmberchromCG-161分離,可使純化液純度達到95%以上。儘管採用色譜分離技術截獲的純化液(水溶液)鹽酸萬古黴素純度都能在95%以上，藥品製造規範往往要求製造過程後期有一道結晶或沉澱工序，實現固液分離以去除母液中可能存在的潛在雜質，而不宜直接冷凍乾燥或噴霧乾燥製成產品。因此上述幾個專利均採用加入有機溶媒結晶或沉澱的方法，實現固液分離。所得固體經加熱、真空乾燥製得成品。事實上鹽酸萬古黴素由於化學結構上的特點，要得到各項標準均能達到藥典要求的產品，對結晶條件如溶媒、溫度、攪拌速度等有一定限制，這樣就造成結晶晶體細而粘不易過濾。更困難的是所得到的固體需要加熱、真空乾燥才能達到水分含量小於5%及殘留溶媒小於O. 5%的藥典要求。而加熱往往會造成鹽酸萬古黴素純度的顯著的下降和澄清度不合格——這可能與鹽酸鹽受熱分解有關。 W02010/082726為應對上述困難，披露了一種新的解決方案。他們的研究表明，採用結晶法得到鹽酸萬古黴素在溫度40°C以下真空乾燥，很難達到歐洲藥典6. O項下水分含量應小於5%，殘留溶媒(三類溶媒)應小於O. 5%的要求。在40°C以上溫度真空乾燥，將導致鹽酸萬古黴素破壞，純度由乾燥前的96%在數小時內跌至93%以下。為解決這些困擾，他們經加入有機溶媒結晶並經固液分離得到的溼粉，此溼粉鹽酸萬古黴素純度達96%以上，水分及溶媒30-50%，將此溼粉用純化水溶解，用反滲透膜濃縮到一定體積，再加入等體積純化水，繼續用反滲透膜濃縮到一定體積，如此反覆多次，相當於用水洗滌鹽酸萬古黴素溶液多次，以去除溼粉所帶的無機鹽及溶媒，然後用反滲透膜濃縮到約120克-170克/升，調pH
2.5，經活性炭脫色及無菌過濾，最後進行冷凍乾燥，得到鹽酸萬古黴素粉，產品符合歐洲藥典6. O版標準。這種解決方法實現了固液分離的精製要求，同時也避免了熱真空乾燥，不失為實際工業化生產可行的一種工藝。但是該精製工藝採用加入近2倍量(V/V)的乙醇結晶方法，這類結晶方法有幾點缺陷1)採用加入能與水互溶的有機溶媒結晶方法，受限於結晶過程不能加熱及PH2. 5-3. O之間，所得到的晶體細而粘，很難過濾。2)母液中的有機溶媒需加熱回收，造成母液中帶有的總量10-20%的鹽酸萬古黴素受熱降解而無法回收利用。3)母液中未回收完全的有機溶媒及鹽酸萬古黴素受熱降解物對環保處理造成的壓力。綜上所述，為生產出高純度、高收率、符合現行各國藥典標準的鹽酸萬古黴素，有必要建立一個更優化的，環境友好的鹽酸萬古黴素精製工藝。

發明內容
本發明的目的在於提供一種鹽酸萬古黴素的精製方法，本發明操作簡便，收得率高，是一種切實可行的工業化精製工藝。為實現上述目的，本發明採用如下技術方案
一種鹽酸萬古黴素的精製方法，將純度在90%以上的鹽酸萬古黴素溶液精製為純度在95%以上的鹽酸萬古黴素，精製過程實現固液分離，不使用有機溶媒，收率在80%以上。所述的精製方法包括以下步驟
(I)將待精製的純度在90%以上的鹽酸萬古黴素溶液冷卻至15°C以下，用氯化銨-氨水緩衝對配製成PH為8. 0-8. I的懸浮液；
待精製的純度在90%以上的鹽酸萬古黴素溶液濃度控制在50-150克/升之間，最佳濃度為60-120克/升。將氯化銨固體投入待精製的鹽酸萬古黴素溶液，攪拌使之溶解，質量體積濃度控制在I. 0-2. 5%之間。在已投入氯化銨的溶液中邊攪拌邊用6N氨水調pH至8. 0-8. I之間；繼續攪拌1-2小時使之沉澱完全，靜置8-12小時；全部操作均在溶液溫度15°C以下進行。(2)充分攪拌步驟(I)的懸浮液使之沉澱完全，經離心或其他過濾方式進行固液分離；固體置高真空、30°C以下乾燥24小時；
萬古黴素是一種兩性化合物，在等電點PH=8. 0-8. I附近所析出的晶體顆粒大，極易過濾。與用溶媒法或鹽析法所得晶體相比有顯著的差異。固液分離所得到的母液，可直接加入前道色譜分離工序，回收鹽酸萬古黴素。所得固體置(TC下保存數周，純度幾乎沒有變化，因此可作為穩定的中間體進行儲存。(3)用純化水和4M鹽酸溶液將步驟(2)的固體溶解成濃度為20-25克/升、pH為2. 5-3. 5的鹽酸萬古黴素溶液；用150Da納濾膜濃縮至濃度為30-50克/升；加入與溶液等體積注射用水進行透析洗滌並重複透析洗滌5次；然後將溶液繼續納濾濃縮至濃度為120-150克/升；整個過程溶液溫度始終控制在15°C以下；用注射用水反覆透析洗滌是為去除溶液中可能帶有的無機鹽，主要是氯化銨。(4)將步驟(3)的濃度為120-150克/升的鹽酸萬古黴素濃縮液用4M HCl調pH至2. 5-3. 5，加入佔鹽酸萬古黴素固體質量5-10%的活性碳脫色、除熱源，再經過精濾，進行冷凍乾燥；所得鹽酸萬古黴素純度在95. 0%以上，精製收率在80%以上，產品質量符合中國藥典，及歐洲、美國藥典要求。本發明操作簡便，收得率高。以往工藝在精製前都要求鹽酸萬古黴素溶液的純度在95%以上，這樣才能保證最後成品純度在藥典要求的93%以上。本發明僅要求鹽酸萬古黴素溶液的純度在90%以上,經過結晶，固體粉純度可提高到95%以上,最後成品純度可確保在93%以上。做過色譜分離的人都知道，在相同的柱效條件下，要獲得純度高的分離液，截獲的部位往往比較窄，收得率比較低。如果分離液純度要求低些，截獲的部位可以比較寬，收得率比較高。本發明所提及的鹽酸萬古黴素的純度是採用中國藥典2010版所規定的HPLC法所測定的，該方法與歐洲藥典7. O版規定的方法是一致的。


圖I是鹽酸萬古黴素分子結構式。圖2是鹽酸萬古黴素液(分離液)純度HPLC圖譜。圖3是萬古黴素粉純度HPLC圖譜。圖4是鹽酸萬古黴素成品純度HPLC圖譜。
具體實施例方式以下實例對本發明作一些具體說明，但並不表示本發明僅局限於以下實例及實例所提及的工藝參數範圍內。實施例I :鹽酸萬古黴素溶液的製備
將濃度為87克/升，純度82%鹽酸萬古黴素提取液3. 62升，通過裝有4升PS/DVB反向色譜填料的層析柱。隨後用5%正丁醇水溶液梯度頂洗，頂洗後期正丁醇水溶液濃度升至10%。用自動收集器分段收集洗出流分，並用HPLC法檢測流分純度。合併純度在90%以上的流分，納濾濃縮，得到鹽酸萬古黴素溶液3. 45升。濃度68. 98克/升，收率85. 0%，純度91. 82%，見圖 2。實施例2 萬古黴素製備
將實例I所製得的鹽酸萬古黴素液3升，置15°C的冷水浴中。攪拌下加入30克氯化銨固體，充分攪拌使之完全溶解，攪拌下用4N的氨水調pH=8. 08，攪拌3小時，其間有大量固體析出，靜置過夜。抽濾濾集固體。所得固體經高真空、30°C乾燥4小時後，磨粉，再置高真空、30°C乾燥20小時。得萬古黴素固體197. 4克。效價868 μ g/mg，收率90. 18%，純度95. 68%，見圖 3。實施例3 鹽酸萬古黴素製備
將實例2所製得的萬古黴素固體180克懸浮於8升純化水中，冷卻至5°C，攪拌下用4M鹽酸調pH2. 8，充分攪拌使之完全溶解。將此溶液置納濾系統，濃縮至4升體積。加入4升純化水，繼續濃縮至4升體積。重複如此洗滌操作5次。最後將此溶液濃縮至I. 3升體積。
上述濃縮液中加入活性碳10克，室溫下攪拌30分鐘，過濾，濾液再經O. 22 μ m膜過濾，裝盤，置冷凍乾燥機，_45°C冷凍4小時。開啟真空至15Pa以下進行升華，並升溫至-10°C，在此溫度保持真空10小時。隨後繼續升溫到0°C並保持真空5小時，最後升溫至30 1保持真空3小時。收粉，得產品鹽酸萬古黴素142. 5克，收率91. 20%。樣品經測定符合中國藥典2010版及歐洲藥典7. O版的標準，其中，水分含量4. 3%，純度95. 12%，見圖3。以上所述僅為本發明的較佳實施例，凡依本發明申請專利範圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發明的涵蓋範圍。
權利要求
1.一種鹽酸萬古黴素的精製方法，其特徵在於將純度在90%以上的鹽酸萬古黴素溶液精製為純度在95%以上的鹽酸萬古黴素，精製過程實現固液分離，不使用有機溶媒，收率在80%以上。
2.根據權利要求I所述的鹽酸萬古黴素的精製方法，其特徵在於所述的精製方法包括以下步驟 (1)將待精製的純度在90%以上的鹽酸萬古黴素溶液冷卻至15°C以下，用氯化銨-氨水緩衝對配製成PH為8. 0-8. I的懸浮液； (2)充分攪拌步驟(I)的懸浮液使之產生沉澱，固液分離；固體在真空、30°C以下乾燥； (3)用純化水和4M鹽酸溶液將步驟(2)的固體溶解成濃度為20-25克/升、pH為.2.5-3. 5的鹽酸萬古黴素溶液；用150Da納濾膜濃縮至濃度為30-50克/升；加入與溶液等體積注射用水進行透析洗滌並重複透析洗滌5次；然後將溶液繼續納濾濃縮至濃度為120-150克/升；整個過程溶液溫度始終控制在15°C以下； (4)將步驟(3)的濃縮液按常規方法進行活性碳脫色、精濾、冷凍乾燥，即得到鹽酸萬古黴素，其純度在95. 0%以上，收率在80%以上。
3.根據權利要求2所述的鹽酸萬古黴素的精製方法，其特徵在於待精製的純度在90%以上的鹽酸萬古黴素溶液濃度控制在50-150克/升之間，最佳濃度為60-120克/升。
4.根據權利要求2所述的鹽酸萬古黴素的精製方法，其特徵在於將氯化銨固體投入待精製的鹽酸萬古黴素溶液，攪拌使之溶解，質量體積濃度控制在I. 0-2. 5%之間。
5.根據權利要求2所述的鹽酸萬古黴素的精製方法，其特徵在於在已投入氯化銨的溶液中邊攪拌邊用6N氨水調pH至8. 0-8. I之間；繼續攪拌1-2小時使之沉澱完全，靜置8-12小時；全部操作均在溶液溫度15°C以下進行。
6.根據權利要求2所述的鹽酸萬古黴素的精製方法，其特徵在於步驟(2)的固液分離經離心或其他過濾方式進行；所得固體置高真空、30°C以下乾燥24小吋。
7.根據權利要求2所述的鹽酸萬古黴素的精製方法，其特徵在於將濃度為120-150克/升的鹽酸萬古黴素溶液用4M HCl調pH至2. 5-3. 5，加入佔鹽酸萬古黴素固體質量5-10%的活性碳脫色、除熱源，再經過精濾，進行冷凍乾燥；所得鹽酸萬古黴素符合中國藥典，及歐洲、美國藥典要求。
全文摘要
本發明公開了一種鹽酸萬古黴素的精製方法，將純度在90%以上的鹽酸萬古黴素溶液精製為純度在95%以上的鹽酸萬古黴素，精製過程實現固液分離，不使用有機溶媒，收率在80%以上。固液分離所得到母液中的萬古黴素可返回前道分離工序回收。本發明操作簡便，收得率高，是一種切實可行的工業化精製工藝。
文檔編號C07K9/00GK102863519SQ20121033669
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者趙寧, 方整國, 許錫南, 方如穗, 羅福東 申請人:福建博美生物技術有限公司