供hplc分析的萬古黴素發酵液前處理方法
2023-09-16 06:18:15 2
專利名稱：供hplc分析的萬古黴素發酵液前處理方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵液的前處理方法，尤其涉及一種供HPLC分析的萬古黴素發酵液前處理方法。
背景技術：
萬古黴素屬於糖肽類抗生素，對革蘭氏陽性菌有較強的抗菌作用，尤其是對MRSA有較好的療效，故萬古黴素的生產與研發日益受到重視。最早研究萬古黴素是國外Micormick等從一株東方鏈黴菌的發酵液中分離得到；國內的研究主要有東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis SIPI-43491)(見申請號CN01132048.6的專利申請)及其突變株東方擬無枝酸菌CGMCCNo.1183(見申請號CN200410067197.7的專利申請)，它們的發酵液中都可以分離出萬古黴素。很顯然，萬古黴素發酵液單位的檢測在萬古黴素的生產與研發中也日益突出。目前最常用的發酵液單位的檢測是高效液相色譜法(HPLC)，相對於生物檢測或其他方法，高效液相色譜儀(HPLC)法具有快速、準確的優點，所以其應用也日益廣泛。在應用HPLC法檢測發酵液單位中，發酵液前處理方法的優劣對檢測結果的準確性及色譜儀色譜柱的損傷程度影響較大，因而對發酵液前處理方法的改進與提高很有意義。
現有技術中，萬古黴素發酵液前處理技術(陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁)是將萬古黴素發酵液用4mol/L HCL調pH至4.5，於3500r/min離心10min，去除菌絲體與固體雜質，吸取1mL上清液，在12000r/ml條件下離心10min，上清液樣品供HPLC檢測，該HPLC柱在分析完50個上清液樣品後，柱壓上升15％，目的峰的理論塔板數下降10％。此萬古黴素發酵液前處理方法缺點在於所用酸的酸性過強易使萬古黴素降解，從而影響測定的準確性。這樣處理後的上清液中還可能有雜蛋白甚至菌體和其他微小顆粒殘留，對HPLC分析及儀器不利。當進行多個發酵液樣品分析後，部分雜蛋白會黏附在色譜柱的柱頭，有些黏附是不可逆的，會縮短柱壽命，且會使柱壓升高，對高效液相色譜儀的泵不利，同時雜質會影響柱的分離效果，以致影響目的物與雜質的分離度，從而影響分析的準確性。
發明內容
本發明的目的旨在提高HPLC分析萬古黴素發酵液單位的準確性，提高高效液相色譜柱的分離效果和使用壽命，提供一種供HPLC分析的萬古黴素發酵液前處理方法。
本發明的上述目的是通過下列技術方案來實現的本發明的供HPLC分析的萬古黴素發酵液前處理方法包括如下步驟1)用有機弱酸將萬古黴素發酵液的pH調節至4.0～4.5，過濾得濾液或離心分離得上清液，以去除菌絲體與固體雜質。在本發明中使用有機弱酸處理萬古黴素發酵液不會破壞萬古黴素的結構，從而確保發酵液單位測定的準確性。
2)將上述的濾液或上清液與甲醇以1∶0.5～2的體積比，較佳地是1∶1的體積比混合均勻，離心，離心後的清液即可作為樣品用於高效液相色譜儀(HPLC)分析其萬古黴素單位。將步驟1)得到的濾液或上清液進一步使用甲醇處理在確保萬古黴素不會降解的同時可以除去很大一部分雜質，減少含萬古黴素的樣品影響HPLC柱的性能，提高柱的使用壽命。
其中，較佳地是在步驟2)離心後的上清液用孔徑為0.22～0.6μm，較佳地是0.45μm的偏氟膜過濾，以進一步除去微小的顆粒雜質。
步驟1)中所述的有機弱酸較佳地為C1～3的有機弱酸，更佳地為醋酸、草酸、或者醋酸和草酸的混合酸，該混合酸可以以任何比例混合。
步驟1)中所述的離心較佳地是在3500～4000r/min下離心8～20分鐘，較佳地是15分鐘。
步驟2)中所述的離心較佳地是在10000～12000r/min條件下離心8～20分鐘，較佳地是10分鐘。
在本發明中，所述的萬古黴素發酵液是指任何產萬古黴素的菌株在適當的條件下發酵產生出來的萬古黴素發酵液；較佳地是東方擬無枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)在可發酵產生萬古黴素的發酵培養基中，正常發酵條件下發酵出來的發酵液，如東方擬無枝酸菌Amycolatopsis orientalisSIPI-43491(見申請號CN01132048.6的專利申請)和其突變株CGMCCNo.1183(見申請號CN200410067197.7的專利申請)產生的萬古黴素發酵液；也可以是現有技術(如陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁)中提到的萬古黴素發酵液。
本發明的積極進步效果在於用本發明的發酵液前處理方法處理萬古黴素發酵液後，供HPLC分析的樣品中的雜質大大降低，連續進行上百個樣品分析，未見柱壓升高，分析效果良好。
具體實施例方式
實施例1取一定量萬古黴素發酵液(同現有技術「陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁」)，用HAC調pH至4.0，於4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質；吸取一定量的上清液，按體積比1∶1加入甲醇，混合均勻，在12000r/min條件下離心10min；然後再用0.45μm偏氟膜過濾；過濾後的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同「陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁」)。該HPLC柱連續分析50個樣品後，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數為6500～6600；分析前後，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數未下降。
實施例2
取一定量的萬古黴素發酵液(同現有技術「陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁」)，用草酸調pH至4.5，於4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝1∶2的體積比加入甲醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心10min；然後再用0.45μm偏氟膜過濾；過濾後的清液樣品供HPLC檢測分析(HPLC檢測條件同「陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁」)。該HPLC柱連續分析50個清液樣品後，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數6500～6600；分析前後，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數未下降。
實施例3取一定量的萬古黴素發酵液(同申請號CN200410067197.7的專利申請)，用草酸與醋酸的混合物(質量比為1∶1)調pH至4.5，於4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝2∶1的體積比加入甲醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心10min；然後再用0.22μm偏氟膜過濾，過濾後的清液樣品用HPLC檢測分析(HPLC檢測條件同「陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁」)。該HPLC柱連續分析50個清液樣品後，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數為6500～6600；分析前後，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數未下降。
實施例4取一定量的萬古黴素發酵液(同申請號CN200410067197.7的專利申請)，用草酸與醋酸的混合物(質量比為1∶1)調pH至4.5，於4000r/min離心15min，去除菌絲體與固體雜質；吸取一定量的上清液，按上清液∶甲醇＝1∶1的體積比加入甲醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心10min；然後再用0.45μm偏氟膜過濾，過濾後的清液樣品用HPLC檢測分析(HPLC檢測條件同「陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁」)。該HPLC柱連續分析50個清液樣品後，柱壓為123～125bar，目的峰的理論塔板數為6500～6600；分析前後，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數未下降。
實施例5取一定量的萬古黴素發酵液(同申請號CN01132048.6的專利申請)，用丙酸調pH至4.3，過濾，去除菌絲體與固體雜質；吸取一定量的濾液，按濾液∶甲醇＝1∶1的體積比加入甲醇，混合均勻，在11000r/min條件下離心10min；離心後的清液樣品用HPLC檢測分析(HPLC檢測條件同「陳代傑等，萬古黴素的研究開發，中國抗生素雜誌，2004年1月，第29卷，第1期，p8頁」)。該HPLC柱連續分析50個清液樣品後，柱壓為127～129bar，目的峰的理論塔板數為6500～6600；分析前後，柱壓略有升高(上升約3.2％)，HPLC的分析效果良好，目的峰的理論塔板數未下降。
權利要求
1.一種供HPLC分析的萬古黴素發酵液前處理方法，其特徵在於該方法包括如下步驟1)用有機弱酸將萬古黴素發酵液的pH調節至4.0～4.5，過濾得濾液或離心分離得上清液；2)將上述的濾液或上清液與甲醇以1∶0.5～2的體積比混合均勻，離心。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於步驟2)中離心後的上清液用孔徑為0.22μm～0.6μm偏氟膜過濾。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於步驟2)中離心後的上清液用孔徑為0.45μm偏氟膜過濾。
4.根據權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於步驟1)中所述的有機弱酸為C1～3的有機弱酸。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於步驟1)中所述的有機弱酸為醋酸和/或草酸。
6.根據權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於步驟1)中所述的離心是在3500～4000r/min下離心8～20分鐘。
7.根據權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於步驟2)中所述的濾液或上清液與甲醇以1∶1的體積比混合均勻。
8.根據權利要求1、2或3所述的方法，其特徵在於步驟2)中所述的離心是在10000～12000r/min下離心8～20分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種供HPLC分析的萬古黴素發酵液前處理方法，該方法包括如下步驟1)用有機弱酸將萬古黴素發酵液的pH調節至4.0～4.5，過濾得濾液或離心分離得上清液；2)將上述的濾液或上清液與甲醇以1∶0.5～2的體積比混合均勻，離心。用該方法預處理髮酵液後，供HPLC分析的樣品中的雜質大大降低，連續進行上百個樣品分析，未見柱壓升高，分析效果良好，而且分析的萬古黴素準確率高。
文檔編號G01N1/28GK1861629SQ200510110958
公開日2006年11月15日 申請日期2005年11月30日 優先權日2005年11月30日
發明者陳代傑, 劉垚, 李繼安, 戈梅, 陶正利, 葉衛東 申請人:上海醫藥工業研究院