基於pcr的串聯重複序列快速構建法和專用引物對及應用的製作方法

2023-09-15 23:35:35

專利名稱：基於pcr的串聯重複序列快速構建法和專用引物對及應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種串聯重複序列的構建方法，尤指一種用PCR快速構建串聯重複序列的方法及該方法在酵母單雜交中啟動子核心重複序列構建中的應用。
背景技術：
真核生物中各種轉錄因子在轉錄水平的調控是基因表達調控的主要方式。典型的轉錄因子都有DNA結合區與轉錄激活區(或抑制區)，在特定的時間、部位或特定條件(如脅迫條件)下，特定的轉錄因子與靶基因啟動子的順式作用元件特異性結合併相互作用， 就可以激活或抑制靶基因的表達。要闡明細胞內各種信號轉導與基因表達的機制，以及細胞對外界環境刺激引起的一系列信號傳遞與應答基因表達調控等機理，鑑定各種調控基因表達的順式作用元件和轉錄因子至關重要。酵母單雜交方法是根據DNA結合蛋白(即轉錄因子)與DNA順式作用元件結合調控報導基因表達的原理來克隆或鑑定轉錄因子基因。而該酵母單雜交方法中，構建酵母報導子是用酵母單雜交方法鑑定特定轉錄因子中的一個重要內容。報導子的結構是將已知的特定順式作用元件構建到最基本啟動子Pmin上遊，Pmin啟動子下遊連接報導基因。進行CDNA 融合表達文庫篩選時，編碼目的轉錄因子的cDNA融合表達載體轉化進入酵母細胞後，其編碼產物(轉錄因子)與順式作用元件結合，就可以激活Pmin啟動子，並促使報導基因表達。 一般來說，需要在最基本啟動子Pmin上遊構建3個以上按同一方向串聯連接的順式元件的重複序列。但是，現有構建順式元件重複序列通常採用在順式作用元件的兩端加同一酶切位點，進行酶切後回收再用T4連接酶連接。由於順式作用元件通常較小(小於IOObp)，回收的效率低，同時連接時會出現正向連接和反向連接兩種情況，出現3個以上的重複片段的機率很小，只有約2 %左右，篩選和鑑定相當麻煩。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是針對上述現有技術的不足，提供一種基於PCR的串聯重複序列快速構建法和專用引物對及應用，具體地說，就是用PCR的方法快速，構建一系列重複基因，用於酵母單雜交中啟動子核心重複序列的構建，也可用於構建快速重複系列表達相同的蛋白結構域。為了解決上述技術問題，本發明所採用技術方案是一種用於擴增低拷貝方向相同的順式作用元件的串聯重複序列的引物對，其特點是所述引物對是根據目的順式作用元件的序列來設計，正向引物取目的順式作用元件序列的前20bp;反向引物由兩部分組成，前半部分27個鹼基取目的順式作用元件序列的前27bp的反向互補序列，後半部分23 個鹼基取目的順式作用元件序列的最後23bp的反向互補序列。—種基於PCR的串聯重複序列快速構建法，該方法是以按上述引物對的設計方法，根據目的順式作用元件設計的引物對，對目的順式作用元件進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的低拷貝串聯重複序列。本發明還可以上述低拷貝串聯重複序列為模板，以根據目的順式作用元件設計的引物對對其進行PCR擴增，可得到方向相同的目的順式作用元件的高拷貝串聯重複序列。 該高拷貝串聯重複序列在高分子重複蛋白質生產中應用極廣。上述目的順式作用元件是DRE順式作用元件。上述引物對為正向引物5> CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA < 3。

本發明還提供了上述引物對在構建酵母單雜交系統啟動子核心重複序列中的應用。以及本發明構建法在構建酵母單雜交系統啟動子核心重複序列中的應用。本發明主要解決了現有技術中多拷貝DRE(3個以上)串聯的問題。現有技術構建串聯DRE序列通常採用酶切和連接的方法，將同一序列用Hind III進行單酶切後，由於兩端的酶切位點相同，出現反接的概率達到50%，要想篩選到同向串聯4個以上相當困難。採用本發明，設計一對引物，採用PCR法，不依賴於酶切和連接，就可以獲得3個同向串聯的克隆18%以上，而且，由於引物設計的原因，不會出現反接的現象。該方法快速、高效、簡單， 並且可能同時獲得2X、3X、4X等一系列同向串聯順式作用元件的重複序列，沒有顛倒連接的現象，也沒有反覆回收的麻煩，鑑定和篩選非常快捷方便。從而，大大簡化了實驗程序， 加快了實驗速度。此外，本發明還能獲得200個以上的同向串聯子，對於獲得高拷貝重複序列，高拷貝高分子重複蛋白質也有極廣泛的用途。


圖1是用PCR法構建DRE串聯子的原理圖。圖2是低拷貝DRE串聯子產物的電泳圖。其中，泳道2-5 分別為反應5，15，25，35循環後的產物；M =IOObp ladder ；泳道1 陰性對照。圖3是串連子4XDRE的測序結果圖，顯示無酶切位點。圖4是高拷貝DRE串聯子產物的電泳圖。其中，泳道1 反應20循環後的產物；泳道2 反應10循環後的產物；泳道3、4 反應30循環後的產物；泳道5、6 反應40循環後的產物；M IOObp ladder。圖5是將4XDRE串聯子分別連接到pHISi和pLacZi上的酶切結果電泳圖。其中，M:200bp Lad ；泳道 1 :pHISi_4XDRE酶切電泳圖；泳道2 :pLacZi_4XDRE酶切電泳圖。圖6是將含4XDRE序列的pHISi和pLacZi分別轉化YM4271酵母的結果圖。其中，右上圖含pHISi_4XDRE的YM4271酵母在缺陷培養基(SD/_His)上的生長情況，左上圖陰性對照；右下圖含pLacZi-4XDRE的YM4271酵母利用β -半乳糖苷酶活性進行藍色顯性反應，左下圖陰性對照。
具體實施例方式以下將對本發明作進一步地說明。rd29A基因是Yamaguchi-Shinozaki等從乾旱處理的擬南芥中克隆而成，它不僅受乾旱的誘導，也受高鹽及低溫的誘導。rd29A基因的表達在乾旱高鹽及低溫脅迫下，受 DREB類轉錄因子調控。其啟動子序列鑑定出了 71bpDRE順式作用元件(其序列見SEQ ID NO. 1)，這個順式作用元件中含有TACCGACAT核心序列。一、用PCR法構建低拷貝同向串聯DRE重複序列材料含rd29A啟動子71bp DRE順式作用元件的pCAMBIA1301質粒(中科院遺傳
與發育研究所陳受宜教授提供)。1、引物對的設計是根據29A啟動子71bp DRE順式作用元件序列，用 PrimerPremier 5. 0程序設計。正向引物取29A啟動子71bp序列前20bp。反向引物由兩部分組成，前半部分27個鹼基取29A啟動子71bp序列前27bp的反向互補序列，這部分序列在進行第一輪反應後，其互補序列可以成為長引物成為正向引物，參與下一輪PCR反應生成2X或nXDRE序列；反向引物的後半部分23個鹼基取29A啟動子71bp序列最後23bp 的反向互補序列，這23bp可以在任一輪PCR中作為反向引物，生成2 X或η X DRE序列。正向引物為5> CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA <3，見 SEQ IDW). 3。其中反向引物又可作為中間引物，將相同的兩個rd29A啟動子序列同向連接在一起。擴增rd29A啟動子序列的上述引物對由美國英傑生命技術有限公司(Invitrogen 公司)合成。2、用長引物PCR法獲得低拷貝DRE串聯子以上述引物對rd29A啟動子序列進行PCR擴增，以下試劑中的Taq酶、10 X Buffer 5、及dNTP購自天根生化科技(北京)有限公司(TIANGEN公司)；50 μ 1反應體系包括Taq酶0. 3微升(2. 5U/微升)，IOXBuffer 5微升， dNTP (2. 5mmol)2. 5μ l，pCAMBIA1301 質粒 25ng，正向引物加 0. 25 μ 1，終濃度約為 0. 05 μ Μ, 反向引物加2. 5 μ 1，終濃度約為0. 5 μ Μ，雙蒸水補至所需體積。PCR 程序為① 94°C，預變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1. 5min (第②步到第④步循環數設5，15，25，35四個梯度)；⑤72°C，延長7min ( 一個循環)。該反應體系中可能會發生的反應有多步，如圖1所示。取擴增產物按常規技術進行電泳測定，電泳結果如圖2所示。結果表明，前25個循環主要發生的是圖1的第II步反應，35個循環就可明顯看出有3X和4XDRE和產生，說明當1 X、2XDRE較多時，就會發生第III、IV步以後的反應。3、ηXDRE 的亞克隆切取上述擴增產物中的3Χ或4XDRE條帶，採用QIAGEN公司的MinEluteGel Extraction Kit試劑盒，按說明書進行回收，插入pGEM_T載體。插入pGEM-T載體的亞克隆步驟包括①準備選擇性培養基配500ml LB培養基(胰蛋白腖tryptone 5g，酵母粉yeast extract 2. 5g，NaC15g, pH7. 0)，高壓滅菌，待冷至60°C左右加入氨苄(Amp)儲存液使終濃度為50mg/L，然後搖勻後倒平板；
②準備含X-gal和IPTG的篩選培養基X_gal儲液(20mg/ml)用二甲基甲醯胺溶解X-gal配製成20mg/ml的儲液，包以鋁箔或黑紙以防止受光照被破壞，儲存於-20°C;IPTG 儲液(200mg/ml)在800 μ 1蒸餾水中溶解200mg IPTG後，用蒸餾水定容至lml，用0. 22 μ m 濾膜過濾除菌，分裝於印pendorf管並儲於_20°C ；在①步驟中製備好的含50mg/L Amp的 LB平板表面加40ml X-gal儲液和4 μ 1 IPTG儲液，用無菌玻棒將溶液塗勻，置於37°C下放置3-4小時，使培養基表面的液體完全被吸收，置於暗處備用；

③將PCR回收產物插入pGEM-T載體10μ 1反應體系包括連接反應緩衝液 2XBuffer(60mM Tris-HCl(pH 7.8),20mM MgC12,20mM DTT，2mM ATP, 10% polyethylene glycol (MW8000, ACS Grade) 5 μ 1、T4DNA 連接酶(T4DNAligase) 1 μ l、pGEM_T 載體 1μ 1、回收產物3μ 1，4°C連接16小時；④將連接產物加入T0P10感受態細胞(購自TIANGEN公司)中，輕輕混勻，立即置冰上30min ；將管置42°C恆溫水浴中熱激90s，然後迅速置於冰上l-2min ；加入800 μ 1預熱的LB液體培養基，37 °C預表達培養45-60min ；⑤將上一步培養基塗於加有Amp且含X_gal和IPTG的篩選培養基上，37°C過夜培養12-16小時；⑥每個培養皿裡能長出200個左右的白斑和幾個藍斑，篩選白斑進行一步實驗。4、陽性克隆的PCR檢測和測序驗證隨機挑選50個白斑，每個分別加入含有 50mg/L Amp的lml LB液體培養基搖菌12小時至液體混濁。以混濁菌液為模板用pGEM_T 載體的通用測序引物T7和SP6進行PCR檢測。引物 T7 5，-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3，，SP6 :5， -ATTTAGGTGACACTATAG-3，； 50 μ IPCR 反應體系包括 Taq 酶 0. 3 μ 1 (2. 5U/ 微升)，10 X Buffer 5 μ 1，新鮮混濁菌液1μ l，dNTP(2. 5mmol)2. 5μ 1，用T7和SP6引物作正反向引物(各加2. 5 μ 1，終濃度約為0. 5 μ Μ)，加雙蒸水至50 μ 1進行PCR檢測。PCR 程序為① 940C，預變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1. 5min (第②步到第④步循環數為30)；⑤72°C，延長7min ( 一個循環)。結果表明，50個菌中的2XDRE菌為26個，3XDRE為6個，4XDRE為3個。3個以上重複的達到18%以上。將獲得PCR驗證含有4XDRE的一個白斑進行進一步搖菌，用高純度質粒小提中量試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，DP107-02)提取質粒，送Irwitrogen公司測序。測序結果見圖3所示，4個DRE序列連接準確，連接部位沒有酶切位點。4個ACCGAC 框沒有鹼基突變。二、用長引物PCR法獲得高拷貝DRE串聯子所用PCR試劑及量、引物對同低拷貝DRE串聯子所用的相同，不同的是模板採用上一步提取的含4 X DRE質粒約25ng。PCR 程序為① 940C，預變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1.5min(第②步到第④步循環數調整為10，20，30，40)；⑤72°C，延長7min(—個循環)。取PCR擴增產物按常規技術進行電泳測定，結果如圖4所示，結果表明，20個循環後主要發生的是第V步反應，20-30個循環內，產物的拷貝數主要分布在500-1500bp之間。 30個循環以後nXDRE的長度遠遠超過了 1500bp，說明DRE的串聯拷貝數超過了 200個。 三、低拷貝同向串聯DRE重複序列在酵母單雜交中的應用材料pHISi、pLacZi載體、YM4271酵母及DH5a感受態購自 MATCHMAKEROne-Hybrid System 試劑盒(Clontech，K1603-1)，T4DNA 連接酶和 Buffer 購自 Promega0l、pHISi_4XDRE 和 pLacZi_4XDRE 載體的構建參照Clontech公司提供的用戶手冊，將獲得測序驗證的pGEM-T-4XDRE通過酶切和連接，將4XDRE序列分別連接到pHISi和pLacZi載體上。參照Clontech公司提供的用戶手冊，將獲得測序驗證的pGEM-T-4XDRE用T7 (帶 Xho I 酶切位點，由 Invitrogen 公司合成，5，-CCGCTCGAGCGGGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3，，劃線部分為Xho I酶切位點)和SP6引物擴增4XDRE序列和pGEM-T載體上的多克隆位點50 μ 1 PCR 反應體系包括 Taq 酶 0. 3 μ 1 (2. 5U/ 微升)，IOXBuffer 5 μ 1，含 4XDRE質粒25ng，dNTP (2. 5mmol) 2. 5 μ 1，用Τ7引物(含Xho I酶切位點)和SP6引物作正反向引物(各加2. 5 μ 1，終濃度約為0. 5 μ Μ)，加雙蒸水至50 μ 1進行PCR檢測。PCR 程序為① 94°C，預變性 5min ；② 94°C，變性 35s ；③ 60°C，退火 30s ；④ 72°C， 延長1. 5min (第②步到第④步循環數為30)；⑤72°C，延長7min ( 一個循環)。用超薄DNA產物純化試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司，DP203-02)回收純化擴增條帶用於下一步酶切連接實驗。(1)酶切一用Xho I和Sal I (TaKaRa)分別雙酶切帶兩位點的4XDRE序列PCR 擴增產物和PLacZi空載體，分別用TIANGEN膠回收試劑盒切膠回收。酶切體系如下(20 μ L)4 X DRE 或載體 pLacZi 約 1 μ gIOXHigh buffer2μ 1Xho I1 μ 1Sail1 μ 1_______________________________________________________加雙蒸水至20 μ 1 (Total)酶切二 用Sac I和Sac II (TaKaRa)分別雙酶切帶兩位點的4XDRE序列PCR擴增產物和PHISi空載體，分別用TIANGEN膠回收試劑盒切膠回收。酶切體系如下(20 μ L)4XDRE 或載體 pHISi約 1μg10XHigh buffer2μ 1Sac I1 μ 1Sac II1 μ 1_______________________________________________________加雙蒸水至20 μ 1 (Total)37°C放置2h，的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產物分別切膠後，用試劑盒純化。(2)連接用T4DNA連接酶(Promega)進行連接反應，目的基因片段與載體的摩爾數之比約為3 1。 反應體系(10 μ L)，酶切一和酶切二的4XDRE序列分別與相應的酶切載體進行連接4 °C連接過夜。(3)轉化大腸桿菌DH5 α :將連接產物熱激轉化大腸桿菌感受態細胞DH5 α (步驟參考用戶手冊，篩選抗生素用Amp)，步驟如下①準備選擇性培養基(含50mg/L Amp)配500ml LB培養基(胰蛋白腖tryptone 5g，酵母粉yeast extract 2. 5g, NaCl 5g，pH7. 0)，高壓滅菌，待冷至60°C左右加入氨苄 (Amp)儲存液使終濃度為50mg/ml，然後搖勻後倒平板；②將連接產物加入DH5 α感受態細胞中，輕輕混勻，立即置冰上30min ；將管置 42°C恆溫水浴中熱激60s，然後迅速置於冰上Ι-aiiin ；加入800 μ 1預熱的LB液體培養基， 37 °C預表達培養45-60min ；③將上一步培養基塗於含有50mg/L Amp的篩選培養基上，37°C過夜培養12-16小時，用PCR篩選陽性重組子；對陽性重組子用鹼裂解法提取質粒，進一步做雙酶切鑑定， 的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結果。各挑選一個陽性克隆菌，進一步搖菌，並提取質粒用於後續實驗。結果經雙酶切驗證，4XDRE序列分別連接到pHISi和pLacZi載體上，參見圖5。2、酵母單雜交試驗將含4 X DRE序列的pHISi和pLacZi分別轉化YM4271酵母，參照Clontech公司提供的用戶手冊進行酵母單雜交試驗。(1)酵母YM4271感受態細胞的製備挑單菌落接種於IOml YPD液體培養基(配方1 % Yeast Extract (酵母膏),2% Peptone (蛋白腖)，2% Dextrose (glucose)(葡萄糖)，若制固體培養基，加入2%瓊脂粉)中，30°C，250rpm培養過夜；測定過夜培養物的 0D600值為3. 0 5. 0之間；將IOml YPD過夜培養物稀釋至0D600值為0. 2 0. 4 ；在28 30°C搖床中繼續培養3 6hr，使其0D600值達到0. 6 1. 0 ；於室溫1500g離心Siiin收集酵母細胞，棄上清；用IOml洗液洗酵母細胞，隨後於室溫1500g離心5min離心收集細胞，棄上清；用Iml TE/LiAc重懸酵母細胞，以每管50 μ 1分裝。(2)重組質粒DNA對酵母ΥΜ4271的轉化將感受態細胞離心，棄去上清，然後依次加入240ul50% PEG4000、36ul lMlicl、及50ul用水溶解的質粒DNA5_10ug(上一步提取的陽性克隆質粒)，劇烈震蕩，混勻；30°C溫育30分鐘，平穩放置；42°C熱激20-25分鐘； 6000-8000rpm離心，棄去上清；用Iml滅加水輕輕重懸；(3)含pHISi_4XDRE重組質粒酵母YM4271的篩選參照Clontech公司提供的用戶手冊，將質粒pHISi-4XDRE轉化至酵母菌株YM4271的轉化產物塗布於SD/_His營養缺酶切回收4 X DRE序列載體雙酶切回收片段(pHISi或pLacZi)2XT4 DNA Ligase BufferT4 DNA Ligase_
約 50ng 約 300ng 5 μ 1 0. 5μ 1 加雙蒸水至
10 μ 1 (Total)
8陷型培養基上來篩選陽性克隆，利用3-AT競爭性實驗對YM4271(pHISi-4XDRE)進行本底表達活性檢測，預期結果為，在SD/-His培養皿上，陽性酵母生長良好。(4)含pLacZi-4XDRE重組質粒酵母YM4271的篩選參照Clontech公司提供的用戶手冊，將質粒pLacZi-4XDRE轉化至酵母菌株YM4271的轉化產物塗布於SD/_Ufa培養基，30°C培養4天，篩選陽性菌株。利用β-半乳糖苷酶顯色反應對YM4271(pLacZi-DRE4) 菌株進行本底表達活性檢測，預期結果應為，含有pLacZi-4XDRE質粒的酵母過夜後變成藍色，由此可以說明LacZ基因表達，可用於酵母單雜交系統的篩選。結果表明，參見圖6，4XDRE序列能與酵母的激活蛋白結合，啟動下遊HIS3和LacZ 基因表達，而不含4 X DRE序列的酵母不能啟動HIS3和LacZ基因表達。該酵母表達系統可用於酵母單雜交鑑定DRE綁定蛋白的功能。因此，本發明用PCR方法構建重複序列可用於同一序列快速串聯，沒有顛倒現象， 特別用於酵母表達系統順式串聯子的構建是成功的。
權利要求
1.一種用於擴增低拷貝方向相同的順式作用元件的串聯重複序列的引物對，其特徵在於所述引物對是根據目的順式作用元件的序列來設計，正向引物取目的順式作用元件序列的前20bp ；反向引物由兩部分組成，前半部分27個鹼基取目的順式作用元件序列的前 27bp的反向互補序列，後半部分23個鹼基取目的順式作用元件序列的最後23bp的反向互補序列。
2.一種基於PCR的串聯重複序列快速構建法，其特徵在於該方法是以權利要求1所述的根據目的順式作用元件設計的引物對對目的順式作用元件進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的低拷貝串聯重複序列。
3.如權利要求2所述的基於PCR的串聯重複序列快速構建法，其特徵在於以權利要求1所述的根據目的順式作用元件設計的引物對對低拷貝串聯重複序列進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的高拷貝串聯重複序列。
4.如權利要求2或3所述的基於PCR的串聯重複序列快速構建法，其特徵在於所述目的順式作用元件是DRE順式作用元件。
5.如權利要求4所述的基於PCR的串聯重複序列快速構建法，其特徵在於所述引物對為正向引物5 > CAGTTTGAAAGAAAAGGGAA TCTTTTTTTCCCTTTTCTTTCAAACTGGCTTTTTGGAACTCATGTCGGTA < 3。
6.權利要求1所述的引物對在構建酵母單雜交系統啟動子核心重複序列中的應用。
7.如權利要求2所述的基於PCR的串聯重複序列快速構建法在構建酵母單雜交系統啟動子核心重複序列中的應用。
8.如權利要求3所述的基於PCR的串聯重複序列快速構建法在高分子重複蛋白質生產中的應用。
全文摘要
一種基於PCR的串聯重複序列快速構建法和專用引物對及應用，該方法是以根據目的順式作用元件設計的引物對對目的順式作用元件進行PCR擴增，得到方向相同的目的順式作用元件的低拷貝串聯重複序列，該方法僅用一個PCR快速構建3個以上同向串聯子，陽性克隆率達到18％，用兩個PCR和一個亞克隆，可以獲得200個同向串聯子。低拷貝串聯子在酵母雜交中用於重複順式元件的構建快速有效，而獲得的高拷貝串聯在高分子重複蛋白質的生產具有極廣泛的用途。
文檔編號C12N15/113GK102154269SQ20111000164
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月6日 優先權日2011年1月6日
發明者熊興耀, 鄧子牛, 陳己任 申請人:湖南農業大學