一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法
2023-09-15 23:08:35
一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法
【專利摘要】本發明涉及一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法，包括構建基因表達工程菌、培養工程菌、製備細菌裂解物、親和層析、濃縮和酶切六個步驟。本發明採用基因定點突變、多種表達載體和表達系統進行篩選，獲得最佳結果。利用基因重組技術，改造蚯蚓纖溶酶使其與NusA助溶蛋白標籤實現重組表達，極大提高了目的蛋白在大腸桿菌中的可溶表達，通過一步親和層析，獲得高產率的純酶。這種蚯蚓纖溶酶融合蛋白有著穩定的生物學活性，如溶解纖維蛋白，激活某些細胞表面蛋白酶激活受體-2，可在-20℃保存至少3年，去除NusA助溶蛋白標籤後，能進一步提高其纖溶酶活性。CGMCC No916220140514
【專利說明】一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及醫藥【技術領域】，具體涉及一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法。
【背景技術】
[0002]血栓類疾病，尤其是心、腦血管血栓性疾病，是引起死亡的主要因素，嚴重危害人類生命健康和生活質量，而且發病率增長迅速，發病人群有年輕化傾向，使得溶栓研究獲得醫、藥、學、研各界的重點關注。而蚯蚓纖溶酶作為一種溶栓藥物，安全性比較高。
[0003]目前市場上出售的以蚯蚓提取物為主要成分的「溶栓膠囊」已用於臨床多年，是預防和治療血栓疾病、降低血液粘稠度的良好藥物。可是，由於環境因素使養殖的蚯蚓存在著重金屬汙染，影響作為藥材使用；傳統的分離純化技術，在大規模工廠化生產時，產品含有多種雜蛋白和重金屬超標。此外，大部分蚯蚓纖溶酶(EFE)在大腸桿菌中常以包涵體表達，可溶性產物蛋白所佔比例極低，限制了大規模製備活性酶。蚯蚓纖溶酶在何種表達系統中能夠進行最佳表達一直是一個難題。
【發明內容】
[0004]針對上述現有技術中的不足，本發明的目的在於為方便大規模獲得高純度蚯蚓纖溶酶，通過基因重組技術對現有的蚯蚓纖溶酶加以改造，使其保留生物學活性的同時，能夠大規模生產，而且使得來源單一化，消除重金屬汙染，提高長期保存的穩定性。
[0005]為了實現上述發明目的，本申請提供了以下技術方案:
[0006]一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法，步驟如下:
[0007]步驟一構建表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的大腸桿菌工程菌
[0008]在基因資料庫檢索到蚯蚓纖溶酶基因序列，通過反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)從赤子愛勝蚓獲得一個完整的基因(efe)，進行測序，確認由741個核苷酸組成，編碼246胺基酸殘基，通過聚合酶鏈反應給該基因5'端和3'端各添加一個酶切位點，對5個鹼基進行定點突變，聚合酶鏈反應產物進行測序確認後，插入載體的相應位點，得到原核表達載體並測序確認，轉化至大腸桿菌中，得到表達工程菌；
[0009]步驟二表達工程菌培養
[0010]製備2?1L氨苄青黴素普通(LB)培養基，接種工程菌，37°C培養至菌液在600nm處吸光值為0.6?1.0，加入終濃度為0.5?ImM的異丙基-β -D-硫代半乳糖苷(IPTG)，18?21°C誘導8?12小時；
[0011]步驟三製備細菌裂解物
[0012]在4°C操作。菌液13000轉/分鐘的速度離心10分鐘，收穫沉澱，重新溶解在Tris-HCl pH = 7.2?7.6緩衝液中，超聲裂解細胞，13000轉/分鐘的速度離心30分鐘，收穫上清，備用；
[0013]步驟四親和層析
[0014]在41操作。上清過鎳離子螯合親和層析柱，用邱=7.4緩衝液洗脫至28011111處吸光值不再下降時，用2個柱體積邱=7.2?7.6緩衝液含50禮咪唑洗脫，再用2個柱體積！^18-此1邱=7.2?7.6緩衝液含100禮咪唑洗脫，接著用2個柱體積邱=7.2?7.6緩衝液含150禮咪唑洗脫，最後用2個柱體積邱=7.2?7.6緩衝液含20011)1咪唑洗脫，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(303-^八⑶)檢測洗脫產物，選擇純度好的合併，對= 7.2?7.6緩衝液透析；
[0015]步驟五濃縮
[0016]在41操作。超濾至蛋白濃度為1?3呢[左右，在-201保存，作為蚯蚓纖溶酶融合蛋白廣品；
[0017]步驟六酶切
[0018]蚯蚓纖溶酶融合蛋白經腸激酶切割，超濾純化或鎳離子螯合親和層析柱純化，去掉融合蛋白，獲得重組蚯蚓纖溶酶產品，濃縮至11118/1^左右，在-20 V保存。
[0019]有益效果
[0020]本發明通過基因定點突變，採用多種表達載體和表達系統進行篩選，獲得最佳結果。利用基因重組技術，改造蚯蚓纖溶酶使其與如「助溶蛋白標籤重組表達，極大提高了產物蛋白在大腸桿菌中表達的可溶程度，通過一步親和層析，獲得高產率的純酶。這種蚯蚓纖溶酶融合蛋白活性穩定，在-201保存3年後活性無明顯變化，它不僅可以溶解纖維蛋白，還可以激活某些細胞表面蛋白酶激活受體2八以)。去除如「助溶蛋白標籤後，纖溶酶活性明顯增高。
[0021〕 本發明克服現有生產技術中，產量低，長期保存難等缺點，市場前景大。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1是重組表達載體(質粒)酶切鑑定示意圖；其中，1:分子量標準:對照載體(質粒)；？十隻:載體響八I與11111(1111雙酶切；？:載體單酶切；！！:載體11111(1111單酶切；
[0023]圖2是從赤子愛勝蚓中獲得的纖溶酶基因示意圖；其中，八％開頭的序列為鹼基序列，1開頭的序列為其編碼蛋白的胺基酸序列，該基因經0嫩測序證實，由741核苷酸組成，編碼246個胺基酸殘基；
[0024]圖3是重組表達載體(質粒)結構不意圖，基因6？6與018標籤和他18八助溶蛋白標籤的關係，腸激酶切割位點；
[0025]圖4是親和層析分離示意圖，在大腸桿菌中表達的可溶性蚯蚓纖溶酶融合蛋白，及其親和層析洗脫的條件；其中，1:蛋白質分子量標準；阿拉伯數字:樣品來自相應收集管的編號；
[0026]圖5是親和層析洗脫物的纖維蛋白溶解活性示意圖，用纖維蛋白平板法測定；
[0027]圖6是目的蛋白一步純化後的純度示意圖，八⑶檢測一步純化後可溶性蚯蚓纖溶酶融合蛋白的純度；其中，1:蛋白質分子量標準；？:濃縮後的蚯蚓纖溶酶融合蛋白；
[0028]圖7是重組蚯蚓纖溶酶從融合蛋白中釋放示意圖，蚯蚓纖溶酶融合蛋白經腸激酶處理可釋放出重組蚯蚓纖溶酶出而)；其中，1:蛋白質分子量標準；？:濃縮後的蚯蚓纖溶酶融合蛋白；0:腸激酶切割後釋放重組蚯蚓纖溶酶；
[0029]圖8和9是活性比較示意圖；其中，蚯蚓纖溶酶融合蛋白(1.8mg/mL)與重組蚯蚓纖溶酶(0.3mg/mL)活性比較。每個樣點為5 μ L酶液，孵育溫度為37°C。
[0030]工程菌株pET43.la-EFE_BL21，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC N0.9162.保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期:2014年05月14日；分類命名:大腸埃希氏菌Escherichia coli。
【具體實施方式】
[0031]一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法，步驟如下:
[0032]步驟一構建表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的大腸桿菌工程菌
[0033]在國家生物技術信息中心(NCBI)查詢到蚯蚓纖溶酶基因序列(GenBank:U25643.1)，通過RT-PCR從赤子愛勝蚓(Eisenia fedina)獲得一個完整的基因(efe)，連接於pMD-18載體進行測序，確認由741個核苷酸組成，編碼246胺基酸殘基，然後通過PCR給efe基因5'端添加pshA酶切位點，3'端添加HindIII酶切位點，某些鹼基進行定點突變，PCR產物連接於pMD-18載體進行測序確認後，帶有pshA/Hindlll酶切位點的efe基因插入pET43.1a載體的相應位點，得到重組原核表達載體「pET43.la_EFE」並測序確認，然後轉化至大腸桿菌BL21中，得到蚯蚓纖溶酶基因表達工程菌「pET43.la-EFE_BL21」 ；
[0034]步驟二表達工程菌的擴大培養
[0035]取保存於_80°C原始表達菌,劃線接種於LB(Luria-Bertani)固體培養基平板，內含終濃度100μ g/mL的氨苄青黴素，37°C復甦靜止生長過夜。隔日，用滅菌牙籤接種於2mL含有終濃度100 μ g/mL的氨苄青黴素的液體LB培養基，37°C、每分鐘220轉，恆溫震蕩培養過夜。
[0036]120°C高壓滅菌製備2?1L的液體LB培養基，待溫度降低至室溫時，添加氨苄青黴素至終濃度100 μ g/mL,接種2mL工程菌，37°C培養至菌液在600nm處吸光值為0.6?1.0左右，加入終濃度為0.5?ImM的IPTG，降溫至18?21°C誘導8?12小時；
[0037]步驟三製備細菌裂解物
[0038]菌液13000轉/分鐘的速度離心10分鐘，收穫沉澱。沉澱重新懸浮在20?30mL4°C裂解緩衝液中(包含 50mM Tris-HClU % TitronX-100、500mM NaCl,pH = 7.4)，200W 超聲裂解細胞(每次超聲2秒間隔3秒，共需300次)，13000轉/分鐘的速度、4°C離心30分鐘，收穫上清，備用；
[0039]步驟四親和層析
[0040]上清過鎳離子螯合親和層析柱(凝膠體積5?1mL),用緩衝液(含50mMTris-HCl、500mM NaCl, pH = 7.4)洗脫至280nm處吸光值不再下降後，用2個柱體積含50mM咪唑的緩衝液洗脫，再用2個柱體積含10mM咪唑的緩衝液洗脫，接著用2個柱體積含150mM咪唑的緩衝液洗脫，最後用2個柱體積含200mM咪唑的緩衝液洗脫，SDS-PAGE檢測洗脫產物(洗脫物SDS-PAGE圖譜如圖4所示)，選擇純度高的蛋白，檢測其纖溶活性(圖譜如圖5所示)並合併，對50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH = 7.4緩衝液透析。
[0041]步驟五濃縮
[0042]選用截留分子量小於30kDa超濾管(MILLIP0RE公司產品)，在4°C，5000轉/分鐘的速度離心，濃縮蛋白濃度至lmg/mL以上，SDS-PAGE檢測純度(SDS-PAGE圖譜如圖6所示)，-201保存，作為蚯蚓纖溶酶融合蛋白產品。
[0043]步驟六酶切
[0044]為去除融合蛋白中的如「助溶蛋白標籤，將腸激酶(肥8公司產品)與融合蛋白按1: 100000比例(質量濃度比)混合，於251孵育16小時，以使重組蚯蚓纖溶酶與如8八助溶蛋白標籤分離(303-9八⑶圖譜如圖7)。這時加入胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖1-0637)在41震蕩1小時後，10000轉/分鐘的速度離心10分鐘，收集上清，去除腸激酶與之結合的胰蛋白酶抑制劑瓊脂糖珠。使用分子截留量為30奶3的超濾管公司產品)分離上清中的重組蚯蚓纖溶酶(即幻與如「助溶蛋白標籤，具體過程:在41，將上清加入截留量為30^)21的超濾管，5000轉/分鐘的速度離心，收集到的穿透液含有游離的重組蚯蚓纖溶酶(￡1?)。使用纖維蛋白平板法檢測活性(圖譜如圖8、9〉。
[0045]實施例1中，工程菌株邱143.1^即卜8121，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為⑶此。唚.9162。保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所；保藏日期:2014年05月14日；分類命名:大腸埃希氏
1? 5！801161~101118 0011。
[0046]最後應說明的是:顯然，上述實施例僅是為清楚地說明本申請所作的舉例，而並非對實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式一一枚舉。然而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處於本申請型的保護範圍之中。
【權利要求】
1.一種用大腸桿菌表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的方法，其特徵在於改造大腸桿菌表達工程菌，增加蚯蚓纖溶酶在大腸桿菌中大量表達的可溶程度，提高纖溶酶儲存穩定性，步驟如下: 步驟一構建表達高可溶性蚯蚓纖溶酶的大腸桿菌工程菌 在基因資料庫檢索到蚯蚓纖溶酶基因序列，通過反轉錄聚合酶鏈反應從赤子愛勝蚓獲得一個完整的基因，進行測序，確認由741個核苷酸組成，編碼246胺基酸殘基，通過聚合酶鏈反應給該基因5,端和3,端各添加一個酶切位點，對5個鹼基進行定點突變，聚合酶鏈反應產物進行測序確認後，插入載體的相應位點，得到原核表達載體並測序確認，轉化至大腸桿菌中，得到表達工程菌； 步驟二表達工程菌培養 製備2?101氨苄青黴素普通培養基，接種工程菌，371培養至菌液在600=111處吸光值為0.6?1.0，加入終濃度為0.5?1禮的異丙基-3 -0-硫代半乳糖苷，18?211誘導8?12小時； 步驟三製備細菌裂解物 菌液以13000轉丨分鐘的速度，離心10分鐘，收穫沉澱，重新溶解在41 11-18-1101=7.2?7.6緩衝液中，超聲裂解細胞，再以13000轉/分鐘的速度，離心30分鐘，收穫上清，備用； 步驟四親和層析 上清過鎳離子螯合親和層析柱，用邱=7.2?7.6緩衝液洗脫至280=111處吸光值不再下降後，用2個柱體積！^18-此1邱=7.2?7.6緩衝液含50禮咪唑洗脫，再用2個柱體積邱=7.2?7.6緩衝液含100禮咪唑洗脫，接著用2個柱體積邱=7.2?7.6緩衝液含150禮咪唑洗脫，最後用2個柱體積邱=7.2?7.6緩衝液含200！111咪唑洗脫，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳檢測洗脫產物，選擇純度好的合併，對邱=7.2?7.6緩衝液透析； 步驟五濃縮 超濾至蛋白濃度為1?31^?1左右，-201保存，作為蚯蚓纖溶酶融合蛋白產品； 步驟六酶切 蚯蚓纖溶酶融合蛋白經腸激酶切割，超濾或鎳離子螯合親和層析柱純化，去掉融合蛋白，獲得重組蚯蚓纖溶酶產品，濃縮至11118/1^左右，在-201保存。
【文檔編號】C12N9/68GK104388413SQ201410275553
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月31日 優先權日:2014年10月31日
【發明者】王沛, 鍾良瑋 申請人:中國科學院大學, 山西中遠威藥業有限公司