一種檢測磷脂依賴性凝血因子x激活物酶活性的方法

2023-09-16 07:44:15 1

專利名稱：一種檢測磷脂依賴性凝血因子x激活物酶活性的方法
技術領域：
本發明涉及藥品、生物製品領域，具體涉及一種生色底物法測定磷脂依賴性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。
背景技術：
蛇毒血凝酶是從蝰蛇毒中提取並利用現代生物技術分離純化精製而成。它是一種以止血作用為主的酶製劑，含有兩種可促進血液凝固的成分，分別為蝰蛇巴曲酶(Batroxobin)和磷脂依賴性凝血因子X激活物(簡稱FXA)。其中FXA是一種高度特異性的、具有蛋白水解酶特性的酶類，在響尾蛇和蝰蛇的蛇毒中分布廣泛。絕大多數蛇毒FXA是從圓斑蝰蛇和Macrovipera Iebetina中純化得到的，分別稱作為RVV-X和VLFXA，其中RVV-X 的活力最強。這兩種FXA均由一條重鏈a及兩條由二硫鍵相連的C型凝集素結構的輕鏈&、Y組成，a重鏈和Y輕鏈的初級結構在兩者中相似，重鏈均含有金屬酶、去整合素和半胱氨酸富集結構域。1994年Gowda等人用質譜測定得到RVV-X的分子量為92，880Da, SDS-PAGE顯示重鏈為57，600Da，輕鏈分別為19，400和16，400Da，等電點pi為4. 2 7. 8。其在中性條件下(pH = 6. 5-8. 0)穩定，在酸性(PH = 3 6)和鹼性(PH = 9 11)條件下活性迅速下降。RVV-X的含糖量為10%，脫糖基化可顯著地影響其活力，催化速率下降約130倍。早在1934年，Macfarlane和Barnett就發現FXA能夠加速血液凝固，並需要Ca2+參與才能夠達到最大活力，而且受金屬螯合劑的抑制。1962年，Wi 11 iams和Esnouf用DEAE纖維素柱分離純化得到了促凝血物。FXA是一種能夠作用於凝血因子X和凝血因子IX的金屬酶，能夠切斷濃集於磷脂反應表面的凝血因子X重鏈上的Arg51-Ile52肽鍵，將其激活成為Xa。後者可參與外源性凝血和內源性凝血過程，與Ca2+、凝血因子Va及血小板磷脂(PF3)形成複合物(凝血酶原激活物)，將凝血酶原轉變為凝血酶，纖維蛋白原又被凝血酶酶解為纖維蛋白單體，其可促使凝血酶對因子XIII的激活，在XIII與鈣離子的參與下，相鄰的纖維蛋白發生快速共價交聯，形成不溶的穩定的纖維蛋白凝塊。因此，FXA最終可促使血管破損處的凝血酶形成,促進出血部位血小板聚集。此外，凝血因子X的活化與腫瘤細胞的遷移有關。腫瘤細胞中含有一種蛋白可以直接把凝血因子X活化為Xa，這種行為會導致凝血纖維蛋白附著在腫瘤細胞表面上，使得腫瘤細胞在體內容易擴散。腫瘤細胞中的這類蛋白極難獲得，FXA可以模擬這種蛋白活化凝血因子X，這對腫瘤遷移機理有一定的意義。目前，主要採用底物法測定FXA的活性，根據作用底物的不同可將測定方法分為兩大類第一大類為天然底物法，即以人血漿為底物，通過判斷FXA的加入導致其發生凝固的時間來進行FXA活性測定，該法在20世紀80年代初得到普遍應用，方法常規，但需目測判斷纖維蛋白原凝固時間，受檢測者主觀幹擾較大；另一大類為通過FXA水解生色底物產生有特徵吸收的生色產物來進行活性測定。但目前多採用兩步法測定，即在FXA作用於凝血因子X —段時間後加入終止劑，同時加入生色底物,根據特定時間內Xa的生成量計算FXA的活性。此方法不能排除在活化的早期階段時間和Xa生成量之間可能存在非線性關係，因而不能精確地反映酶的活性作用特點。鑑於上述方法的局限性，尋找一種高效、經濟的活性測定方法成為磷脂依賴性凝血因子X激活物應用研究的關鍵之一。

發明內容
本發明的目的在於提供一種簡單、可靠、準確地檢測磷脂依賴性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法。本發明中的FXA能夠將Human Factor X轉換成有水解酶活性的Xa因子(FactorXa)，Xa因子可切開其生色底物S-2765 (Suc-Ile-Gly (Y-Pip) Gly-Arg-PNA)中的肽鍵，釋放出在405nm波長處有特定吸光值的黃色產物對硝基苯胺(PNA)，通過檢測405nm處PNA的吸光度，即可對FXA的酶活性進行測定，在這一波長下，其它物質對光的吸收小於PNA對光吸收的I %。隨著酶活性梯度變化，吸光度也呈現梯度變化，在一定時間內，反應產物吸光度 與酶活線性相關。據此可繪製FXA標準曲線並計算待測樣品的酶活性。該方法包括以下步驟(I)配製 pH = 7. 4，濃度為 0. 02M 的 Tris-HCl 緩衝液； (2)配製濃度為0. 075M的CaCl2溶液；(3)用IOml⑴步製備的緩衝液將IOmg人血清白蛋白配製成濃度為lmg/ml血清白蛋白稀釋液；(4) FXA生色底物S-2765與(I)步製備的緩衝液和(2)步製備的CaCl2溶液混合，配製成溶液A ;(5)用(I)步製備的緩衝液將Human Factor X稀釋成溶液B ；(6)用(I)步製備的緩衝液和(3)步製備的血清白蛋白稀釋液將已知濃度的FXA單體標準品稀釋成一系列不同濃度的母液Cn(n ^ I)；(7)用(I)步製備的緩衝液和(3)步製備的血清白蛋白稀釋液將待測樣品稀釋成溶液Dn(n彡I)；(8)將相同體積的一系列不同濃度標準品母液C1X2X3......Cn(n^l)與待測樣
品溶液Dn分別加到酶標板不同孔中，再向每孔中補充相同體積的溶液A和相同體積的溶液B，保持每孔溶液的總體積一致，把孔內溶液混勻，立即放入預熱至37°C的酶標儀中反應，分別測定每孔中酶解產物對硝基苯胺(PM)的吸光度A405，並根據測定得到的不同濃度標準品母液吸光度A405值，繪製FXA單體標準品的濃度-吸光度線性標準曲線；(9)將測定得到的待測樣品吸光度A405值，代入⑶步得到的PNA標準曲線，計算待測樣品的酶濃度和活性。其中，優選地，上述(5)步中Human Factor X溶液稀釋後的濃度為2. 5 ii M。優選地，上述⑷步中FXA生色底物S-2765溶液的製備過程為用⑴步製備的緩衝液將FXA生色底物S-2765配製成3mM的濃度後，精密量取0. 8ml已製備3mM S-2765溶液並加入0. 6ml (2)步製備的CaCl2溶液，混勻。優選地，上述(6)步中稀釋後FXA單體標準品母液的濃度分別為1.4、1.2、1.0、0. 8、0. 6、0. 4、0. 2Ku/ml。
優選地，上述⑶步中酶標板每孔加入(6)步製備的不同濃度FXA單體標準品母液或(7)步製備的待測樣品溶液體積均為7 iil，(4)步製備的生色底物S-2765溶液體積為23 ill和(5)步製備的Human Factor X溶液體積為30 U 1，每孔溶液總體積為60 yl。優選地，上述(8)步中酶標儀預熱時間為不少於15分鐘，反應時間為15分鐘後測定405nm波長處每孔酶解產物對硝基苯胺(PNA)的吸收值A405。本發明中FXA生色底物S-2765中需加入合適濃度的鈣離子，一方面作為整個反應的激活劑，另一方面可以稀釋底物。本發明中需加入過量生色底物S-2765，因酶量一定時，酶反應隨著底物濃度不斷增加到一定程度將表現為0級反應，即酶反應速率不再受底物濃度的影響。因此，在底物遠遠過量的情況下，酶反應速率對酶濃度呈線性關係。優選地，上述酶標板中每孔溶液總反應體積為60 ill時，加入FXA單體標準品母液活性單位< 2Ku/孔，生色底物S-2765溶液濃度^ 0. 039mM。 本發明反應需預熱至少15分鐘，然後再37 V反應15分鐘的原因未預熱時反應體系裡的底物分子和酶分子不能完全接觸，易造成局部反應，預熱可以加速分子混勻，保證整個體系都能在37°C以最大反應速度反應，容易得到線性反應曲線。與現有測定方法相比，本發明中整個反應過程在96孔板中進行，體系體積小，效率高，酶標儀的使用也大大減少了吸光度的讀數時間。因此，本方法過程簡單，便於控制，易於操作，重複性很好。本發明中，酶與底物生色反應無終止劑，為取得較好的實驗結果，整個操作過程需緊湊，以免人為造成標準曲線有較大誤差。


圖I是本發明實施例I中的FXA標準曲線；圖2是本發明實施例2中的FXA標準曲線； 圖3是本發明實施例3中的FXA標準曲線。
具體實施例方式本發明技術方案不局限於以下所列舉的具體實施方式
。I.儀器與試藥FXA 生色底物 S-2765 (Suc-Ile-Gly ( Y-Pip) Gly-Arg-pNA)(購於 Bedford 公司),Human Factor X(購於Thermo公司規格100 ii g/支)，人血清白蛋白(購於通路生物製藥有限公司規格10ml 2g) ,0. 02M Tris-HCl 緩衝液(pH 7. 4)0. 075M CaCl2 溶液，FXA 單體標準品(標定濃度為2Ku/ml)，待測樣品。酶標儀(型號Biorad 680)。2.實驗方法(I)實施例 I①用0. 02M Tris-HCl緩衝液(pH 7. 4)將FXA生色底物S-2765配製成濃度為3mM的溶液；精密量取0. 8ml製備好的3mM S-2765溶液並加入0. 6ml 0. 075M CaCl2溶液，混勻待用；
②取Human Factor X 一支(100 U g)，用 0. 02M Tris-HCl 緩衝液(pH 7. 4)稀釋成濃度為2. 5 ii M的溶液，混勻待用；③取IOmg人血清白蛋白加入到IOml 0. 02M Tris-HCl緩衝液(pH 7. 4)中，配製成濃度為lmg/ml的血清白蛋白稀釋液；④用已製備好的lmg/ml血清白蛋白稀釋液和0. 02M Tris-HCl緩衝液(pH 7. 4)將FXA單體標準品稀釋成7個不同濃度的標準品母液，其濃度分別為1. 4、I. 2、I. 0,0. 8,0. 6、0.4、0. 2Ku/ml ；⑤隨機選取兆科藥業(合肥)有限公司生產留樣的、批號為20100628的蛇毒血凝酶注射液製劑作為待測樣品(標示為lKu/ml)，用0. 02M Tris-HCl緩衝液和lmg/ml血清白蛋白稀釋液稀釋該待測樣品，該批樣品稀釋後濃度為0. 4Ku/ml ；⑥在酶標板中，每孔加入①中製備的生色底物S-2765溶液23 ii L，②中製備的 Human Factor X溶液30 yl、④中製備的不同濃度的FXA單體標準品溶液7 或⑤中製備的待測樣品7iU，立即混勻。其中，每個濃度標準品母液各3個復孔，待測樣品2個復孔。把酶標板放入預熱至少4分鐘至37°C的酶標儀中，反應15分鐘後分別測定405nm波長處每孔對硝基苯胺(PNA)的吸光度A405。以FXA單體濃度(Ku/ml)為橫坐標，相應的PNA的吸光度A405為縱坐標，測定不同濃度FXA單體標準品母液相對應PNA吸光度，繪製PNA標準曲線(試驗結果獲得的標準曲線方程為y = 0. 212x+0. IllLR2 = 0. 9979)。測定待測樣品的A405值為0. 205，將該值代入標準曲線計算得到的該待測樣品實際效價為I. 0242Ku/ml,不同濃度標準品母液相對應PNA吸光度值見表I。
表I實施例I不同濃度標準品母液相對應PNA吸光度值
權利要求
1.ー種檢測磷脂依賴性凝血因子X激活物(FXA)酶活性的方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟 (1)配製pH= 7. 4，濃度為0. 02M的Tris-HCl緩衝液； (2)配製濃度為0.075M的CaCl2溶液； (3)用IOml⑴步製備的緩衝液將IOmg人血清白蛋白配製成濃度為lmg/ml血清白蛋白稀釋液； (4奸乂ム生色底物5-2765與(I)步製備的緩衝液和(2)步製備的CaCl2溶液混合，配製成溶液A ； (5)用(I)步製備的緩衝液將HumanFactor X稀釋成溶液B ; (6)用(I)步製備的緩衝液和(3)步製備的血清白蛋白稀釋液將已知濃度的FXA単體標準品稀釋成一系列不同濃度的母液Cn(n ^ I)； (7)用(I)步製備的緩衝液和(3)步製備的血清白蛋白稀釋液將待測樣品稀釋成溶液Dn(n ^ I)； (8)將相同體積的一系列不同濃度標準品母液C1.C2、C3......Cn(n ^ I)與待測樣品溶液Dn分別加到酶標板不同孔中，再向每孔中補充相同體積的溶液A和相同體積的溶液B，保持每孔溶液的總體積一致，把孔內溶液混勻，立即放入預熱至37°C的酶標儀中反應，分別測定每孔中酶解產物對硝基苯胺(PNA)的吸光度A405，井根據測定得到的不同濃度標準品母液吸光度A405值，繪製FXA單體標準品的濃度-吸光度線性標準曲線； (9)將測定得到的待測樣品Dn的吸光度A405值，代入(8)步得到的PNA標準曲線，確定待測樣品的酶濃度和活性。
2.根據權利要求I所述的檢測方法，其特徵在幹，(5)步中溶液B的濃度為2.5 PM。
3.根據權利要求I所述的檢測方法，其特徵在幹，(4)步中溶液A的製備過程為用(I)步製備的緩衝液將FXA生色底物S-2765配製成3mM的濃度後，精密量取0. 8ml已製備3mMS-2765溶液並加入0. 6ml (2)步製備的CaCl2溶液，混勻。
4.根據權利要求I所述的檢測方法，其特徵在幹，(6)步中母液C的濃度分別為1.4、I.2> I. 0、0. 8、0. 6、0. 4、0. 2Ku/ml。
5.根據權利要求I所述的檢測方法，其特徵在幹，(8)步中酶標板每孔加入標準品母液C和待測樣品溶液D體積均為7 ill，溶液A體積為23 ill、溶液B體積為30 ill，每孔溶液總體積為60 u I0
6.根據權利要求I所述的檢測方法，其特徵在於，所述酶標板中每孔溶液總反應體積為60 ill時，加入FXA單體標準品母液C活性單位く 2Ku/孔，溶液A濃度彡0. 039mM。
7.根據權利要求I所述的檢測方法，其特徵在於，所述(8)步中酶標儀預熱時間為4分鐘，反應時間為15分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種快速、特異性地測定磷脂依賴性凝血因子X激活物酶活性的方法，採用生色底物法，使用酶標儀，在一定反應時間和一定活力的標準品範圍內獲得線性反應曲線，建立產物吸光值和磷脂依賴性凝血因子X激活物濃度的線性關係，據此計算樣品的相應酶活。此外，還對該標準曲線的回收率和精密度做了仔細研究，該方法準確度高，步驟簡單，方便實驗室操作，適用於X激活物原料及蛇毒血凝酶製劑的質量控制。
文檔編號G01N21/31GK102798598SQ201110136028
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月25日 優先權日2011年5月25日
發明者戴向榮, 劉娟娟, 方麗, 楊中強, 李小羿, 張國輝 申請人:兆科藥業(合肥)有限公司