苦參素抑制C型肝炎病毒感染靶細胞的應用的製作方法
2023-09-16 17:18:15 1
苦參素抑制C型肝炎病毒感染靶細胞的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了苦參素抑制C型肝炎病毒感染靶細胞的應用，通過MTT、RT-PCR及免疫螢光等驗證苦參素體外抗病毒功效，結果表明苦參素能夠抑制C型肝炎病毒的複製，可用於抗C型肝炎病毒製劑的製備，表明了苦參素抗C肝作用可用於臨床中部分C肝患者。
【專利說明】苦參素抑制C型肝炎病毒感染靶細胞的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於C型肝炎病毒防治【技術領域】，涉及苦參素抑制C型肝炎病毒感染靶細胞的應用。
【背景技術】
[0002]C型肝炎是肝脂肪變、慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌發生的主要原因之一，據統計全球約有1.7億C肝患者。我國C型肝炎患病率高，但目前臨床治療方法有限，國際標準化療法為幹擾素+利巴韋林，僅對50%的I型患者有效，臨床中仍有部分患者因不耐受幹擾素副作用而無法進行治療，因此急需其它替代療法。
[0003]由於C型肝炎病毒HCV體外培養系統不完善，目前動物培養系統僅限於黑猩猩；細胞培養系統尚不成熟，加之HCV在被感染者組織和血清中濃度較低，病毒變異高，尤其是E2氨基末端由27個胺基酸殘基組成的高變區Khypervirable region 1，HVR1)，含有重要的中和性抗原表位，能誘導宿主產生中和性抗體，導致對HCV培養系統研究仍不成熟。
[0004]苦參素(OM)是從中藥苦豆子和苦參根中提取的有效成分，是苦參的主要藥效成分，其處方適應症為慢性乙型病毒性肝炎，能有效降低B肝病毒DNA水平，並能改善肝纖維化的多種血清指標，同時能調節免疫，誘生內源性幹擾素。
【發明內容】
[0005]本發明解決的問題在於提供苦參素抑制C型肝炎病毒感染靶細胞的應用，提供新的抗C型肝炎病毒的藥物。
[0006]本發明是通過以下技術方案來實現:
[0007]苦參素在製備防治C型肝炎病毒感染靶細胞的藥物中的應用。
[0008]所述的藥物為抑制C型肝炎病毒複製的藥物。
[0009]所述的藥物為防治2a型C型肝炎病毒感染靶細胞的藥物。
[0010]苦參素在製備抑制C型肝炎病毒RNA複製的藥物中的應用。
[0011]所述的藥物為抑制2a型C型肝炎病毒RNA複製的藥物。
[0012]所述的藥物中苦參素的含量不低於4mg/ml。
[0013]與現有技術相比，本發明具有以下有益的技術效果:
[0014]本發明提供了苦參素抑制C型肝炎病毒感染靶細胞的應用，在構建HCVcc系統的基礎上，通過MTT、RT-PCR及免疫螢光等驗證苦參素體外抗病毒功效，結果表明苦參素能夠抑制C型肝炎病毒的複製，可用於抗C型肝炎病毒製劑的製備，表明了苦參素抗C肝作用可用於臨床中部分C肝患者。
[0015]臨床中C肝國際化療法為幹擾素聯合利巴韋林抗病毒治療，但僅對50%1型感染者有效，合併自身免疫性疾病或甲狀腺疾病、精神異常等患者更無法使用該療法，導致其進展為肝硬化危險性比 普通慢性C肝患者顯著升高，苦參素可用於肝硬化失代償期患者，且其具有升高白細胞等優勢，本發明提供苦參素的抗C肝病毒及其製藥的應用，因此可用於C肝抗病毒治療。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為HCVcc電穿孔7此後轉染效率(IOX):細胞核被染成藍色。A:H77/pEGFP-HCV 轉染 Huh7.5.1 細胞；B: J6/pEGFP_HCV 轉染 Huh7.5.1 細胞；C: SGR/pEGFP-HCV 轉染Huh7.5.1細胞；D:陰性對照:未轉染任何載體；
[0017]圖2苦參素作用及Huh7.5.1細胞活性的MTT檢測結果:J6cc感染細胞後不同濃度苦參素處理靶細胞，每一數據均採用均數土標準差表示,P>0.05和# P〈0.05分別與對照組相比).Blank:未處理，con:僅用J6。。處理；[0018]圖3為8mg/ml苦參素處理J6。。感染Huh7.5.1細胞的mRNA檢測結果；J6: J6+苦參素處理細胞，Con:J6處理細胞.^P〈0.05分別與對照組相比)；
[0019]圖4 為 HCVcc 感染 Huh7.5.1 細胞，其中 A:H77cc 感染 Huh7.5.1 細胞；B:J6cc 感染Huh7.5.1細胞；C =SGRcc感染Huh7.5.1細胞；D:陰性對照=HCV未感染細胞。
[0020]圖5為J6ccl0倍濃度梯度稀釋Huh7.5.1細胞，HCVcc滴度分別從IO1至106/mL:A:1OOul !10^。處理!111117.5.1細胞；8:11111 HCVcc+99ul DMEM處理Huh7.5.I 細胞；C:1Oul前混合物+IOOul DMEM處理Huh7.5.1細胞;D_E:同前。
[0021]圖6不同濃度苦參素處理J6cc感染Huh7.5.1細胞的螢光檢測結果，A:苦參素2mg/ml處理J6cc感染Huh7.5.1細胞；B:苦參素4mg/ml處理J6cc感染Huh7.5.1細胞；C:苦參素8mg/ml處理J6cc感染Huh7.5.1細胞；D:苦參素12mg/ml處理J6cc感染Huh7.5.1細胞；E:苦參素16mg/ml處理J6cc感染Huh7.5.1細胞；F:陰性對照(僅有HCVcc,未加苦參素)；G:空白對照(未加HCVcc及苦參素)。
【具體實施方式】
[0022]下面結合具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0023]本發明通過在構建HCVcc系統的基礎上，通過MTT、RT_PCR及免疫螢光等驗證苦參素體外抗病毒功效，結果表明苦參素可應用於抗HCV病毒的藥物的製備。
[0024]所述包括以下操作:
[0025](I).通過大腸桿菌轉化不同質粒，大量擴增所需質粒；
[0026](2).電穿孔轉染所需三種基因型11(^(加、!177、5610，驗證其轉染效率及對靶細胞的感染性；
[0027](3).利用MTT法檢測苦參素對感染HCV的細胞增殖抑制率:連續培養3天，選取苦參素IC50藥物濃度；
[0028](4).實時定量PCR驗證HCV感染後靶細胞中mRNA表達水平及苦參素對其抑制作用；
[0029](5).免疫螢光觀察不同濃度苦參素處理後，Huh7.5.1細胞螢光表達情況。
[0030]進行HCVcc系統構建:
[0031]I)質粒線性化:XbaI 單酶切線性化質粒 pFL-J6/JFH-l、pFL-H77/JFH-l、pFL-SGR/JFH-1 (三種質粒均由美國Rockfeller大學C型肝炎研究室Charles Rice教授惠贈),酶切完成後，1/20體積0.5M EDTA+1/10體積3M NaAC (醋酸鈉)+2倍體積無水乙醇等體積輕晃，DNA析出沉澱，15ul DEPC水重懸，測線性化質粒濃度。
[0032]其中，pFL-J6/JFH(屬於 HCV2a 型)是 Lindenbaeh 等用 JFHl 的 NS3-NS5B 及 5』 和3』非編碼區(NTRs)分別與J6的C-NS2編碼而成；
[0033]pFL-H77/JFH 株(屬於 HCVla/2a 型)是 Lindenbaeh 等用 JFHl 的 NS3-NS5B 及 5』和3』非編碼區(NTRs)分別與H77的C-NS2編碼而成；
[0034]SGR-JFHl (屬於 HCV2a 型)是由 Lindenbaeh 等用 Ji7Hl 的 NS3-NS5B 及 5』 和 3』 非編碼區(NTRs)分別與SGR的C-NS2編碼而成；
[0035]2)體外轉錄:分別取製備好的三種線性化模板1.5ug(pFL-J6/JFH_l、PFL-H77/JFH-1、pFL-SGR/JFH-l)，依次加入 IOXReaction buffer2ul, ATP(75mM) 2ul,CTP(75mM) 2ul, GTP (75mM) 2ul，UTP (75mM) 2ul，T7Enzyme Mix2ul,以雙蒸水補齊 20ul，37°C反應4-6h。
[0036]3)電穿孔轉染Huh7.5.1細胞(肝癌細胞株):胰酶消化並收集狀態良好的Huh7.5.1細胞，離心，DEPC-PBS重懸，離心，並以2ml Opt1-MEM重懸細胞，調整細胞濃度至I X 107/ml,轉移至電擊杯中。加1Oug步驟2)所製備的轉錄產物RNA至電極杯中，Bi0.Rad電穿孔儀電轉(270V，960uF, 1ms，3次)，電擊後繼續培養72h。
[0037]4) HCVcc的收集與保存:在電穿孔轉染後7_14d，傳代細胞時，收集細胞上清，12000rpm離心10min，棄沉澱，以1.5ml滅菌EP管分裝上清，保存於_80°C。
[0038]5) HCVcc 感染:分別將上述 HCVcc 即 pFL-J6/JFH_l、pFL-H77/JFH_l 和 pFL-SGR/JFH-1不同病毒上清1OOul均勻加入Huh7.5.1細胞中，繼續培養72h後觀察HCV蛋白表達情況。
[0039]觀察結果如圖1所示，可以看到HCV蛋白質表達於細胞質中，表明所構建的HCV均得到了表達。
[0040]苦參素抑制HCVcc感染靶細胞:
[0041]1)免疫螢光測定病毒滴度:
[0042]電穿孔7-14d後，以10倍濃度梯度稀釋法加入不同HCVcc感染靶細胞，繼續培養48h後檢測HCV滴度。48h後每孔加入1OOul甲醇於_20°C固定20min，PBS洗3minX2次，3% BSA室溫封閉2h後棄上清，並加入HCV患者血清作為一抗(1: 100，3% BSA稀釋)室溫孵育2h。反應結束後，棄上清，PBS洗，5minX3次，每孔加入1OOul羊抗人IgG-FITCd =400,3% BSA稀釋)，室溫避光孵育lh, PBS洗10minx2次，染核:以100ng/ml DAPI (PBS稀釋)染液室溫避光孵育lOmin，PBS洗2次，螢光顯微鏡觀察並拍照。
[0043]2)苦參素對不同基因型HCV毒性作用(MTT):
[0044]配置苦參素濃度為2、4、8、12、16mg/ml細胞懸液，各取1OOul接種於96孔板，設陰性對照組及空白對照組。每組設3個復孔。連續培養3天後，每孔加入20ul5ug/ml MTT溶液，37°C孵育4h後，棄廢液，每孔加入150ul DMS0，490nm波長處比色，計算平均值。實驗重
復二次。
[0045]MTT檢測結果如圖2所示。結果表明，經苦參素作用後，感染J6型HCV的Huh7.5.1細胞增殖受到不同程度的抑制，且在一定的濃度和時間範圍內，顯示出明顯的時間-劑量依賴性，2mg/ml苦參素作用J624h和48h無統計學意義(P > 0.05)，隨著時間延長至72h，具有統計學意義(p〈0.05);苦參素濃度分別為4、8、12、16mg/ml作用J6連續3天後，隨著時間延長，差異均具有統計學意義(P〈0.05);選取各HCV IC50行後續試驗，濃度8mg/ml苦參素作用於感染J6的靶細胞24h後增殖抑制率是36.7%±0.24，48h後增殖抑制率是47%±0.18，72h後增殖抑制率是72.7%±0.30。濃度8mg/ml苦參素作用於感染H77的靶細胞24h後增殖抑制率是51.7%±0.07，48h後增殖抑制率是59.3%±0.14，72h後增殖抑制率是75.9%±0.13。濃度8mg/ml苦參素作用於感染SGR的靶細胞24h後增殖抑制率是26.9%±0.24，48h後增殖抑制率是52.2%±0.42，72h後增殖抑制率是66.2%±0.14。
[0046]3)螢光實時定量PCR(FQ-PCR)測定mRNA表達水平:實驗組加8mg/ml苦參素後繼續培養48h，TRIZol法提取總RNA，測定濃度後取lug RNA逆轉錄合成cDNA，體系20ul。
[0047]取逆轉錄產物行Real Time-PCR 反應，cDNA模板(F:5』CTT CAC GCA GAA AGC GTCTA3』 ；R:5』CAA GCA CCC TAT CAG GCA GT3』 )2ul,2XQuantiFast SYBR Green PCR MasterMixlOul, Forward Primer0.5ul, Reverse Primer0.5ul, RNase-Free water7ul,反應體系20ul,以GAPDH作為內參，[0048]擴增曲線:95°Clmin, (95。。10s+55°C 10s) X40cycles, 72°C 25s。熔解曲線分析:95°C 15s,60°C lmin, +10C,95°C 15s。
[0049]通過2_" "ct方法表示處理組相對於未處理組的相對倍數，其中Λ Δ Ct= (Ct目的基
因一 Ct管家基因)處理組一 (Ct目的基因一 Ct管家基因)未處理組。
[0050]結果如圖3所示，結果顯示J6型mRNA在Huh7.5.1細胞中的表達水平是
0.59±0.12，以正常對照組為基數1，計算藥物組與陰性對照組的相對值，表明苦參素可下調J6型HCV mRNA表達，與陰性對照組相比，差異具有統計學意義(t=8.909，P〈0.05)。
[0051]4)免疫螢光檢測不同濃度苦參素作用HCVcc:
[0052]據MTT結果配置不同濃度苦參素，免疫螢光法同苦參素抑制HCVcc感染靶細胞中步驟I。
[0053]結果如圖5、圖6所示。結果顯示各濃度組與陰性對照組相比，2mg/ml苦參素抑制J6型HCV無明顯變化，隨著濃度增大至4-16mg/ml時，苦參素能明顯抑制J6中HCV蛋白表達，且隨著濃度增大呈現抑制增強趨勢，該結果與MTT結果一致。
[0054]綜上，多方面實驗證實苦參素具有抑制C肝病毒複製作用，結論顯示隨著藥物濃度增大，呈劑量-時間依賴關係，差異具有統計學意義(P〈0.05)。苦參素可能是通過幹擾HCV-RNA轉錄合成的某些步驟或通過誘導細胞內核酸酶，降解HCV-RNA或其它未知機理髮揮抗HCV活性的，對於幹擾素禁忌證者或不願接受幹擾素方案抗病毒治療者，苦參素就更具有應用的價值，值得臨床應用並進一步深入研究其確切機制。
【權利要求】
1.苦參素在製備防治C型肝炎病毒感染靶細胞的藥物中的應用。
2.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為抑制C型肝炎病毒複製的藥物。
3.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為防治2a型C型肝炎病毒感染靶細胞的藥物。
4.苦參素在製備抑制C型肝炎病毒RNA複製的藥物中的應用。
5.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述的藥物為抑制2a型C型肝炎病毒RNA複製的藥物。
6.如權利要求1所述的應用，其特徵在於，所述的藥物中苦參素的含量不低於4mg/ml。
【文檔編號】A61P1/16GK103877083SQ201410107840
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】劉敏, 陳娜 申請人:西安交通大學醫學院第一附屬醫院