一株芽孢桿菌及其在製備13C標記的乙偶姻中的應用的製作方法

2023-09-17 08:42:35 2

本發明屬於生物技術領域，具體涉及一株芽孢桿菌及其在製備13c標記的乙偶姻中的應用。

背景技術：

乙偶姻即3-羥基-2-丁酮，在食品、香料、化妝品、化學合成等領域有重要的用途(xiaoandlu,2014)。國內外對乙偶姻的相關應用及基礎研究很多，但至今仍有非常多的問題需要研究解決，例如乙偶姻在某些細胞內的分解代謝與物質轉化機制、以乙偶姻為前體合成其他化合物時的一些反應機理等等，這些問題很難用一般的方法進行研究。

同位素示蹤法是利用放射性同位素或穩定性同位素作為示蹤劑對研究對象進行標記的微量分析方法。同位素示蹤所利用的放射性同位素或穩定性同位素及它們的化合物與自然界存在的相應普通元素及其化合物之間的化學性質和生物學性質是相同的，只是具有不同的核物理性質。因此，可以用同位素作為一種標記，製成含有同位素的標記化合物(如標記食物、藥物和代謝物質等)代替相應的非標記化合物。對於放射性同位素，利用它們不斷地釋放出特徵射線的核物理性質，可以用核探測器隨時追蹤它們在體內或體外的位置、數量及其轉變等；對於穩定性同位素，它們雖然不釋放射線，但可以利用它們與相應普通元素的質量之差，通過質譜儀、核磁共振儀等分析儀器來測定。20世紀70年代以來，隨著放射性同位素示蹤劑對人類健康與環境的不良影響以及氣相色譜-質譜聯用儀等分析技術的發展，穩定性同位素示蹤劑開始逐漸替代放射性同位素示蹤劑(fernández-fernándezetal.2017)。

但穩定性同位素示蹤劑往往價格昂貴，用一般的方法難以製備。目前國內外還沒有製備13c標記的乙偶姻的任何報導，更沒有商品化的產品，這種情況大大制約了乙偶姻的相關基礎研究。

參考文獻：

xiaoz,lujr(2014)strategiesforenhancingfermentativeproductionofacetoin:areview.biotechnologyadvances32:492–503.

fernández-fernándezm,rodríguez-gonzálezp,heviasánchezd,gonzález-menéndezp,sainzmenéndezrm,garcíaalonsoji(2017)accurateandsensitivedeterminationofmolarfractionsof13c-labeledintracellularmetabolitesincellculturesgrowninthepresenceofisotopically-labeledglucose.analyticachimicaacta969:35–48.

技術實現要素：

針對上述目前現狀，本發明提供一株芽孢桿菌及其在製備13c標記的乙偶姻中的應用方法。

本發明提供的芽孢桿菌bacillussp.h-18w，保藏於中國典型培養物保藏中心，地址：中國·武漢·武漢大學(湖北省武漢市武昌區八一路299號)，保藏編號為cctccm2017346，保藏日期為2017年6月16日。

本發明提供一株芽孢桿菌，並利用這株芽孢桿菌發酵製備13c標記的乙偶姻。本發明提供的芽孢桿菌bacillussp.h-18w革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，細胞形態為杆狀。通過對本發明菌株的16srdna進行測序，並將本發明菌株的16srdna序列與eztaxon資料庫中已收錄的細菌模式菌株的16srdna序列進行核苷酸序列同源性比對，發現本發明菌株的16srdna序列與已知芽孢桿菌(bacillus)屬菌株的16srdna序列的同源性大於99％。本發明菌株的16srdna序列已提交到genbank資料庫中，登錄號為mf405208。本發明菌株芽孢桿菌bacillussp.h-18w可在37–55℃溫度範圍內生長。

採用本發明提供的芽孢桿菌bacillussp.h-18w，發酵製備13c標記的乙偶姻的方法，其涉及的實施步驟如下：

第一步：活化菌株：將本發明提供的菌株芽孢桿菌bacillussp.h-18w劃線接種到luria-bertani固體培養基上，置於45℃的恆溫箱中培養8–12h，至菌落生長豐滿。

所述luria-bertani固體培養基每升中含有：10g蛋白腖，5g酵母粉，10g氯化鈉，17g瓊脂粉。調培養基ph至7.0。

第二步：製備液體種子：用接種環挑取上述步驟獲得的菌落，接種到luria-bertani液體培養基中，45℃搖床培養10h。採用體積為250ml的擋板搖瓶，裝液量為50ml；採用迴旋式搖床，轉速設定在100rpm。

所述luria-bertani液體培養基每升中含有：10g蛋白腖，5g酵母粉，10g氯化鈉。調培養基ph至7.0。

第三步：發酵生產13c標記的乙偶姻：將上述步驟獲得的液體種子按5％體積比接種到發酵培養基中，採用體積為250ml的擋板搖瓶，裝液量為50ml；採用迴旋式搖床，轉速設定在100rpm。45℃發酵培養8h時停止發酵，收集發酵液，以8000rpm離心10min，收集上清液，採用氣相色譜儀檢測目標產物的產量。

所述發酵培養基每升中含有：10g酵母粉，10g酪蛋白水解物，20g13c標記的葡萄糖。

第四步：提取13c標記的乙偶姻：將上述步驟獲得的上清液置於旋轉蒸發儀中，抽真空，在45℃條件下旋轉蒸發，收集餾分。用等體積的二氯甲烷對收集到的餾分萃取4次，將有機相合併，並於35℃抽真空旋轉蒸發開始去除二氯甲烷。當釜底剩餘物體積為旋轉蒸發開始時總體積的約2％時，終止旋轉蒸發過程。收集釜底剩餘物並置於室溫下自然揮發，繼續除去產物中殘餘的二氯甲烷，其間用氣相色譜儀檢測二氯甲烷去除進度。最後，用氣相色譜儀和氣相色譜-質譜聯用儀檢測、鑑定終產物。

利用本發明所述芽孢桿菌bacillussp.h-18w，採用上述發酵方法，45℃發酵8h可以由20g/l的13c標記的葡萄糖產生7.5g/l的13c標記的乙偶姻。經過提取，最終可得純度超過95％的13c標記的乙偶姻，乙偶姻的提取回收率超過30％。

本發明在國內外首次實現了製備13c標記的乙偶姻，極具開發應用潛力。

附圖說明

圖1是由芽孢桿菌bacillussp.h-18wcctccm2017346發酵製備提取所得的13c標記的乙偶姻產物經氣相色譜儀(配置氫火焰離子化檢測器)測得的純度表徵圖；圖2是本發明製備所得的13c標記的乙偶姻產物經氣相色譜-質譜聯用儀(配置電子轟擊離子源)測得的質譜鑑定圖；圖3是用於對照分析的普通乙偶姻經氣相色譜-質譜聯用儀(配置電子轟擊離子源)測得的質譜圖。

具體實施方式

實施例1：菌株富集篩選與分離純化

1.1環境樣品採集

從山東省青島市一處外窗臺的灰塵中採集樣品。

1.2菌株初篩

將上述樣品加入到無菌水中，快速攪拌並自然沉降10min，然後取上清液適當稀釋後塗布到luria-bertani固體培養基上，在45℃培養8–12h。挑取單菌落，經多次劃線分離純化得到純的菌株。所述luria-bertani固體培養基每升中含有：10g蛋白腖，5g酵母粉，10g氯化鈉，17g瓊脂粉。調培養基ph至7.0。

1.3菌株復篩

將上述實驗得到的純的菌株，接種到復篩培養基中，在45℃搖瓶培養24h，用氣相色譜儀檢測產物。所述復篩培養基每升中含有：10g蛋白腖，5g酵母粉，10g氯化鈉，20g葡萄糖。調培養基ph至7.0。

經過復篩，發現1株細菌乙偶姻產量較高，將此菌株命名為h-18w，即為本發明菌株。將得到的目的菌株採用斜面傳代法、低溫甘油法、低溫真空乾燥法等常規方法保存備用。

實施例2：菌株鑑定與保藏

將實施例1得到的菌株h-18w進行檢驗，其革蘭氏染色呈陽性，產芽孢，細胞形態為杆狀；45℃條件下，採用luria-bertani固體培養基培養8h，可得到直徑大小約為2–3mm、表面有褶皺的灰白色菌落。經檢驗，本發明菌株h-18w可在37–55℃範圍內生長。

通過對本發明菌株的16srdna進行測序，並將本發明菌株的16srdna序列和eztaxon資料庫中已收錄的細菌模式菌株的16srdna序列進行核苷酸序列同源性比對，發現本發明菌株的16srdna序列與已知芽孢桿菌(bacillus)屬的菌株的16srdna序列的同源性大於99％，因此將該菌株鑑定為芽孢桿菌(bacillus)屬。

本發明菌株芽孢桿菌bacillussp.h-18w已於2017年6月16日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為cctccm2017346。

實施例3：採用芽孢桿菌bacillussp.h-18w發酵製備、提取13c標記的乙偶姻的方法

3.1活化菌株

將本發明提供的菌株芽孢桿菌bacillussp.h-18w劃線接種到luria-bertani固體培養基上，置於45℃的恆溫箱中培養8–12h，至菌落生長豐滿。

所述luria-bertani固體培養基每升中含有：10g蛋白腖，5g酵母粉，10g氯化鈉，17g瓊脂粉。調培養基ph至7.0。

3.2製備液體種子

用接種環挑取上述步驟獲得的菌落，接種到luria-bertani液體培養基中，45℃搖床培養10h。採用體積為250ml的擋板搖瓶，裝液量為50ml；採用迴旋式搖床，轉速設定在100rpm。

所述luria-bertani液體培養基每升中含有：10g蛋白腖，5g酵母粉，10g氯化鈉。調培養基ph至7.0。

3.3發酵生產13c標記的乙偶姻

將上述步驟獲得的液體種子按5％體積比接種到50ml發酵培養基中，採用體積為250ml的擋板搖瓶，裝液量為50ml；採用迴旋式搖床，轉速設定在100rpm。所述發酵培養基每升中含有：10g酵母粉，10g酪蛋白水解物，20gd-葡萄糖-1-13c。45℃發酵培養8h時停止發酵，收集發酵液，以8000rpm離心10min，收集上清液，採用氣相色譜儀檢測目標產物的產量。

經檢測，利用本發明所述芽孢桿菌bacillussp.h-18w，採用上述發酵方法，45℃發酵8h可以由20g/l的d-葡萄糖-1-13c產生7.5g/l的13c標記的乙偶姻。

3.4提取13c標記的乙偶姻

將上述步驟獲得的發酵液上清液約50ml置於旋轉蒸發儀中，抽真空，在45℃條件下旋轉蒸發，收集餾分。用等體積的二氯甲烷對收集到的餾分萃取4次，將有機相合併，並於35℃抽真空旋轉蒸發開始去除二氯甲烷。當釜底剩餘物體積為旋轉蒸發開始時總體積的約2％時，終止旋轉蒸發過程。收集釜底剩餘物並置於室溫下自然揮發，繼續除去產物中殘餘的二氯甲烷，其間用氣相色譜儀檢測二氯甲烷去除進度。

最後，得到100μl終產物，用氣相色譜儀測得其純度為95.10％(附圖1)，計算得到提取回收率為33％，終產物中雜質主要為殘餘二氯甲烷，佔2.43％。經氣相色譜-質譜聯用儀對照鑑定(附圖2、3)，終產物確定為13c標記的乙偶姻，其中m/z89和90分子的豐度分別是普通乙偶姻中m/z89和90分子豐度的3.62倍和19.63倍，完全滿足一般同位素示蹤研究的需要。

本發明在國內外首次實現了製備13c標記的乙偶姻，可按實施例類似的方法擴大生產，極具開發應用潛力。