一種豬日本乙型腦炎病毒dna複製子疫苗載體的構建方法及其用途
2023-09-17 06:05:25 1
一種豬日本乙型腦炎病毒dna複製子疫苗載體的構建方法及其用途
【專利摘要】一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗的構建方法及其用途，屬於生物醫藥【技術領域】。以構建的JEV疫苗毒株SA14-14-2感染性克隆為基礎，去除病毒結構蛋白基因prM和E而保留全部非結構蛋白的複製子表達載體PAC-JEV，並在結構蛋白基因C基因下遊插入目的基因後將該重組複製子PAC-JEV-目的基因轉染BHK-21，可以用於JEV基因與蛋白功能關係及基於複製子載體的疫苗的研究。
【專利說明】一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體的構建方法及其用途
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物醫藥【技術領域】，具體為一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗的構建方法及其用途。
【背景技術】
[0002]病毒複製子指去除病毒結構蛋白基因而保留與複製相關的非結構蛋白基因的病毒亞基因組，該亞基因組具有自主複製並翻譯表達非結構蛋白及插入的目的蛋白。因此病毒複製子不僅是研究病毒基因結構與功能技術平臺，也是表達外源蛋白及研發新型複製子疫苗的新型手段。已有甲病毒、小RNA病毒、黃病毒、冠狀病毒等RNA病毒的複製子構建成功報導，其中研究最為成熟的是甲病毒複製子，已研製成功作為真核表達載體的商業化甲病毒複製子產品，同時以甲病毒複製子為基礎的新型疫苗也被證明能保護動物免受病毒感染，然而甲病毒複製子細胞毒性強很快致細胞凋亡，不能持續表達外源蛋白。黃病毒複製子卻克服了上述缺點，黃病毒複製子細胞毒性很小，能在細胞內複製數十天；黃病毒屬病毒的RNA聚合酶的保真性高而保證黃病毒屬病毒複製子作為疫苗載體時免疫原性較穩定；黃病毒屬病毒複製子的RNA小於1000Ont便於遺傳操作，因此黃病毒屬病毒複製子的研究極具科研價值。
[0003]乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)是一種重要的黃病毒科(Flaviviridae family) 黃病毒屬(Flavivirus)成員，同屬病毒還包括黃熱病毒(Yellowfever virus, YEV),蝶傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus, TBEV)和登革熱病毒(Dengue virus，DENV)等。JEV病毒粒子直徑約50nm，病毒基因組單股正鏈RNA，長約llkb，含一大的開放閱讀框編碼病毒的結構蛋白C、prM、囊膜蛋白E和7個非結構蛋白NS1、NS2A、NS2B，NS3，NS4A，NS4B，NS5。JEV 基因組 5』 端有 I 型帽子結構(m7GpppAm p )，3，無聚腺苷酸尾。基因組5』和3』末端核苷酸都可形成高度保守的二級結構，參與病毒的複製，NS3、NS5基因編碼的複製酶對病毒基因組複製和翻譯是必須的。
【發明內容】
[0004]針對現有技術中存在的上述問題，本發明的目的在於設計提供一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗的構建方法及其用途的技術方案，其構建方法簡單，獲得的疫苗性能穩定，成本低，效果顯著。
[0005]所述的一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體的構建方法，其特徵在於包括以下步驟:
I)將含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段質粒pK-JEV，以低拷貝質粒pACYC_177為骨架，引入新的酶切位點(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I)，將 CMV 啟動子插入新引入的酶切位點HindII1- EcoR I間；之後分別將JEV結構蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoR I和Kpn I酶切位點間，稱為PAC-CMV-CF2A質粒；再以pK-JEV為模板，用NS 1-F及 NS 1-R、NS I1-F 及 NS II H-R1/R2/R3 分別擴增 JEV 非結構蛋白 NS I 和 NS II +HDVRz,將NS I保存於_20°C，備用；
2)利用Xba I 和 Xho I 將 NS II 連接到 pBluescript SK2 (+)上並稱為 pBlue-NS II +HDVRz,以Nhe I和Xho I為酶切位點將polyA連接到pBlue- NS II +HDVRz，連接產物鑑定正確後經Xba I和Xho I雙酶切再連接到pAC-CMV-CF2A上，將其稱為pAC_exJEV ；
3)最後利用SalI和Xba I將NS I連接到pAC-exJEV上，將最終的複製子載體稱為pAC-JEV，即得DNA複製子疫苗。
[0006]所述的一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗的構建方法，其特徵在於以構建的JEV疫苗毒株SA14-14-2感染性克隆為基礎，去除病毒結構蛋白基因prM和E而保留全部非結構蛋白的複製子表達載體pAC-JEV。
[0007]所述的一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體的構建方法，其特徵在於在結構蛋白基因C基因下遊插入EGFP或目的基因後將該重組複製子PAC-JEV-EGFP或目的基因轉染BHK-21。
[0008]所述的一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體在JEV基因與蛋白功能關係及基於複製子載體的疫苗研究上的應用。
[0009]上述一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體的構建方法，其構建方法簡單，獲得的疫苗性能穩定，成本低，效果顯著；該複製子表達載體可以用於JEV基因與蛋白功能關係的研究，應用於基於複製子載體疫苗的研究。
[0010]本申請文件中涉及的百分含量除另有說明外，其它的均為純物質的重量百分含量。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為複製子及相關載體結構不意圖；
圖2為複製子pAC-JEV-EGFP在BHK-21細胞的表達；
圖 2 中:A.12h ； B.48h ； C.8d ；D.Negative control (BHK-21 cells transfectionwith pAC-JEV-EGFP)。
【具體實施方式】
[0012]現結合本發明的實例，進一步說明本發明的有益作用。
實施例
[0013]將含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段質粒ρΚ-JEV，以低拷貝質粒pACYC_177為骨架，引入新的酶切位點(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I ),^CMV啟動子插入新引入的酶切位點Hind II1- EcoR I間；之後分別將JEV結構蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoR I和Kpn I酶切位點間，稱為pAC_CMV_CF2A質粒；再以pK-JEV為模板，用NS 1-F及NS 1-R、NS I1-F及NS II H-R1/R2/R3分別擴增JEV非結構蛋白NS I和NS II +HDVRz，將NS I 保存於 _20°C，然後再利用 Xba I 和 Xho I 將NS II 連接到 pBluescriptSK2 (+)上並稱為pBlue- NS II +HDVRz,以Nhe I和Xho I為酶切位點將polyA連接到pBlue-NS II +HDVRz，連接產物鑑定正確後經Xba I和Xho I雙酶切再連接到pAC_CMV_CF2A上，將其稱為pAC-exJEV，最後利用Sal I和Xba I將NS I連接到pAC-exJEV上，將最終的複製子載體稱為pAC-JEV。再將獲得的pAC-JEV參照Lipofectamine2000說明書方法轉染BHK-21細胞，即得DNA複製子疫苗。
[0014]以下通過試驗進一步說明本發明的有益試驗結果。[0015]試驗一:
試驗材料:含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段質粒pK-JEV ;質粒pBluescriptSK2 (+)、pcDNA3.l、pEGFP_Nl、低拷貝質粒pACYC-177、小鼠抗JEV多抗均由浙江農林大學動物實驗室提供和製備。
[0016]1.含CMV啟動子的JEV複製子載體pAC-JEV的構建
JEV複製子載體pAC-JEV結構如圖1，以低拷貝質粒pACYC-177為骨架，引入新的酶切位點(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I )，將 CMV 啟動子插入新引入的酶切位點"i/?d II1- EcoR I間；之後分別將JEV結構蛋白C基因、FMDV 2A插入I和Kpn I酶切位點間命名該質粒為PAC-CMV-CF2A;再以pK-JEV為模板，用NS 1-F及NS 1-R、NS I1-F及NS II H-R1/R2/R3分別擴增JEV非結構蛋白NS I和NS II +HDVRz (二者包含全部的非結構蛋白基因)，先將NS I保存於_20°C備用，利用Xba I和Xho I將NS II連接到 pBluescript SK2 (+)上並命名為 pBlue- NS II +HDVRz,以 Nhe I 和 Xho I 為酶切位點將polyA連接到pBlue- NS II +HDVRz，連接產物鑑定正確後經Xba I和Xho I雙酶切再連接到pAC-CMV-CF2A上，將其命名為pAC_exJEV，最後利用Sal I和Xba I將NS I連接至IjpAC-exJEV上，將最終的複製子載體命名為pAC-JEV。
[0017]2.轉染 BHK-21 細胞
大提pAC-JEV質粒，將質粒轉染BHK-21細胞，具體方法參照LipOfectamine2000說明書。通過方陣實驗確定質粒與脂質體用量的最佳比值，之後將質粒染至24孔板單層BHK-21細胞，以pACYC-177空質粒為陰性對照。
[0018]3.含EGFP報告基因複製子的構建
以 pEGFP-Nl 為模板，設計合成兩條引物 EGFP-F/R(F:5』 GTAGGTACCGTGAGCAAGGG3』 ; R:5』 TATGTCGACCTTGTACAGCTCGT3』)，PCR 擴增獲得 EGFP 基因，利用 Kpn I 和 Sal I 雙酶切與pAC-JEV相連接並命名為pAC-JEV-EGFP,測序驗證後，Lipofectamine2000轉染BHK-21，同時以空載體pACYC-177為陰性對照，並在轉染後12h開始，每隔24h再螢光顯微鏡下觀察螢光變化。
[0019]實驗結果:
1.含CMV啟動子的JEV複製子載體pAC-JEV的構建
將CMV啟動子、HDVRz、PolyA終止子等元件引入質粒pACYC-177中，在本實驗室構建的JEV感染性克隆的基礎上，去除JEV結構蛋白prM和E，構建了保留全部非結構蛋白的JEV複製子載體PAC-JEV (見圖1)。為方便後續試驗的對照，再通過PCR方法缺失掉NS5羧基端部分基因序列而構建的質粒pAC-JEV-Λ NS5 (見圖1)。
[0020]2.含報告基因EGFP複製子的構建
將報告基因EGFP插入到複製子載體pAC-JEV構建成複製子pAC-JEV-EGFP，鑑定正確後，Lipofectamine2000轉染BHK-21後，每隔12h螢光顯微鏡下觀察。結果顯示:12h即出現螢光，螢光可持續8d左右，期間發現部分陽性細胞變圓死亡現象。
【權利要求】
1.一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體的構建方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)將含有JEV疫苗株SA14-14-2的基因片段質粒pK-JEV，以低拷貝質粒pACYC_177為骨架，引入新的酶切位點(Hind II1- EcoR 1- Kpn 1-Sal 1-Xba 1- Xho I)，將 CMV 啟動子插入新引入的酶切位點HindII1- EcoR I間；之後分別將JEV結構蛋白C基因、FMDV 2A插入EcoR I和Kpn I酶切位點間，稱為PAC-CMV-CF2A質粒；再以pK-JEV為模板，用NS 1-F及 NS 1-R,NS I1-F 及 NS II H-R1/R2/R3 分別擴增 JEV 非結構蛋白 NS I 和 NS II +HDVRz，將NS I保存於_20°C，備用；
2)利用Xba I 和 Xho I 將 NS II 連接到 pBluescript SK2 (+)上並稱為 pBlue-NS II +HDVRz,以Nhe I和Xho I為酶切位點將polyA連接到pBlue- NS II +HDVRz，連接產物鑑定正確後經Xba I和Xho I雙酶切再連接到pAC-CMV-CF2A上，將其稱為pAC_exJEV ； 3)最後利用SalI和Xba I將NS I連接到pAC-exJEV上，將最終的複製子載體稱為pAC-JEV，即得DNA複製子疫苗。
2.如權利要求1所述的一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗的構建方法，其特徵在於以構建的JEV疫苗毒株SA14-14-2感染性克隆為基礎，去除病毒結構蛋白基因prM和E而保留全部非結構蛋白的複製子表達載體pAC-JEV。
3.如權利要求1所述的一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體的構建方法，其特徵在於在結構蛋白基因C基因下遊插入EGFP或目的基因後將該重組複製子PAC-JEV-EGFP或目的基因轉染BHK-21。
4.如權利要求1所述的一種豬日本乙型腦炎病毒DNA複製子疫苗載體在JEV基因與蛋白功能關係及基於複製子載體的疫苗研究上的應用。
【文檔編號】A61K39/12GK103540604SQ201310502189
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月23日 優先權日:2013年10月23日
【發明者】王曉杜, 周圻, 馬志永 申請人:浙江農林大學